羅梅娟 張又祥 歐巧群 王麗娜

廣州市第一人民醫(yī)院 華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科，廣州 510180

腸道微生物主要由細(xì)菌、病毒、真菌和原蟲等生物構(gòu)成，各種微生物間的相互作用和穩(wěn)態(tài)對(duì)人體健康十分重要，其中細(xì)菌和病毒是腸道微生態(tài)系統(tǒng)中含量最為豐富的兩種物種［1］。噬菌體又是腸道病毒中的主要成員并且對(duì)腸道菌群有重要調(diào)節(jié)作用。近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，全球細(xì)菌耐藥性明顯增加，以腸道微生態(tài)為核心的治療手段更是引起了廣泛關(guān)注，明確腸道噬菌體構(gòu)成、發(fā)現(xiàn)其功能，既是微生態(tài)學(xué)研究的關(guān)鍵點(diǎn)，也是人類健康的新切入點(diǎn)。

腸道噬菌體概述

人類消化道中的細(xì)菌總量超過1014個(gè)，種類1 000～1 150種，在食物分解吸收、抵御外界病原微生物等方面發(fā)揮重要作用。健康人的腸道菌群主要由七大菌門組成：厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、疣微菌門、梭菌門和螺旋體門，其中前四種菌門的數(shù)量占腸道菌群總數(shù)的90%以上［2］。噬菌體是腸道病毒組的主要成分，在每毫升糞便濾液中含有高達(dá)108億個(gè)病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）［3-4］，根據(jù)其裂解能力強(qiáng)弱分為裂解性噬菌體（毒性噬菌體）和溶原性噬菌體（溫和噬菌體），根據(jù)形態(tài)的差異分為有尾噬菌體、無尾噬菌體和絲狀噬菌體，進(jìn)一步分為長(zhǎng)尾噬菌體科、肌尾噬菌體科和短尾噬菌體科等類別。在人體腸道中溶原性噬菌體占主要成分，目前研究認(rèn)為，在世界范圍分布最廣的腸道噬菌體是crAss樣噬菌體［5］，以不同地區(qū)的健康人群作為研究對(duì)象鑒定出了核心噬菌體（在＞50%個(gè)體中共有的噬菌體）23個(gè)和常見噬菌體（在20%～50%個(gè)體中共有的噬菌體）132個(gè)［6-7］，利用腸道噬菌體組研究可以發(fā)現(xiàn)噬菌體和人類健康的關(guān)系并探索其在疾病診療中的作用［8］。

噬菌體影響機(jī)體健康的主要作用機(jī)制

1.噬菌體調(diào)節(jié)腸道菌群構(gòu)成

（1）捕食。噬菌體能通過識(shí)別細(xì)菌表面的特定膜受體，選擇目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行“捕食”。腸道噬菌體通過“捕食”作用殺死腸道細(xì)菌后會(huì)在細(xì)菌的基因組上留下特異的CRISPR間隔區(qū)序列［9］，通過對(duì)這些序列的鑒定發(fā)現(xiàn)，人類和動(dòng)物體內(nèi)天然噬菌體導(dǎo)致的細(xì)菌死亡普遍存在，并在腸道菌群穩(wěn)定中有重要作用。這種“捕食”多數(shù)是特異的，比如普拉梭菌噬菌體可以選擇性感染普拉梭菌，并對(duì)其他腸道細(xì)菌“視而不見”［10］，但對(duì)CRISPR間隔區(qū)序列的宏基因組學(xué)分析也表明，少部分腸道噬菌體在人體腸道中具有廣泛的細(xì)菌宿主［11］。（2）溶原性轉(zhuǎn)換。溫和噬菌體通過改善宿主細(xì)菌的狀態(tài)來彌補(bǔ)自身對(duì)宿主細(xì)菌的不利影響，從而增強(qiáng)了適應(yīng)性，并賦予宿主新的表型，這種現(xiàn)象被稱為“溶原性轉(zhuǎn)換”。溫和噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)菌后進(jìn)行基因整合，進(jìn)而避免被巨噬細(xì)胞識(shí)別、清除，并在宿主細(xì)菌內(nèi)長(zhǎng)期共存［12］。Taylor等［13］和Wahl等［14］發(fā)現(xiàn)溶原性轉(zhuǎn)換可以增加宿主細(xì)菌對(duì)其他噬菌體的抗性、黏附定植能力、環(huán)境的耐受性和抗生素耐藥能力。噬菌體的溶原性轉(zhuǎn)換不僅為噬菌體提高了腸道的適應(yīng)性，也協(xié)同宿主細(xì)菌提升進(jìn)化優(yōu)勢(shì)。（3）上皮防御。噬菌體可以減少腸道黏液層表面的致病菌定植，并且吞噬、裂解致病菌［15-16］。Barr等［17］的研究發(fā)現(xiàn)，在人類腸道中，部分噬菌體會(huì)黏附于黏膜上并且減少噬菌體自身的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，與上皮組織形成類似防御屏障的結(jié)構(gòu)。通過上述幾種重要的作用機(jī)制，噬菌體能減少外來致病菌的侵襲，增加益生菌的定植能力，調(diào)整腸道菌群的結(jié)構(gòu)、維持腸道菌群的平衡，從而增強(qiáng)腸道的屏障功能。

2.腸道噬菌體介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)

部分噬菌體能夠激活腸道免疫通路，Gogokhia等［18］發(fā)現(xiàn)噬菌體可以通過Toll樣受體9依賴的干擾素信號(hào)通路激活腸道免疫，促進(jìn)派氏結(jié)CD4+和CD8+ T細(xì)胞的增殖。有研究也發(fā)現(xiàn)，大腸埃希氏菌噬菌體可以發(fā)揮免疫抑制作用，抑制腸道免疫細(xì)胞擴(kuò)增，大腸埃希氏菌噬菌體表達(dá)的黏附蛋白能夠與脂多糖結(jié)合，進(jìn)而控制脂多糖介導(dǎo)的炎性反應(yīng)［19］。

腸道噬菌體與疾病的關(guān)系及臨床應(yīng)用

許多研究表明，健康人群和患者（尤其慢性病患者）的腸道噬菌體組的多樣性和結(jié)構(gòu)存在顯著差異［20-22］。因此，深入分析腸道噬菌體組可以為揭示各種疾病的病理機(jī)制提供新思路，并有利于發(fā)現(xiàn)新的診療標(biāo)志物。腸道噬菌體在炎癥性腸病、糖尿病、酒精性肝病、結(jié)直腸癌、帕金森病等疾病的發(fā)生發(fā)展中體現(xiàn)重要影響，而噬菌體療法也在急慢性病原菌感染（如細(xì)菌性痢疾、霍亂、難治性艱難梭菌感染、泌尿系感染、燒傷、傷口感染、敗血癥等）中發(fā)揮療效。

1.炎癥性腸病

炎癥性腸病是由遺傳、免疫、微生物和環(huán)境等多因素相互作用引發(fā)的慢性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，長(zhǎng)期反復(fù)的消化系統(tǒng)癥狀和其他系統(tǒng)功能紊亂給患者帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。研究證實(shí)，炎癥性腸病患者與其家庭中的健康成員的腸道病毒多樣性和結(jié)構(gòu)存在顯著差異，并且與炎癥性腸病的進(jìn)展程度相關(guān)［6，23］。普拉梭菌在炎癥性腸病患者腸道內(nèi)相對(duì)豐度減少是炎癥性腸病的重要菌群特征，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，噬菌體的豐度與普拉梭菌的豐度有關(guān)并推測(cè)炎癥性腸病患者腸內(nèi)普拉梭菌的死亡率增加系普拉梭菌噬菌體所介導(dǎo)［10］。Zuo等［24］通過宏基因組分析國(guó)內(nèi)潰瘍性結(jié)腸炎患者的樣本發(fā)現(xiàn)，腸道有尾噬菌體顯著增加，并伴隨著大腸埃希氏菌噬菌體和腸桿菌噬菌體豐度顯著增加。Yang等［25］的研究認(rèn)為，健康人群腸道的噬菌體可以通過產(chǎn)生Toll樣受體3和Toll樣受體7介導(dǎo)的干擾素β，從而抑制腸道炎癥發(fā)生。Van belleghem等［26］也觀察到噬菌體可直接與先天免疫細(xì)胞相互作用，在體外孵育外周血單核細(xì)胞時(shí)，金黃色葡萄球菌噬菌體或銅綠假單胞菌噬菌體可誘導(dǎo)單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，并顯著提高白細(xì)胞介素1β、白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子α的轉(zhuǎn)錄。

2.結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌是發(fā)病率和病死率極高的惡性腫瘤之一，早期無明顯癥狀，多數(shù)患者確診時(shí)已為中晚期，多項(xiàng)研究報(bào)道了結(jié)腸癌患者的病毒組紊亂與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)［27-28］。與健康人群相比，結(jié)直腸癌患者腸道噬菌體群落的多樣性顯著增加，并且發(fā)現(xiàn)腸道病毒組的失調(diào)與結(jié)直腸癌的進(jìn)程有關(guān)，有20種以上的病毒屬在結(jié)直腸癌患者和健康人群之間有顯著差異［29］。Hannigan等［30］在結(jié)直腸癌患者糞便樣本中鑒定出組成發(fā)生顯著改變的病毒，主要是來自長(zhǎng)尾噬菌體科和肌尾噬菌體科的噬菌體。Zheng等［31］發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者糞便中具核梭桿菌增多，而丁酸梭菌等產(chǎn)丁酸菌減少，具核梭桿菌富集于腫瘤處并且能經(jīng)Toll樣受體4-髓樣分化因子88通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬來抵抗化療，而丁酸梭菌分泌的丁酸可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞，進(jìn)一步從唾液中分離出具核梭桿菌噬菌體，與裝載了結(jié)直腸癌化療藥物的納米顆粒相連，利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種藥物在APCmin/+小鼠的結(jié)直腸腫瘤處富集，顯著延長(zhǎng)結(jié)直腸癌小鼠生存期和減少腸道腺瘤發(fā)生，并減少具核梭桿菌的豐度，增加丁酸梭菌和結(jié)腸丁酸水平。

3.糖尿病

糖尿病是一組以慢性高血糖為主要特征的臨床綜合征。糖尿病具有并發(fā)癥多、病情遷延不愈、起病慢以及病程長(zhǎng)等特點(diǎn)，會(huì)引起腎臟、神經(jīng)、血管等器官的并發(fā)癥，影響患者的生活質(zhì)量的同時(shí)也成為嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題。Ma等［32］發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者的腸道噬菌體數(shù)量顯著高于健康人群，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了7種噬菌體與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。并且2型糖尿病患者腸道噬菌體的改變與宿主細(xì)菌的相對(duì)豐度和多樣性的變化相關(guān)。Zhao等［33］對(duì)1型糖尿病高危兒童和健康兒童的腸道菌群和病毒基因組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)1型糖尿病高危兒童的病毒組在疾病發(fā)生前發(fā)生了改變，兩組之間的差異隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，其中噬菌體基因組序列與1型糖尿病密切相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)1型糖尿病患者的血清學(xué)指標(biāo)發(fā)生改變前，腸道噬菌體的多樣性和相對(duì)豐度已經(jīng)顯著降低，而腸道菌群則無顯著變化，提示1型糖尿病患者自身免疫性疾病發(fā)展過程中腸道菌群的變化可能是由于噬菌體變化引起的［33］。

4.酒精性肝炎

酒精性肝炎是一種與大量攝入酒精相關(guān)的疾病，有研究發(fā)現(xiàn)，腸道細(xì)菌糞腸球菌或許參與了酒精性肝炎的發(fā)生［34］。Duan等［35］對(duì)酒精性肝炎患者和健康人群的糞便樣本進(jìn)行分析，酒精性肝炎患者糞便樣本中糞腸球菌的水平是健康人的300倍，其中大約有80%的酒精性肝炎患者的糞便樣本中都發(fā)現(xiàn)了糞腸球菌的相對(duì)豐度顯著增加，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)大約30%的糞腸球菌都存在一種能編碼細(xì)胞溶素的基因。利用高酒精飲食建立酒精性肝炎小鼠模型，通過糞菌移植含有細(xì)胞溶素的糞便樣本后，這些酒精性肝炎小鼠表現(xiàn)出了一定的肝細(xì)胞損傷甚至死亡的現(xiàn)象，而移植了缺失細(xì)胞溶素的酒精性肝炎小鼠則并未表現(xiàn)出肝臟損傷的表現(xiàn)，糞腸球菌的噬菌體可以通過靶向減少含有細(xì)胞溶素的糞腸球菌，減輕酒精性肝炎小鼠的肝臟損傷程度，從而起保護(hù)作用。

5.帕金森病

帕金森病是一種常見的老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，與遺傳、環(huán)境、神經(jīng)系統(tǒng)老化等因素相關(guān)。Tetz等［36］分析了32例帕金森病患者和28例健康人的糞便樣本。通過對(duì)細(xì)菌和噬菌體群落組成的比較分析發(fā)現(xiàn)，帕金森病患者組中乳桿菌、鏈球菌和乳球菌顯著減少。在健康人中，毒性和溫和乳球菌噬菌體的數(shù)量大致相同，而在帕金森病患者中，毒性噬菌體占主導(dǎo)地位，其中發(fā)現(xiàn)的lytic c2樣乳球菌噬菌體和936樣乳球菌噬菌體的增加可能對(duì)腸道乳球菌具有清除作用，而乳球菌在多巴胺的產(chǎn)生中有重要調(diào)節(jié)作用。因此，噬菌體介導(dǎo)的乳球菌減少可能加速帕金森病的發(fā)展。

6.精神分裂癥

精神分裂癥是一種機(jī)制復(fù)雜的精神障礙，近年來隨著腦-腸軸研究的深入，越來越多的精神心理疾病發(fā)現(xiàn)與腸道微生態(tài)相關(guān)。Yolken等［37］納入41例精神分裂癥患者及33例健康人，用咽拭子采集DNA樣本并進(jìn)行宏基因組分析。研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者中乳桿菌噬菌體phiadh顯著增加。納入研究的41例精神分裂癥患者中，有17例患者的測(cè)序結(jié)果與乳桿菌噬菌體phiadh有一處或者多處匹配，而健康對(duì)照組中只有1例陽性匹配。進(jìn)一步分析患者的藥物使用情況發(fā)現(xiàn)，乳桿菌噬菌體phiadh的豐度還與服用丙戊酸鈉呈負(fù)相關(guān)，17例未使用丙戊酸鈉的患者，乳桿菌噬菌體phiadh檢測(cè)呈陽性。

7.臨床應(yīng)用

隨著耐藥菌的出現(xiàn)，難治性感染性疾病發(fā)病率不斷增加，利用裂解性噬菌體和純化的噬菌體裂解蛋白靶向消滅耐藥致病菌從而對(duì)抗耐藥菌感染的治療手段，再次被重新認(rèn)識(shí)。20世紀(jì)初，噬菌體制劑先后在細(xì)菌性痢疾、霍亂等治療中獲得成功［38］。1987至1999年間波蘭的一所研究所利用噬菌體療法為1 307例多重耐藥菌感染的患者提供治療，85.9%的患者好轉(zhuǎn)或者傷口愈合［39-40］。難治性艱難梭菌感染作為常見的臨床難治性感染性疾病，通過提取健康人糞便中的噬菌體制備糞便濾液作為干預(yù)，可以有效治療該?。?1］。Dedrick等［42］報(bào)道了1例患有難治性銅綠假單胞菌和膿腫分枝桿菌感染的囊性纖維化患者，通過3種基因改造噬菌體的混合物的6個(gè)月治療后臨床癥狀顯著改善。噬菌體療法也在抗生素耐藥相關(guān)的泌尿系感染的案例中表現(xiàn)出積極的作用［43-45］，Bao等［45］報(bào)道1例63歲女性患者，因廣泛耐藥肺炎克雷伯桿菌感染繼發(fā)的復(fù)發(fā)性尿路感染，通過兩輪噬菌體雞尾酒療法聯(lián)合磺胺甲惡唑甲氧芐啶治療成功治愈。另外一項(xiàng)關(guān)于經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)后繼發(fā)的復(fù)發(fā)性尿路感染的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體療法可以完全清除尿道細(xì)菌，極大減少?gòu)?fù)發(fā)可能［46］。Ooi等［47］進(jìn)行了一項(xiàng)1b期臨床研究，用AB-SAO1（3種天然金黃色葡萄球菌噬菌體的混合物）對(duì)9例慢性鼻竇炎患者進(jìn)行鼻內(nèi)沖洗治療，結(jié)果顯示鼻內(nèi)噬菌體療法安全、耐受性良好，并且對(duì)金黃色葡萄球菌引起的慢性鼻竇炎療效顯著。關(guān)于噬菌體裂解蛋白的研究表明［48-49］，噬菌體裂解酶ClyR能選擇性殺滅能導(dǎo)致齲齒的細(xì)菌和導(dǎo)致根尖周牙髓感染的糞腸球菌，而對(duì)常見的口腔共生菌無害，并通過大鼠齲齒模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)能顯著降低齲齒程度并具有潛在的治療牙周病作用。此外，噬菌體療法也在敗血癥、術(shù)后感染、中耳炎和燒傷中具有治療作用［50］。

噬菌體療法的優(yōu)勢(shì)與局限

噬菌體療法的優(yōu)勢(shì)：（1）特異性高。一般的抗菌藥物相對(duì)廣譜，清除目標(biāo)致病菌的同時(shí)也引起了其他共生菌群的破壞，長(zhǎng)期使用抗菌藥物不僅容易引起菌群紊亂，甚至可能導(dǎo)致機(jī)會(huì)感染，噬菌體能夠特異性感染宿主細(xì)菌，不影響其他共生菌群。（2）細(xì)菌抗性低。研究認(rèn)為抗菌藥物導(dǎo)致的耐藥發(fā)生率為10萬分之一，而細(xì)菌對(duì)噬菌體發(fā)生耐藥的發(fā)生率為1 000萬分之一，且噬菌體可以與細(xì)菌“共同進(jìn)化”從而減少耐藥的發(fā)生［51］。（3）溶菌能力強(qiáng)。噬菌體可以通過分泌水解酶和多糖解聚酶等酶類破壞細(xì)菌的生物膜結(jié)構(gòu)，而抗菌藥物對(duì)細(xì)菌生物膜的作用有限［52］。（4）增殖周期短。噬菌體作為天然的抗菌物質(zhì)，能夠自我復(fù)制且增殖周期短，研發(fā)周期比一般抗菌藥物更短。

噬菌體療法的局限：（1）抗菌譜窄。由于噬菌體對(duì)宿主細(xì)菌特異性識(shí)別，在多重感染的治療中其療效會(huì)顯著降低，因此，通常需要使用包含多種噬菌體的“雞尾酒療法”，這也造成了生產(chǎn)成本的增加［53］。（2）細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)的抵御。細(xì)菌的CRISPR系統(tǒng)可以裂解噬菌體和DNA從而抵御噬菌體，目前還沒有有效的方法避免該抵御系統(tǒng)［54］。（3）潛在風(fēng)險(xiǎn)。盡管噬菌體療法的安全性被許多研究證實(shí)，但仍存在毒性或抗性基因轉(zhuǎn)移到受感染細(xì)菌中的潛在可能，從而導(dǎo)致高致病性菌株出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)［55］。

總 結(jié)

日益嚴(yán)重的抗生素耐藥問題使得噬菌體重回臨床醫(yī)生和研究人員的視野，近年來關(guān)于噬菌體療法的研究也日漸增多。噬菌體所具備的宿主特異性高、抗性低等優(yōu)點(diǎn)無疑為解決細(xì)菌耐藥的困局提供了重要的突破方向，但噬菌體也存在潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)、抗菌譜窄等局限，而目前的研究尚集中在臨床個(gè)案和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在這些研究中，噬菌體療法盡管體現(xiàn)了良好的有效性和安全性，但在正式投入臨床應(yīng)用前還需要克服許多難題。相信隨著噬菌體作用機(jī)制的不斷被闡明，噬菌體療法將不斷被完善和應(yīng)用。