丁亭亭，蘇東平，杜宜龍，陳景輝，趙紅軍，孫磊，王鵬飛,6*

（1. 山東省葡萄研究院，山東濟(jì)南 250100；2. 煙臺(tái)科技學(xué)院，山東煙臺(tái) 265600；3. 蓬萊國賓葡萄酒莊有限公司，山東煙臺(tái) 265600；4. 中糧長城葡萄酒（蓬萊）有限公司/山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心，山東煙臺(tái) 265600；5. 北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，北京 100093；6. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100）

葡萄果皮顏色的變化是成熟過程中的重要指標(biāo)之一，花色苷隨著果實(shí)的成熟進(jìn)程逐漸積累并穩(wěn)定在較高水平。而果皮顏色是由果皮中花色苷的種類和比例決定的[1]。同時(shí)，花色苷還具有重要的營養(yǎng)和藥理作用，具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病和抗腫瘤等多種保健功能[2-4]。葡萄中花色苷的生物合成可分為苯丙烷類代謝途徑、類黃酮途徑及花色苷合成途徑3個(gè)階段[5-6]。在苯丙烷類代謝途徑中，在苯丙氨酸裂解酶、肉桂酸羥化酶和4-香豆酰CoA連接酶作用下合成花色苷前體物質(zhì)——對(duì)香豆酰-CoA[7]。在類黃酮途徑中，查爾酮合成酶、查爾酮異構(gòu)酶和黃烷酮-3-羥化酶將對(duì)香豆酰-CoA轉(zhuǎn)化為花色苷合成關(guān)鍵前體物質(zhì)二氫黃酮醇。在花色苷合成途徑中，二氫黃酮醇還原酶、無色花色素雙加氧酶及花青素合成酶催化二氫黃酮醇轉(zhuǎn)化為花白素，最后合成未修飾的花青素，再經(jīng)過糖基化等修飾反應(yīng)，形成不同結(jié)構(gòu)的花色苷[8]，這種二次修飾決定了葡萄果皮的顏色。通常葡萄果皮中的花色苷以錦葵素-3-葡萄糖苷、錦葵素-3-p-香豆酰葡萄糖苷、錦葵素-3-乙酰葡萄糖苷為主[9]?；ㄉ諏儆诙喾游镔|(zhì)，葡萄中的多酚物質(zhì)還包括酚酸類、黃烷酮醇類、黃酮醇類、黃烷醇類（例如兒茶素、表兒茶素）、芪類化合物（例如白藜蘆醇）等[10-11]。

在葡萄成熟過程中，果實(shí)中的其他成分也發(fā)生著復(fù)雜的變化，例如果實(shí)中的糖分不斷積累[12]，酸度不斷減退。葡萄果實(shí)中積累的糖主要包括果糖、葡萄糖、蔗糖等[13]；酸可分為有機(jī)酸和無機(jī)酸兩種，有機(jī)酸以酒石酸、蘋果酸及檸檬酸為主[12,14]。而糖、酸的種類和含量以及糖酸比決定著成熟葡萄的風(fēng)味[15]。

雖然前人對(duì)葡萄成熟過程中的代謝產(chǎn)物含量變化做了大量研究，但是針對(duì)轉(zhuǎn)色前到轉(zhuǎn)色前期這一過程果皮的代謝產(chǎn)物變化沒有細(xì)致的研究。尤其是針對(duì)葡萄膨大到轉(zhuǎn)色這個(gè)階段，果皮中花色苷種類和含量變化的研究鮮有報(bào)道。在轉(zhuǎn)色前葡萄果皮的顏色為綠色，但是花色苷合成是否已經(jīng)開始尚不明確。果皮中糖、酸、黃酮、芪類等營養(yǎng)物質(zhì)的積累狀況也鮮有報(bào)道。因此，本團(tuán)隊(duì)利用廣泛靶向代謝組調(diào)查葡萄轉(zhuǎn)色前約4周、轉(zhuǎn)色前約1周和轉(zhuǎn)色前期‘品麗珠’葡萄果皮中代謝產(chǎn)物的積累和變化，旨在明確葡萄果皮轉(zhuǎn)色過程中產(chǎn)生不同代謝產(chǎn)物的分子機(jī)理，為深入研究葡萄果實(shí)成熟的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

2019年在山東省葡萄研究院葡萄種質(zhì)資源圃采集‘品麗珠’葡萄轉(zhuǎn)色前約4周（S1）、轉(zhuǎn)色前1周（S2）和轉(zhuǎn)色前期（S3）形狀、大小均一，無病蟲害、無損傷的果實(shí)，每個(gè)時(shí)期分別采3穗果實(shí)樣品（圖1）。洗凈擦干后，在液氮速凍狀態(tài)下剝?nèi)」とス猓?80 ℃下保存待用。每組樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

圖1 不同發(fā)育階段的‘品麗珠’葡萄果實(shí)Figure 1 'Cabernet Franc' fruit at different stages of development

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄果皮前處理

取0.10 g葡萄果皮在凍干機(jī)（Scientz-100F）中進(jìn)行真空冷凍干燥，隨后用研磨儀（MM 400，Retsch）研磨振蕩（30 Hz，1.5 min）成粉末。加入0.6 mL 70%甲醇提取液，渦旋振蕩儀振蕩混勻，溶解后的樣品放在4 ℃冰箱靜置過夜，中間渦旋振蕩混勻6次，以提高提取效率。第2天，4 ℃離心機(jī)10 000 r·min-1高速離心10 min，吸取上清液，用0.22 μm孔徑的微孔濾膜過濾，保存于棕色進(jìn)樣瓶中，用于后續(xù)UPLC-MS/MS分析。

1.2.2 色譜質(zhì)譜方法

數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)包括超高效液相色譜儀（UPLC）和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）。色譜柱是Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流動(dòng)相A是包含0.04%乙酸的超純水，流動(dòng)相B是加入0.04%乙酸的乙腈溶液。流速為0.35 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量添加4 μL。

質(zhì)譜條件：使用三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Applied Biosystems 4500 QTRAP）測定；電噴霧離子源（ESI）溫度設(shè)置為550 ℃，質(zhì)譜電壓設(shè)置為5500 V，簾氣（CUR）設(shè)置為30 psi，碰撞誘導(dǎo)電離（CAD）參數(shù)設(shè)為高。

1.2.3 代謝物定性與定量分析

參照Yang等方法進(jìn)行[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

基于武漢邁維科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫（Metawaredatabase，MWDB），依據(jù)二級(jí)譜信息數(shù)據(jù)庫對(duì)代謝物質(zhì)進(jìn)行定性分析。采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)3組樣品進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（PLSDA）法預(yù)測模型的可靠性。選取其中Log2FC≥1和Log2FC≤-1、變量權(quán)重值（Variable important in projection，VIP）≥1、P（P value）≤0.05的代謝物被鑒定為差異代謝物。將其中的差異代謝物數(shù)據(jù)提交到KEGG數(shù)據(jù)庫[17]，進(jìn)行相關(guān)注釋和通路類型分類。使用KOBAS 2.0軟件 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）進(jìn)行KEGG富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝組成分總體分析

在3個(gè)取樣期的果皮中，共鑒定出29類416種代謝物（表1），其中S1果皮的代謝組成分有29類394種，特有的化學(xué)物質(zhì)有1類1種，即1-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿；S2果皮的代謝組成分有29類401種，特有的化學(xué)物質(zhì)有2類2種，即丙氨酰亮氨酸和2-苯乙胺；S3果皮的代謝組成分有29類397種，特有的化學(xué)物質(zhì)有4類14種，包括DL-多巴、矢車菊素半乳糖苷、3-O-葡萄糖苷氯化物、錦葵色素O-己糖苷、錦葵色素3-O-半乳糖苷、錦葵色素3-O-葡糖苷、甲基花青素-3,5-二葡糖糖苷、翠雀素-3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷、矮牽牛-3-(乙?；?葡糖苷、二甲花翠素-3-(乙?；?葡糖苷、金圣草黃素、7-O-蕓香糖苷麥黃酮、5-O-蕓香糖苷和異鼠李素（表1）。

表1 三個(gè)取樣期葡萄果皮中代謝物數(shù)量統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of metabolites in grape pericarp in three sampling periods

2.2 不同著色期葡萄果皮代謝組主成分分析結(jié)果

通過對(duì)樣品進(jìn)行主成分分析（PCA），判斷S1、S2和S3期葡萄果皮各組樣品之間的總體代謝物差異和組內(nèi)樣品之間的變異度大小。其中PC1的貢獻(xiàn)率為55.4%，PC2的貢獻(xiàn)率為11.21%，且3組樣本在二維圖上表現(xiàn)出明顯的分離趨勢（圖2），在PCA結(jié)果上能夠從總體上反映出3組樣品之間的代謝物差異。

圖2 三組樣品及質(zhì)控的PCA結(jié)果Figure 2 PCA plot for discrimination of three groups of samples and quality control

2.3 不同著色期果皮主要差異代謝成分分析

分別對(duì)S1、S2和S3期果皮樣品中代謝成分定量信息發(fā)生的差異倍數(shù)變化進(jìn)行兩兩比較，三個(gè)比較組果皮差異代謝物分別為32個(gè)（S1 vs S2）、195個(gè)（S1 vs S3）和186個(gè)（S2 vs S3）；其中，S1 vs S2獨(dú)有差異代謝物4個(gè)，S1 vs S3獨(dú)有28個(gè)，S2 vs S3獨(dú)有19個(gè)；3個(gè)比較組共有差異代謝物20個(gè)。對(duì)影響葡萄果實(shí)品質(zhì)的代謝物質(zhì)如花青素、糖及有機(jī)酸進(jìn)行分析，其中花青素的變化個(gè)數(shù)分別為8個(gè)（S1 vs S2）、22個(gè)（S1 vs S3）和23個(gè)（S2 vs S3）；糖類變化個(gè)數(shù)分別為1個(gè)（S1 vs S2）、9個(gè)（S1 vs S3）和7個(gè)（S2 vs S3）；有機(jī)酸變化個(gè)數(shù)為1個(gè)（S1 vs S2）、7個(gè)（S1 vs S3）和7個(gè)（S2 vs S3）。

將差異倍數(shù)進(jìn)行處理轉(zhuǎn)化為log2FC，從中選出變化倍數(shù)最大的前10個(gè)上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)代謝成分進(jìn)行分析（圖3）。與S1期果皮相比，S2期果皮中5種花青素（芍藥素-3-葡萄糖苷、甲基花青素-3-(乙?；?葡糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-O-對(duì)香豆酰)-5-O-二葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-對(duì)香豆酰)葡糖苷、甲基花青素-3-O-(6-對(duì)香豆酰)葡糖苷），3種氨基酸及其衍生物（丙氨酰亮氨酸、氨基乙?；惲涟彼?、DL-高半胱氨酸），1種酚酸類（鄰苯三酰-β-D-葡萄糖），1種其他類（2-苯乙胺）的相對(duì)含量顯著增加；3種氨基酸及其衍生物（β-煙酰胺單核苷酸、煙草胺、L-胱硫醚），1種有機(jī)酸（L-(+)-酒石酸），1種黃烷醇類（沒食子酸），1種黃酮（芹菜素O-己糖基-O-蕓香糖苷），1種查耳酮（根皮素），1種糖及醇類（DL-阿拉伯糖），1種酚酸類（1-阿魏酰-sn-甘油）和1種磷脂酰膽堿（甘磷酸膽堿GPC）的相對(duì)含量顯著降低。

圖3 三個(gè)比較組代謝物差異倍數(shù)柱狀圖（差異倍數(shù)最大）Figure 3 The most significant different metabolite multiples of three comparison groups

與S1期果皮相比，S3期果皮中9種花青素（錦葵色素3-O-半乳糖苷、錦葵色素3-O-葡糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、翠雀素-3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷、矮牽牛-3-(乙?；?葡糖苷、錦葵色素O-己糖苷、甲基花青素-3-(乙?；?葡糖苷、3-O-葡萄糖苷氯化物、矢車菊素半乳糖苷）和1種黃酮（麥黃酮5-O-蕓香糖苷）的相對(duì)含量顯著增加；4種氨基酸及其衍生物（N-丙酰甘氨酸、(-)-3-(3,4-二羥基苯基)-2-甲基丙氨酸、L-胱硫醚、L-高胱氨酸）、3種酚酸類（對(duì)香豆酸、香豆酸、5-羥甲基糠醛）、2種有機(jī)酸（L-(+)-酒石酸、馬來酸）和1種糖及醇類（DL-阿拉伯糖）的相對(duì)含量顯著降低。

與S2期果皮相比，S3期果皮中8種花青素（矢車菊素半乳糖苷、3-O-葡萄糖苷氯化物、錦葵色素O-己糖苷、錦葵色素3-O-半乳糖苷、錦葵色素3-O-葡糖苷、翠雀素-3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷、矮牽牛-3-(乙?；?葡糖苷、二甲花翠素-3-(乙?；?葡糖苷）和2種黃酮（金圣草黃素7-O-蕓香糖苷、麥黃酮5-O-蕓香糖苷）的相對(duì)含量顯著增加；5種氨基酸及其衍生物（N-丙酰甘氨酸、丙氨酰亮氨酸、(-)-3-(3,4-二羥基苯基)-2-甲基丙氨酸、黃嘌呤、L-高胱氨酸），2種酚酸類（香豆酸、5-羥甲基糠醛），1種有機(jī)酸（L-(+)-酒石酸），1種糖及醇類（DL-阿拉伯糖），1種其它（2-苯乙胺）的相對(duì)含量顯著降低。

2.4 不同著色期果皮差異代謝物通路富集分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)S1、S2和S3三個(gè)時(shí)期差異代謝物質(zhì)進(jìn)行通路富集分析。對(duì)S1 vs S2鑒定出的32種顯著差異代謝物進(jìn)行KEGG通路分析，根據(jù)p值大小排序，富集的KEGG通路中前17條主要涉及類黃酮的生物合成、次生代謝物的生物合成、二苯乙烯、二芳基庚酸類和姜酚合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝及異黃酮的生物合成。其中，次生代謝物和類黃酮生物合成途徑富集差異代謝物較多，富集程度顯著，表明轉(zhuǎn)色前4周到轉(zhuǎn)色前1周果皮中的差異代謝物主要參與次生代謝物和類黃酮的生物合成（圖4）。

圖4 差異代謝物的富集分析Figure 4 Enrichment analysis of differential metabolites

對(duì)S1 vs S3鑒定出195種顯著差異代謝物進(jìn)行KEGG通路分析，根據(jù)p值大小排序，富集的KEGG通路中前20條主要涉及代謝途徑、次生代謝物的生物合成、花青素的生物合成和氨基酸的生物合成等（圖4）。

對(duì)S2 vs S3鑒定出186種顯著差異代謝成分進(jìn)行KEGG通路分析，根據(jù)p值大小排序，富集的KEGG通路中前20條主要涉及代謝途徑、異黃酮的生物合成、花青素的生物合成和氨基酸的生物合成等（圖4）。

3 討論與結(jié)論

果實(shí)成熟是葡萄最重要的生長發(fā)育過程之一。在此過程中，果實(shí)中的各種代謝產(chǎn)物會(huì)發(fā)生復(fù)雜的變化，其中糖、酸和多酚類物質(zhì)等的種類和含量變化與葡萄品質(zhì)有著密切的關(guān)聯(lián)[13]。在葡萄成熟過程中，最明顯的變化是果皮顏色?；ㄉ帐侵匾念慄S酮物質(zhì)，是葡萄各個(gè)組織重要的呈色物質(zhì)。而在紅色品種果實(shí)顏色逐漸加深過程中花色苷持續(xù)積累，到成熟時(shí)基本穩(wěn)定在較高的含量水平[1]。本研究中，與轉(zhuǎn)色前4周相比，轉(zhuǎn)色前1周的‘品麗珠’葡萄果皮中氯化錦葵色素-3-葡糖苷、矮牽牛-3-葡萄糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、甲基花青素-3-(乙?；?葡糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-O-對(duì)香豆酰)-5-O-二葡萄糖苷、矮牽牛-3-O-(6-對(duì)香豆酰)葡糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-對(duì)香豆酰)葡糖苷和甲基花青素-3-O-(6-對(duì)香豆酰)葡糖苷8種花青素的積累水平上升，說明在葡萄轉(zhuǎn)色之前已經(jīng)發(fā)生花色苷的積累。矢車菊素3-O-葡萄糖苷、矢車菊素O-丁香酸、花翠素3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-(6-對(duì)香豆酰)葡糖苷在轉(zhuǎn)色前4周和轉(zhuǎn)色前1周有相似的含量，到轉(zhuǎn)色前期含量上升。矢車菊素半乳糖苷、3-O-葡萄糖苷氯化物、錦葵色素O-己糖苷、錦葵色素3-O-半乳糖苷、錦葵色素3-O-葡糖苷、甲基花青素-3,5-二葡糖糖苷、翠雀素-3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷、矮牽牛-3-(乙?；?葡糖苷和二甲花翠素-3-(乙酰基)葡糖苷9種花青素在轉(zhuǎn)色前4周和轉(zhuǎn)色前1周并沒有積累，在轉(zhuǎn)色前期才發(fā)生積累。Fasoli等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在‘赤霞珠’和‘黑比諾’果實(shí)中，錦葵色素3-O-葡糖苷含量從轉(zhuǎn)色前期到成熟期顯著上升。而本研究中‘品麗珠’果皮中錦葵色素3-O-葡糖苷的變化趨勢不同，可能是組織部位或品種不同原因?qū)е碌摹?/p>

在葡萄果實(shí)成熟過程中，葉片通過積累、運(yùn)輸、轉(zhuǎn)化光合產(chǎn)物以及果實(shí)自身的光合同化作用和有機(jī)酸代謝等過程使得果實(shí)中的糖類物質(zhì)不斷積累[13]。葡萄果實(shí)中積累的可溶性糖類物質(zhì)主要是葡萄糖和果糖，其次是蔗糖，后者含量不足總糖的4%。此外，還有少量的其他糖類，如：麥芽糖、半乳糖、水蘇糖、棉籽糖及蜜二糖等，隨著果實(shí)成熟含糖量逐漸增加[19-21]。此外，糖還可作為信號(hào)分子，與激素、N等信號(hào)形成網(wǎng)絡(luò)，通過交互作用調(diào)控植物的生長發(fā)育過程[22-23]。本研究顯示，與轉(zhuǎn)色前4周相比，轉(zhuǎn)色前期‘品麗珠’葡萄果皮中的蔗糖和葡萄糖相對(duì)含量上調(diào)，與轉(zhuǎn)色前1周相比，轉(zhuǎn)色前期‘品麗珠 ’葡萄果皮中的蔗糖含量上調(diào)。轉(zhuǎn)色前4周、轉(zhuǎn)色前1周和轉(zhuǎn)色前期的‘品麗珠’葡萄果皮中可溶性糖類物質(zhì)積累以葡萄糖為主，蔗糖為輔，而沒有檢測到果糖的積累。Fasoli等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在‘赤霞珠’和‘黑比諾’果實(shí)中，果糖含量從轉(zhuǎn)色前期到成熟期顯著上調(diào)。而本研究中在‘品麗珠’葡萄果皮中并沒有檢測到果糖的積累，可能是由于組織或品種不同的原因。

葡萄果實(shí)中的酸包含無機(jī)酸和有機(jī)酸兩大類[24]。無機(jī)酸是葡萄根系從土壤中吸收，主要有硫酸、鹽酸、磷酸等。葡萄果實(shí)中有機(jī)酸的主要成分是酒石酸，還有蘋果酸以及少量的檸檬酸，其中酒石酸和蘋果酸占漿果總酸的90%左右，檸檬酸在葡萄果實(shí)中含量始終很低[13,15]。本研究中，與轉(zhuǎn)色前1周相比，轉(zhuǎn)色前4周‘品麗珠’葡萄的果皮中酒石酸的含量更高，后下降4～8倍，到轉(zhuǎn)色前期未檢測出酒石酸。蘋果酸在轉(zhuǎn)色前4周和轉(zhuǎn)色前1周有相似的含量，到轉(zhuǎn)色前期時(shí)含量下降2倍。而在3個(gè)采樣期的‘品麗珠’葡萄果皮中始終沒有檢測出檸檬酸。這說明葡萄果皮在幼果期酸含量較高，而在轉(zhuǎn)色期以后酸含量迅速降低。