高帆，卞蓮蓮，毛群穎，梁爭(zhēng)論，吳星

中國(guó)食品藥品檢定研究院國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102629

戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）是一類無包膜的RNA 病毒［1］，為引起戊型肝炎的病原體［1-2］。與人類相關(guān)的HEV有4個(gè)基因型，均屬于同一血清型［3］。其中基因1和2型僅感染人類，基因3和4型為人畜共患病原［3-4］。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）數(shù)據(jù)顯示［4］，在世界范圍內(nèi)每年至少有2 000萬人感染HEV，其中約330 萬人會(huì)出現(xiàn)戊肝癥狀，2015年戊型肝炎導(dǎo)致約4.4萬人死亡，占病毒性肝炎死亡率的3.3%。有報(bào)道顯示，自2014 年以來，南蘇丹一直報(bào)告HEV 暴發(fā)，2020—2021 年共報(bào)告1 420 例疑似病例［5］。我國(guó)80年代在新疆地區(qū)暴發(fā)了戊型肝炎，導(dǎo)致12余萬人發(fā)病，隨后一直以散發(fā)為主［6］。

疫苗是控制疫情傳播的有效手段［7-8］。我國(guó)廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司（簡(jiǎn)稱廈門萬泰）研制的大腸埃希菌表達(dá)的重組戊型肝炎疫苗（簡(jiǎn)稱戊肝疫苗）的Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，48 693 名受試者接種3針疫苗的保護(hù)率達(dá)100%［9］，隨訪結(jié)果顯示，接種疫苗5 年后預(yù)防戊型肝炎的保護(hù)效果仍維持較高水平（86.8%）［10］。最終于2012 年在中國(guó)獲批上市［11］。另外，長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司研制的戊肝疫苗也已完成Ⅱ期臨床試驗(yàn)；國(guó)藥中生生物技術(shù)研究院有限公司（簡(jiǎn)稱中生）、蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司（簡(jiǎn)稱蘭州所）和智飛北京綠竹生物制藥有限公司也在積極研制戊肝疫苗［12-14］。國(guó)外葛蘭素史克公司以昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的戊肝疫苗已完成Ⅱ期臨床［12-14］。

疫苗效力是疫苗質(zhì)量控制的主要指標(biāo)［15］。WHO戊肝疫苗指導(dǎo)原則要求［11］，應(yīng)研制并應(yīng)用戊肝疫苗效力參考品對(duì)戊肝疫苗效力進(jìn)行質(zhì)量控制，但目前尚無WHO 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品可以使用。本研究依據(jù)WHO要求，由中國(guó)食品藥品檢定研究院（簡(jiǎn)稱中檢院）牽頭，聯(lián)合戊肝疫苗生產(chǎn)和研發(fā)企業(yè)研制戊肝疫苗效力國(guó)家參考品，以保證我國(guó)已上市戊肝疫苗效力一致性，并為在研階段的戊肝疫苗提供可靠、可比、統(tǒng)一的效力標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1候選參考品 候選參考品原料由廈門萬泰提供，依據(jù)《中國(guó)藥典》三部（2020 版）和《戊型肝炎疫苗制造及檢定規(guī)程》（YBS01402011）制備，為以大腸埃希菌為表達(dá)系統(tǒng)獲得的HEV ORF2 p239（368~606 aa）原液（批號(hào)：20150801F4）加入鋁佐劑制備而成的戊肝疫苗半成品（批號(hào)：20151127）。原液和半成品經(jīng)檢定均符合規(guī)定。加入凍干保護(hù)劑后，由北京天壇生物制品股份有限公司進(jìn)行分裝及凍干，制備成候選國(guó)家參考品，水分為1.7%。

1.2疫苗 2批戊肝疫苗分別由廈門萬泰（表達(dá)系統(tǒng)為大腸埃希菌，ORF2 區(qū)段為368 ~ 606 aa，HEV 1型［12］）和蘭州所（表達(dá)系統(tǒng)為大腸埃希菌，ORF2區(qū)段為368~617 aa，HEV 1型［12］）制備。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB／c 小鼠，雌性，6~8 周齡，購(gòu)自中檢院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，合格證號(hào)：11400500014037。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的對(duì)BALB／c小鼠進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照中檢院動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行［中檢動(dòng)（福）2016（B）008號(hào)］。

1.4主要試劑及儀器 5%乳糖、1.25%山梨醇、10%蔗糖、2%明膠、5%海藻糖和2%右旋糖苷均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；戊型肝炎抗原檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）購(gòu)自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司；戊肝疫苗效力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廈門萬泰；電感耦合等離子體光譜（型號(hào)：Thermo iCAP 7400 Duo）購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.5凍干保護(hù)劑的選擇 候選參考品原料中分別添加不同的凍干保護(hù)劑，配方共4種：5%乳糖+1.25%山梨醇、10%蔗糖、10%蔗糖+2%明膠、5%海藻糖+2%右旋糖苷。用抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同凍干保護(hù)劑制備的樣品凍干前、后抗原含量。以凍干前的候選參考品原料抗原含量為基點(diǎn)，按下式計(jì)算各配方凍干前、后的抗原含量保留率。選取抗原保護(hù)性及賦形效果好的配方作為戊肝疫苗的凍干保護(hù)劑。

1.6均勻性檢測(cè) 在分裝的前、中、后3個(gè)階段，共取28 瓶候選參考品進(jìn)行裝量均勻性檢測(cè)；取25 瓶候選參考品，按標(biāo)準(zhǔn)操作程序（standard operating procedure，SOP）解離后，采用戊型肝炎抗原檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）進(jìn)行抗原均勻性檢測(cè)；取25 瓶候選參考品，采用原子光譜吸收法（電感耦合等離子體光譜）進(jìn)行鋁含量均勻性檢測(cè)。

1.7穩(wěn)定性檢測(cè)

1.7.1加速穩(wěn)定性 隨機(jī)抽取候選參考品9瓶，每瓶間隔1 周放入37 ℃孵箱（孵育時(shí)長(zhǎng)分別為0~8 周），8 周后檢測(cè)半數(shù)有效量（median effective dose，ED50）：將候選參考品用0.5 mL 滅菌注射用水復(fù)溶后，使用鋁佐劑適當(dāng)稀釋，選取1.6、0.4、0.1、0.025 μg 共4個(gè)劑量經(jīng)腹腔接種BALB／c 小鼠，10 只／組，并設(shè)鋁佐劑對(duì)照組。初次免疫后28 d 摘眼球采血，2 ~8 ℃，3 000×g離心10 min，分離血清，采用戊肝疫苗效力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體水平，按試劑盒SOP 操作。酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)A450／630。Cutoff 值：陰性對(duì)照A均值< 0.05 時(shí)，按0.05 計(jì)算；陰性對(duì)照A均值≥0.05時(shí)，以實(shí)際數(shù)值計(jì)算。

1.7.2復(fù)溶穩(wěn)定性 隨機(jī)抽取21 瓶候選參考品，分為7 組，3 瓶／組。使用0.5 mL 無菌注射用水復(fù)溶后置于2~8 ℃，分別放置1~7 d 后同時(shí)進(jìn)行抗原含量檢測(cè)，并以抗原含量基點(diǎn)值為標(biāo)準(zhǔn)，按下式計(jì)算抗原含量保留率。

抗原含量保留率（%）=各時(shí)間點(diǎn)抗原含量平均值／抗原含量基點(diǎn)值×100%

1.8協(xié)作標(biāo)定 依據(jù)WHO 指導(dǎo)原則［11，16］以及《中國(guó)藥典》三部（2020版）的相關(guān)要求，由中檢院肝炎室牽頭，聯(lián)合廈門萬泰、中生和蘭州所進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，4個(gè)協(xié)作實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)編號(hào)為lab1 ~ 4。中檢院負(fù)責(zé)分發(fā)候選參考品和戊肝疫苗效力檢測(cè)試劑盒，4個(gè)協(xié)作實(shí)驗(yàn)室按統(tǒng)一SOP 對(duì)候選參考品進(jìn)行3 ~ 6 次獨(dú)立試驗(yàn)。另外，2 家協(xié)作實(shí)驗(yàn)室（lab2 和lab4）各檢測(cè)自制的1批戊肝疫苗。

1.10數(shù)據(jù)采集與分析全部檢測(cè)原始數(shù)據(jù)匯總至中檢院，由中檢院按Reed-Munch 法計(jì)算ED50。候選參考品ED50檢測(cè)結(jié)果小于1.0μg時(shí)為有效數(shù)據(jù)。采用Microsoft Office Excel 軟件計(jì)算平均值、變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）和95%置信區(qū)間等。

2 結(jié)果

2.1凍干保護(hù)劑的選擇 試驗(yàn)結(jié)果顯示，明膠會(huì)干擾HEV 抗原含量的檢測(cè)，使抗原含量上升至216%；5%乳糖+ 1.25%山梨醇和10%蔗糖凍干后抗原含量下降較多，分別為候選標(biāo)準(zhǔn)品凍干前的55%（CV=2.9%）和83%（CV= 12.9%）；5%海藻糖+ 2%右旋糖酐抗原含量保留率最高（93%），且具有良好的賦型效果。見表1。最終確定5%海藻糖+2%右旋糖酐為凍干保護(hù)劑配方。

表1 不同配方凍干保護(hù)劑檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Results of lyoprotectant in different formulations

2.2候選參考品檢定及關(guān)鍵參數(shù)檢測(cè) 分裝前、中、后3 個(gè)階段的28 瓶候選參考品的裝量平均值為0.531 g／瓶，分裝精度為0.7%；25 瓶候選參考品的抗原平均值為7 618 YU／mL，CV為9.0%，該結(jié)果也為抗原含量基點(diǎn)值，用于后續(xù)復(fù)溶穩(wěn)定性研究；25瓶候選參考品的鋁含量平均值為5.67 mg／mL，CV為4.0%。

2.3候選參考品的穩(wěn)定性

2.3.1加速穩(wěn)定性 候選參考品于37 ℃條件下放置0 周的ED50為0.45μg，放置1~8 周的ED50為0.29~0.81μg，各時(shí)間點(diǎn)ED50均小于1.0μg，見圖1。表明候選參考品具有較好的加速穩(wěn)定性。

圖1 候選參考品加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Result of accelerated stability test of candidate reference material

2.3.2復(fù)溶穩(wěn)定性 候選參考品復(fù)溶后于2~8 ℃保存1~7 d，各時(shí)間點(diǎn)抗原含量保留率為91%~104%，見表2。提示候選參考品具有較好的復(fù)溶穩(wěn)定性，可滿足實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)操作時(shí)的短期貯存要求。

表2 復(fù)溶后2~8 ℃的穩(wěn)定性結(jié)果（%，n=3）Tab.2 Stability after reconstitution and storage at 2 ~ 8 ℃（%，n=3）

2.4協(xié)作標(biāo)定 共獲得18個(gè)有效數(shù)據(jù)。候選標(biāo)準(zhǔn)品ED50均值為0.15μg（95%置信區(qū)間為0.12~0.18μg），實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV為30.8%~64.2%，實(shí)驗(yàn)室間CV為32.6%，見表3。

表3 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果Tab.3 Results of collaborative calibration

2.5適用性 2 家實(shí)驗(yàn)室自行研制的戊肝疫苗與候選參考品平行檢驗(yàn)均表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，陽轉(zhuǎn)率均隨疫苗抗原含量減少而降低，下降曲線形態(tài)相近，見圖2。

圖2 兩種戊肝疫苗與候選參考品的ED50適用性結(jié)果Fig.2 ED50 of two hepatitis E vaccines and candidate reference material in verification for suitability

3 討論

上市后批簽發(fā)疫苗與Ⅲ期臨床試驗(yàn)用疫苗的效力一致性，是疫苗安全、有效的基礎(chǔ)。有研究對(duì)廈門萬泰生產(chǎn)的基因戊型肝炎疫苗（大腸埃希菌）ED50比較發(fā)現(xiàn)［17］，Ⅲ期臨床試驗(yàn)用5 批疫苗與2012—2016年16 批批簽發(fā)疫苗的體內(nèi)效力具有較好的一致性，提示上市后批簽發(fā)疫苗可達(dá)到臨床試驗(yàn)用疫苗所驗(yàn)證的保護(hù)效果。5 年間該疫苗的關(guān)鍵質(zhì)控參數(shù)趨勢(shì)分析結(jié)果顯示［17］，16 批疫苗均未發(fā)現(xiàn)超趨勢(shì)（out of trend，OOT）情況，表明疫苗批間質(zhì)量一致性較好，生產(chǎn)工藝及質(zhì)量穩(wěn)定。因此，本研究選擇廈門萬泰制備的1批戊肝疫苗為候選參考品原料制備國(guó)家參考品。

研究顯示，戊肝疫苗（含鋁佐劑）暴露于-10 ℃以下會(huì)導(dǎo)致抗原結(jié)構(gòu)完整性和生物效力喪失［18-20］。為保證候選參考品穩(wěn)定性和長(zhǎng)期低溫保存（-20 ℃）的需求，本研究選擇凍干品為候選參考品劑型并對(duì)凍干保護(hù)劑配方進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，5%海藻糖+2%右旋糖酐凍干后抗原含量保留率最高，且具有良好的賦型效果，作為最優(yōu)配方凍干后，候選參考品均勻性和水分含量符合質(zhì)量控制要求。穩(wěn)定性結(jié)果顯示，候選參考品具有較好的加速穩(wěn)定性和復(fù)溶穩(wěn)定性。

各實(shí)驗(yàn)室采用統(tǒng)一SOP 分別對(duì)候選參考品進(jìn)行小鼠ED50檢測(cè)的協(xié)作標(biāo)定和適用性研究。協(xié)作標(biāo)定結(jié)果顯示，ED50均值為0.15 μg（95%置信區(qū)間為0.12~0.18μg），實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV為30.8%~64.2%，實(shí)驗(yàn)室間CV為32.6%。雖然按照統(tǒng)一SOP 實(shí)施協(xié)作標(biāo)定，但仍出現(xiàn)較高CV，提示以動(dòng)物試驗(yàn)為基礎(chǔ)的效力試驗(yàn)存在一定檢測(cè)誤差，也表明單一ED50檢測(cè)結(jié)果難以進(jìn)行橫向比較。適用性結(jié)果顯示，2家實(shí)驗(yàn)室自行研制的戊肝疫苗與候選參考品的劑量效應(yīng)關(guān)系趨勢(shì)相近，提示候選參考品與現(xiàn)有戊肝疫苗具有相近的小鼠免疫特性。采用相對(duì)效力計(jì)算待測(cè)疫苗ED50與參考疫苗ED50的比值對(duì)疫苗進(jìn)行質(zhì)量控制，可減少動(dòng)物試驗(yàn)誤差［21-22］。本研究將使用候選參考品作為ED50檢測(cè)時(shí)的實(shí)驗(yàn)質(zhì)控，在未來多批次批簽發(fā)中對(duì)待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)效力計(jì)算，期望在積累足量數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，在質(zhì)量控制中逐步使用相對(duì)效力替代ED50值，確保戊肝疫苗效力評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性和可比性。另外，在3R 原則的指導(dǎo)下，WHO 及各國(guó)藥品監(jiān)管部門均鼓勵(lì)開展體外效力替代體內(nèi)效力方法的研究［15，23-25］，近期戊肝疫苗抗原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品已成功建立［26］，規(guī)范并統(tǒng)一了我國(guó)戊肝疫苗抗原活性單位，結(jié)合本研究制備的戊肝疫苗效力國(guó)家參考品，為戊肝疫苗體外效力替代體內(nèi)效力方法奠定了基礎(chǔ)［24］。