胡鑫宇，孫敏華，曾慶航，謝梓民，袁朝霞，廖 明

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疾病防控重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）屬于腺病毒科（Adenoviridae）禽腺病毒屬（Aviadenovirus），是一種無囊膜的雙股DNA病毒。禽腺病毒屬Ⅰ群可根據(jù)病毒結(jié)構(gòu)特征分為5 個種（以A～E 表示），根據(jù)血清交叉中和反應可分為12 種血清型（FAdV1～7、8a、8b、9～11）［1］。禽腺病毒Ⅰ群所有血清型均可引發(fā)包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis，IBH）［2］，其中FAdV-4 被認為是引發(fā)心包積液-肝炎綜合征（Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS）的特定病原，發(fā)病禽可見明顯的心包積液和肝炎、腎炎，致死率高，其流行給我國養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失［3］。目前接種疫苗仍是FAdV 防控的有效手段［4］，但禽腺病毒Ⅰ群血清型較多，且不同血清型之間沒有或只有微弱的的交叉保護力［5］。FAdV-4 能夠中和FAdV-11，但不能中和 FAdV-8a 和FAdV-8b，F(xiàn)AdV-8a 和FAdV-8b 不能交叉中和，F(xiàn)AdV-8b 和FAdV-11 能夠相互中和［6］。研究FAdV 不同血清型的致病性可以進一步認識禽腺病毒的危害，為科學有效防控奠定基礎(chǔ)。

【前人研究進展】2007—2018 年調(diào)查表明，我國占據(jù)主導地位的禽腺病毒流行型為FAdV-4，其次為FAdV-8a、-8b、-11。近年來，同屬于FAdV-D 的FAdV-2、-8a、-8b、-11 在我國南方省份被分離發(fā)現(xiàn)的占比不斷上升［7-8］，其中FAdV-2 的分離率逐年上升。FAdV-2 已在中國、加拿大［9］、日本［10］和波蘭［11］等許多國家檢出，主要感染3～5 周齡肉雞，導致嚴重的IBH，平均死亡率為5%～10%［12］。目前，有關(guān)FAdV-2 的致病性尚不清楚，發(fā)病禽的病理變化等仍不明確。

【本研究切入點】通過對養(yǎng)殖場雞群健康狀況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，免疫過雞新城疫、禽流感（H9 亞型）、禽腺病毒?。↖ 群FAdV-4）三聯(lián)滅活疫苗的雞群出現(xiàn)死亡，剖檢可見典型的HHS 癥狀。該情況說明除FAdV-4 外可能還存在同樣能引發(fā)HHS 的病毒，因此對該病死雞的組織樣品進行病毒分離鑒定，明確疑似腺病毒的血清型，并通過動物回歸試驗建立發(fā)病模型。

【擬解決的關(guān)鍵問題】FAdV-4 被認為是導致HHS 癥狀的主要病原，其發(fā)病模型穩(wěn)定。為建立穩(wěn)定的FAdV-2 發(fā)病模型，本研究從HHS 發(fā)病雞組織樣品中分離出KM 株，對其基因序列進行分析，通過比較不同攻毒途徑和不同攻毒劑量的致病性差異，篩選出建立發(fā)病模型的最佳攻毒途徑和攻毒劑量，并對發(fā)病評價指標進行驗證，為FAdV-2 的免疫原性評價和疫苗效果評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 云南昆明某養(yǎng)殖場雞群出現(xiàn)不明原因死亡，剖檢可見肝炎、腎炎和心包積水等HHS 樣臨床癥狀。該養(yǎng)殖場雞群已經(jīng)免疫過兩次雞新城疫、禽流感（H9 亞型）、禽腺病毒?。↖群FAdV-4）三聯(lián)滅活疫苗。為了明確導致此次疾病的病原，采集病死雞的肝臟、脾臟和腎臟樣本，冷藏保存，送至實驗室檢查。

1.1.2 試驗動物 6 周齡SPF 雞70 只，購自北京梅里亞維通公司，于動物隔離器中飼養(yǎng)。

1.1.3 試劑和引物 DMEM-F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自賽默飛世爾科技有限公司；雞肝癌細胞（LMH 細胞）購自廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司；DL2000 Marker、2×Taq Master Mix、磷酸緩沖溶液（PBS）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DNA 提取試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

參照文獻［13］設(shè)計FAdV 鑒定通用引物（上游引物5' CAARTTCAGRCAGACGGT 3'，下游引物5' TAGTGATGMCGSGACATCAT 3'，目的片段大小為897 bp）；將GenBank 登記的GX01 株作為參考序列，分別設(shè)計FAdV-2Fiber序列擴增引物（上游引物5' ATGGCAAAATCGACTCCTTTC 3'，下游引物5' TTAGGGTTGTGTTAATTTATT 3'，目的片段大小約為1 700 bp）和FAdV-2Hexon序列擴增引物（上游引物5' CGTCGCATGTGTTATTGACC 3'，下游引物5' GTCCCAGCCATTATAAGCAG 3'，目的片段大小約為3 000 bp）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 病毒分離鑒定

1.2.1 病原鑒定 將病死雞組織樣本置于研缽，研磨勻漿加PBS 后放入5 mL EP 管中，反復凍融3 次，5 000 r/min 離心5 min，按照Takara DNA 提取試劑盒說明書的操作步驟抽提上清液DNA 作為模板，用FAdV 通用引物進行鑒定。PCR 體系為：2×Taq Master Mix 5 μL、FAdV 上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 2 μL。反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)預期條帶則視為樣本禽腺病毒陽性。

1.2.2 病毒分離 取LMH 細胞生長至密度達90%～95%的T25 細胞瓶，棄去瓶中培養(yǎng)基后加入無菌PBS，平鋪潤洗后棄去洗液，重復2 次。加入經(jīng)孔徑0.22 μm 濾膜過濾后的1.2.1 陽性樣本液200 μL 和 DMEM-F12 培養(yǎng)基300 μL，晃動平鋪后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄接毒液后加入5 mL 含5% FBS 的DMEM-F12 培養(yǎng)基，放于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每天觀察，培養(yǎng)結(jié)束時反復凍融后收獲。按照上述接毒方法盲傳3 代。

1.2.3 病毒鑒定 取盲傳3 代后的培養(yǎng)液，用DNA 提取試劑盒抽提病毒DNA，作為PCR 特異性擴增的模板。PCR 體系和反應程序按照1.2.1操作。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)預期條帶則送測序，并對序列進行比對。

1.3 分離株KM 的Fiber 和Hexon 序列分析

以1.2.3 制備的病毒DNA 作為模板，分別用Fiber、Hexon引物進行PCR 擴增。PCR 體系為：2×Taq Master Mix 25 μL、上下游擴增引物各2 μL、模板DNA 2 μL、ddH2O 19 μL。反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s、55 ℃ 50 s、72 ℃ 1 min 20 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)預期條帶則送測序。

在GenBank 中下載14 株禽腺病毒參考株（表1）的全基因組序列，利用MegAlign 軟件的Clustal W 方法將本研究的分離株KM 與參考株進行核苷酸序列比對和相似性分析，采用MEGA7.0軟件構(gòu)建核苷酸系統(tǒng)發(fā)育樹（算法NJ 鄰接法，Bootstrap 值設(shè)為500）。應用生物軟件DNAStar中的Editseq 推導分離株的主要結(jié)構(gòu)基因Hexon和Fiber的氨基酸序列，并與 GX01 株相應蛋白的氨基酸序列進行比對分析。

表1 FAdV 代表毒株信息Table 1 Information of representative FAdV strains

表2 KM 株不同攻毒途徑發(fā)病統(tǒng)計Table 2 Statistics on the incidence of KM strain with different infection routes

1.4 KM 株擴增及TCID50 測定

將KM 株F2代病毒液接種于T75 細胞瓶中孵育2 h，棄去接種液并用PBS 潤洗2 次，37 ℃下觀察，出現(xiàn)80%以上病變則將細胞瓶置于-80℃下繁毒凍融3 次使病毒充分釋放，分裝，-80℃保存待測TCID50。將LMH 細胞鋪于96 孔板中，待其生長至密度達85%～95%時進行試驗。用DMEM-F12 培養(yǎng)液將病毒液進行10 倍稀釋，使病毒液濃度為原液的10-10～10-1，分別取100 μL接種于96 孔細胞板中，每個稀釋度8 個重復，第11 列為空白對照，第12 列為陽性對照。置于37℃溫箱中孵育2 h 后棄去病毒液，加入含1% FBS的DMEM-F12 細胞維持液。將細胞板放入37 ℃培養(yǎng)箱中，觀察7 d，記錄病變孔數(shù)，按照 Reed-Muench 法計算病毒TCID50。

1.5 KM 株發(fā)病模型建立

1.5.1 KM 株純凈性檢測 分別用試劑盒抽提兩代感染毒KM 株病毒液中的DNA，并用常見的禽病病毒特異性檢測引物進行PCR 特異性擴增檢測，供檢測的病毒包括雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、減蛋綜合征病毒（EDSV）、禽支原體（MS/MG）、馬立克病病毒（MDV）、新城疫病毒（NDV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV）、禽傳染性腦炎病毒（AEV）、禽呼腸孤病毒（ARV）、雞傳染性病病毒（CAV）、雞白血?。ˋLV）、傳染性支氣管炎（IBV）。PCR 體系為：2×Taq 5 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板1 μL、ddH2O 1 μL。反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃30 s、55℃ 30 s、72 ℃ 50 s，30 個循環(huán)；72 ℃5 min，PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

1.5.2 不同攻毒途徑的KM 株致病性分析 以F3代病毒作為感染毒，將30 只6 周齡SPF 雞隨機分成3 組（a、b、對照），每組10 只。對a、b組SPF 雞分別經(jīng)靜脈注射和肌肉注射兩種方式注射107.2TCID50的病毒液，空白對照組中5 只經(jīng)靜脈注射1 mL DMEM-F12（CK1），另外5 只經(jīng)肌肉注射1 mL DMEM-F12 培養(yǎng)基（CK2）。攻毒后3 組SPF 雞分別在隔離器中飼養(yǎng)，每天觀察并記錄雞群狀態(tài)。攻毒1、3、5、7 d 后用棉簽采集泄殖腔拭子，-80 ℃保存；攻毒7 d 后處死全部雞，剖檢觀察臟器病變情況，并采集心、肝、脾、腎組織樣品，-80 ℃保存。

1.5.3 不同攻毒劑量的KM 株致病性分析 以F3代作為感染毒，將40 只6 周齡SPF 雞隨機分成4組（A、B、C、對照），每組10 只。對A、B、C 組SPF 雞分別靜脈注射108.0TCID50、107.0TCID50和106.0TCID50病毒液，空白對照組（CK）靜脈注射1 mL 培養(yǎng)基。攻毒后4 組SPF 雞分別于隔離器中飼養(yǎng)，每天觀察并記錄雞群狀態(tài)。攻毒1、3、5、7 d 后用棉簽采集泄殖腔拭子保存于添加PBS的EP 管中，-80 ℃保存；攻毒7 d 后處死全部雞，剖檢觀察臟器病變情況，采集心、肝、脾、腎組織樣品，-80 ℃保存。

1.5.4 組織樣品核酸檢測 將心、肝、脾、腎組織樣品置于室溫下融化、研磨制成勻漿，置于5 mL EP 管中，加入3 mL 滅菌PBS，反復倒置混合均勻，放入-80 ℃冰箱中反復凍融3 次，5 000 r/min離心5 min，取上清液，用試劑盒抽提上清液中的核酸，PCR 體系和反應程序同1.2.1，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5.5 泄殖腔拭子核酸檢測 將泄殖腔拭子于室溫中融化，用試劑盒抽提核酸，PCR 體系和反應程序同1.2.1，將PCR 產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠中電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒鑒定結(jié)果

本研究分離的病毒盲傳3 代后，LMH 細胞出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為變圓、脫落（圖1），抽提核酸后經(jīng)PCR 鑒定（圖2）為禽腺病毒。經(jīng)測序并比對序列，所分離的病毒Hexon基因核苷酸序列與GX01 株相似度達99.64%，鑒定為禽腺病毒Ⅰ群D 種中的禽腺病毒血清2 型（FAdV-2），將該毒株命名為KM 株。

圖1 KM 株感染LMH 細胞引起的細胞病變Fig.1 LMH cell pathological changes after KM strain infection

圖2 FAdV-2 的PCR 鑒定Fig.2 Identification of FAdV-2 by PCR assay

2.2 KM 株Fiber 基因和Hexon 基因的進化分析

采用MEGA 7.0 軟件的Clustal W 方法將KM株與5 個群共14 株FAdV 毒株的Fiber基因和Hexon基因核苷酸序列進行分析。根據(jù)Fiber遺傳進化樹（圖3A）來看，KM 株與國內(nèi)分離的FAdV-2 血清型GX01 株距離最近，同屬于禽腺病毒Ⅰ群D 種，與其他的A、B、C、E 群距離較遠；根據(jù)Hexon遺傳進化樹（圖3B）來看，KM 株與GX01 株距離也最近，同屬于禽腺病毒Ⅰ群D 種。

圖3 KM 株基于Fiber 基因（A）和Hexon 基因（B）的系統(tǒng)遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of KM strain based on Fiber gene (A) and Hexon gene (B)

采用MegAlign 對15 株FAdV 的Fiber和Hexon基因序列進行核苷酸同源性分析，結(jié)果顯示，KM 株Fiber基因核苷酸序列與GX01、380、685、A-A2、HBQ12、SR48、SR49 病毒核苷酸序列同源性為71.8%～98.9%，其中與GX01 株同源性為98.9%，該8 株病毒同屬于禽腺病毒Ⅰ群D 種（圖4）；KM 株Hexon基因核苷酸序列與GX01、380、685、A-2A 病毒核苷酸序列同源性為79.9%～99.6%，與380、SR49、HBQ12 病毒核苷酸序列同源性為39.0%～39.1%，其中KM與GX01、685、SR48 病毒核苷酸序列同源性為97.8%～99.6%（圖5）。

圖5 KM 株Hexon 基因核苷酸序列同源性分析結(jié)果Fig.5 Homology analysis result of nucleotide sequence of Hexon gene from KM strain

利用DNAStar 中的Editseq 軟件將分離株KM的主要結(jié)構(gòu)基因Hexon和Fiber翻譯為氨基酸序列，采用MegAlign 對15 株FAdV 的Fiber 氨基酸序列和Hexon 氨基酸序列分別進行同源性分析。結(jié)果顯示，KM 株Fiber 氨基酸序列與GX01、685、380、HBQ12 的同源性為94.8%～98.9%，其中與GX01 株的同源性最高、為98.9%（圖6）；KM 株Hexon 氨基酸序列也與GX01 株同源性最高、為98.8%，與685、SR48 同源性為33.1%和47.9%，表明KM 株與國外分離的毒株同源性較低（圖7）。

圖6 KM 株Fiber 氨基酸序列同源性分析結(jié)果Fig.6 Homology analysis result of the deduced amino acid sequence of Fiber from KM strain

圖7 KM 株Hexon 氨基酸序列同源性分析結(jié)果Fig.7 Homology analysis result of the deduced amino acid sequence of Hexon from KM strain

2.3 KM 株的TCID50 效價

分別記錄病毒液不同稀釋度（10-10～10-1）出現(xiàn)CPE 的孔數(shù)，計算每個稀釋度出現(xiàn)CPE 的占比，按照Reed-Muench 計算可得，KM 株F3代滴度為1×107.2TCID50/0.1 mL。

2.4 KM 株純凈性檢測

經(jīng)PCR 特異性擴增后，凝膠電泳結(jié)果顯示KM 株未檢測到外源病毒可疑條帶，可見KM 株F3代 無ILTV、EDSV、MS/MG、MDV、NDV、IBDV、AEV、ARV、CAV、ALV、IBV 病毒污染。

2.5 不同攻毒途徑的KM 株致病性

a 組SPF 雞通過靜脈注射107.2TCID50KM 株，感染后2 d 出現(xiàn)排黃綠色稀糞、站立困難、食欲下降等臨床癥狀；攻毒3 d 后死亡1 只，5 d 后死亡1 只，死亡率為20%；7 d 后處死并剖檢每只雞，可見心包積液、肝臟腫大帶出血點、腎腫大等病理變化。b 組SPF 雞通過肌肉注射107.2TCID50KM株，感染后3 d 出現(xiàn)少許黃綠色稀糞，無食欲下降、趴臥不起等臨床癥狀，無死亡；攻毒7 d 后處死剖檢無發(fā)現(xiàn)肝炎、腎炎等癥狀。對照CK1、CK2的雞精神狀態(tài)良好，食欲正常，7 d 后處死剖檢無發(fā)現(xiàn)肝炎、腎炎等癥狀。

2.6 不同攻毒劑量的KM 株致病性

KM 株經(jīng)靜脈注射劑量為106.0TCID50（C 組）時，雞群未出現(xiàn)精神沉郁、排黃綠色稀糞等臨床癥狀，剖檢無發(fā)現(xiàn)心包積液、肝炎癥狀。靜脈攻毒劑量為107.0TCID50（B 組）時，在7 d 內(nèi)5 只SPF 雞出現(xiàn)精神沉郁、趴臥不起、羽毛凌亂、食欲下降等發(fā)病癥狀，但未出現(xiàn)雞只死亡的情況（表3），但剖檢可見3 只出現(xiàn)明顯肝炎、腎炎癥狀。靜脈攻毒劑量達108.0TCID50（A 組）時，10 只SPF 雞發(fā)病，出現(xiàn)黃綠色稀糞、精神不振、食欲下降等臨床癥狀，且在攻毒3 d 內(nèi)死亡2 只，攻毒后7 d 內(nèi)死亡5 只，死亡率為50%（表3）；剖檢可見明顯的心包積液、肝炎、腎炎癥狀，肌胃、腺胃無變化（圖8）；攻毒死亡的雞組織病理切片（圖9）顯示，心臟組織間隙增寬、心肌纖維增粗、間質(zhì)性水腫，肝臟炎性細胞和嗜堿性包涵體浸潤，腎臟炎性細胞浸潤，間質(zhì)充血；對照組雞的心臟、肝臟和腎臟組織病理切片顯示正常（表3）。為保證KM 株感染模型中同時存在發(fā)病和死亡的情況，選擇靜脈注射感染途徑為宜，感染劑量為108.0TCID50。

圖8 KM 株靜脈注射108.0 TCID50 死亡雞只的剖檢結(jié)果Fig.8 Necropsy examination of dead chickens infected with KM strain 108.0 TCID50 in intravenous route

表3 KM 株不同病毒劑量靜脈注射發(fā)病統(tǒng)計Table 3 Statistics on the incidence of KM strain by intravenous route at different doses

2.7 臟器組織核酸檢測

采集KM 株靜脈注射108.0TCID50死亡的5 只雞和攻毒7 d 后統(tǒng)一處死的5 只雞的肝臟、腎臟樣本，提取核酸并利用FAdV-2 特異性引物進行PCR 擴增，均檢出大小符合預期的條帶，約897 bp（圖10），確認為KM 株感染。

圖10 組織樣本的FAdV-2 PCR 核酸檢測Fig.10 PCR detection of FAdV-2 in tissue samples

2.8 泄殖腔拭子核酸檢測

A、B、C 試驗組攻毒前泄殖腔拭子核酸檢測均無目標條帶檢出，靜脈注射KM 株，攻毒后1 d的檢測結(jié)果顯示均有目標條帶，攻毒后3～7 d 各組全部雞均檢出目標條帶（表4）。

表4 泄殖腔拭子核酸陽性率Table 4 Positive rate of cloaca swab nucleic acid

3 討論

我國是畜禽養(yǎng)殖大國，規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖業(yè)為社會帶來巨大經(jīng)濟效益［14］。2015 年發(fā)現(xiàn)禽心包積液-肝炎綜合征［15］，2016 年各地均有病例報告。隨著對該病的認識逐漸深入，以及各種疫苗、防控手段應用，2019—2020年該病呈下降趨勢［16］。3～5 周齡的種雞和蛋雞是心包積液-肝炎綜合征最為易感的雞群，致死率為30%～90%［17］。FAdV-4 被認為是引發(fā)心包積液-肝炎綜合征的特定病原［18］。本研究結(jié)果顯示，高劑量（108.0TCID50）的FAdV-2 經(jīng)靜脈感染也可引發(fā)心包積液-肝炎綜合征典型癥狀進而導致動物死亡，說明FAdV-2 對禽類養(yǎng)殖存在較大威脅，研發(fā)針對FAdV-2 的疫苗仍然是防控的第一選擇。

Xie 等［19］對FAdV-2 的致病性進行研究，經(jīng)肌肉注射感染3 日齡和10 日齡SPF 雞后，試驗雞雖無死亡，但出現(xiàn)明顯的體重下降。目前未有報道進行過靜脈注射感染大日齡SPF 雞的致病性研究，無法明確在靜脈感染途徑下大日齡SPF 雞感染FAdV-2 的臨床癥狀。為驗證不同攻毒途徑下FAdV-2 的致病性差異，本試驗分別通過靜脈注射和肌肉注射107.2TCID50的病毒液，發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈注射107.2TCID50劑量，6 周齡SPF 雞出現(xiàn)死亡，剖檢可見心包積液和肝炎，死亡率為20%，對未死亡雞剖檢可見明顯病理變化。

實驗動物、劑量選擇、發(fā)病癥狀通常是建立發(fā)病模型最為關(guān)鍵的參數(shù)。本研究在進行不同攻毒劑量致病性試驗設(shè)計時分別選擇108.0TCID50、107.0TCID50、106.0TCID503 個攻毒劑量，感染途徑為靜脈注射，結(jié)果表明，靜脈攻毒劑量達到107.0TCID50時，6 周齡SPF 雞出現(xiàn)黃綠色稀糞，無死亡，泄殖腔拭子攻毒后1 d 全部陽性；攻毒劑量達到108.0TCID50時，試驗雞死亡率達50%，剖檢可見明顯病理變化，泄殖腔拭子攻毒后1 d 全部陽性。

本研究結(jié)合不同攻毒途徑和不同攻毒劑量致病性分析結(jié)果，建立了FAdV-2 KM 株感染6 周齡SPF 雞的發(fā)病模型：攻毒途徑為靜脈注射，劑量為108.0TCID50，試驗雞可見黃綠色稀糞臨床癥狀，死亡率為50%，剖檢臟器可見明顯病理變化，攻毒1 d 內(nèi)泄殖腔排毒陽性。本試驗分別在感染途徑和感染劑量兩個方面進行了最優(yōu)劑量篩選，并通過動物回歸試驗驗證了發(fā)病模型的結(jié)果。該發(fā)病模型證明FAdV-2 是引發(fā)心包積液-肝炎綜合征的病原之一。

4 結(jié)論

本試驗成功分離出1 株FAdV-2 野毒株，并將其命名為KM 株，通過生物信息學軟件對其Hexon和Fiber基因進行遺傳演化分析，結(jié)果表明，KM 株與FAdV-2 GX01 株的同源性最高；此外，通過動物實驗分析KM 株在不同感染途徑和不同感染劑量下對6 周齡SPF 雞的致病性，發(fā)現(xiàn)FAdV-2 也可以引發(fā)心包積液-肝炎綜合征并導致SPF 雞死亡，同時驗證了靜脈注射途徑感染導致的發(fā)病嚴重程度高于肌肉注射。本研究建立了FAdV-2 KM 株感染SPF 雞的動物發(fā)病模型，為研究FAdV-2的免疫原性和評價疫苗效果提供參考。