張可靜 李桃紅 董縐縐 徐慧娜 方榮

肺部并發(fā)癥是肝移植術(shù)后患者死亡的主要原因[1-2]。急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是肝移植術(shù)后嚴(yán)重的肺部并發(fā)癥，發(fā)生率為2.6%～4.1%，其可導(dǎo)致患者機(jī)械通氣時(shí)間延長(zhǎng)及全身性感染的發(fā)生，最終影響移植效果[3]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究認(rèn)為miRNA可以作為ARDS的生物標(biāo)志物[4-8]，也有研究認(rèn)為miRNA122 與ARDS 存在相關(guān)性[9-10]。miRNA122 是肝臟特異性表達(dá)的RNA，既往研究聚焦于和肝病的關(guān)系研究[11]，而miRNA122 和肝移植及移植后ARDS發(fā)生之間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析肝移植術(shù)后患者血漿miRNA122 水平的變化，探討肝移植術(shù)后血漿miRNA122水平預(yù)測(cè)ARDS發(fā)生的價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2015 年1 月至2022 年12 月寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院ICU 收治的經(jīng)典背馱式肝移植術(shù)后患者60 例，術(shù)后連續(xù)監(jiān)測(cè)3 d，其中發(fā)生ARDS 21 例（術(shù)后并發(fā)癥組），未發(fā)生ARDS 39例（手術(shù)對(duì)照組）。兩組患者性別、年齡、術(shù)前肝功能Child-Pugh 評(píng)分及終末期肝病模型（model for end-stage liver disease，Meld）評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲；（2）肝移植術(shù)后患者；（3）符合ARDS 柏林定義診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有心、肺疾病者。選取同期本院健康獻(xiàn)血者40 名為健康對(duì)照組，男36 名，女4 名；年齡43～58（45±3）歲。本研究經(jīng)寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：DYLL2018081），所有研究參與者均知情同意。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 提取外周血總miRNA 術(shù)后并發(fā)癥組和手術(shù) 對(duì)照組肝移植術(shù)后第1、2、3 天及健康對(duì)照組體檢時(shí)分別抽取外周靜脈血4 mL，混勻，12 000 r/min 離心2次徹底除去細(xì)胞碎片與雜質(zhì)，得到純化的血漿標(biāo)本。標(biāo)本經(jīng)裂解液處理使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離；后依次經(jīng)乙醇、去蛋白液、漂洗液離心清洗去除雜質(zhì)，最終加入洗脫液浸泡3 min，離心得到純化的總miRNA。

1.2.2 miRNA122 檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。使用miRcute 增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（批號(hào)：KR211，中國(guó)北京天根生化科技公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，取2 000 ng RNA 為模板，42 ℃反應(yīng)60 min 使miRNA 加A 尾，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，95 ℃反應(yīng)3 min 使酶失活。檢測(cè)上游引物（批號(hào)：CD201-0006）、檢測(cè)下游引物（批號(hào)：CD200-01）及外參（批號(hào)：CR100）均購(gòu)自中國(guó)北京天根生化科技公司。使用miRcute 增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：FP411，北京天根生化科技公司）檢測(cè)miRNA122表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為95 ℃15 min 預(yù)變性，94 ℃20 s，60 ℃34 s，40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)Ct 值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA122 相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

術(shù)后第1、2、3 天術(shù)后并發(fā)癥組和手術(shù)對(duì)照組血漿miRNA122 水平均高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；術(shù)后第2、3 天術(shù)后并發(fā)癥組血漿miRNA122 水平均高于手術(shù)對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），但術(shù)后第1 天術(shù)后并發(fā)癥組和手術(shù)對(duì)照組血漿miRNA122 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 3 組對(duì)象血漿miRNA122 水平比較

3 討論

我國(guó)作為世界上肝臟疾病發(fā)病率最高的國(guó)家之一，相當(dāng)部分患者會(huì)發(fā)展為終末期肝病，以致并發(fā)肝功能衰竭而死亡。肝移植技術(shù)挽救了無(wú)數(shù)患者的生命，但移植后的各種并發(fā)癥是制約肝移植存活率進(jìn)一步提高的重要原因。ARDS 是臨床上常見(jiàn)的危重癥之一，其特點(diǎn)是起病急、病因復(fù)雜、頑固性低氧血癥，加之缺乏特異性的檢測(cè)指標(biāo)，致使該綜合征病死率高達(dá)25%～40%[13]，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。ARDS 是肝移植術(shù)后嚴(yán)重的肺部并發(fā)癥。

miRNA122 是最早發(fā)現(xiàn)的具有組織特異性的一種miRNA，在肝組織中高表達(dá)，約占肝組織miRNA 的70% ，在肝臟的生理病理等方面發(fā)揮重要作用[14]。研究報(bào)道，miRNA122 在ARDS 引起的微血管損傷及細(xì)胞氧合中具有重要作用，其可作為ARDS 的標(biāo)志物且與患者28 d 生存率相關(guān)[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，肝移植術(shù)后第1 天，所有患者血漿miRNA122 水平飆升，并且隨著時(shí)間的推移，血漿miRNA122 水平急劇下降，術(shù)后并發(fā)癥組血漿miRNA122 水平明顯高于健康對(duì)照組，但術(shù)后并發(fā)癥組和手術(shù)對(duì)照組血漿miRNA122 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮和樣本量較少，手術(shù)后應(yīng)激及個(gè)體差異大有關(guān)；肝移植術(shù)后第2 天，術(shù)后并發(fā)癥組和手術(shù)對(duì)照組血漿miRNA122 水平仍較高，且3 組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明血漿miRNA122 水平和肝移植術(shù)后并發(fā)ARDS 之間具有相關(guān)性，且去除了肝移植手術(shù)本身造成miRNA122 上升的影響，miRNA122可以作為肝移植后并發(fā)ARDS 的分子標(biāo)志物。肝移植術(shù)后第3 天，術(shù)后并發(fā)癥組和手術(shù)對(duì)照組血漿miRNA122 水平仍較高，但繼續(xù)處于下降狀態(tài)，術(shù)后并發(fā)癥組和兩個(gè)對(duì)照組間比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，血漿miRNA122 水平在預(yù)測(cè)肝移植術(shù)后ARDS 發(fā)生方面具有一定的臨床價(jià)值，可作為潛在的生物標(biāo)志物，為臨床醫(yī)師提供更多及時(shí)而有效的依據(jù)。但miRNA122 在ARDS 病理生理中的具體機(jī)制、靶基因位點(diǎn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等方面有待進(jìn)一步深入研究。