馬荊鄂，曾成瑤，周 敏，譚玉文，朱學(xué)農(nóng)，饒友生，許繼國

（南昌師范學(xué)院生物技術(shù)研究院/江西省地方雞種遺傳改良重點實驗室，江西 南昌 330032）

【研究意義】寧都黃雞是江西省特優(yōu)質(zhì)型黃羽肉雞，具有“三黃”（喙、脛、羽）、“五紅”（冠、髯、臉、眼圈、耳葉）［1］、性早熟、體小、矮腳等特征，以及肉質(zhì)鮮美、口感豐富等優(yōu)點。其肌肉中的蛋白質(zhì)及必需氨基酸含量、單位面積肌纖維數(shù)量等指標(biāo)均優(yōu)于國內(nèi)多個肉雞品種［2-4］，因此深受廣大消費者喜愛，但寧都黃雞繁殖性能低，影響其產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。雞冠性狀不僅是消費者選購禽肉產(chǎn)品的重要參考因素，同時冠長、冠高與產(chǎn)蛋量、平均蛋重等繁殖性狀有顯著相關(guān)性［5-7］。因此，對雞冠性狀進行分子標(biāo)記輔助選擇，是優(yōu)質(zhì)肉雞選育的重要任務(wù)之一。【前人研究進展】雞冠是雞頭部的皮膚衍生物，缺乏羽毛，公雞雞冠十分發(fā)達，是其第二性征，是衡量雞性成熟的重要指標(biāo)［8-9］。雞冠始于上喙的一個區(qū)域，位于前鼻突的后方，由表皮、真皮和中央層組成。表皮具有角質(zhì)層和生發(fā)層，角質(zhì)層位于表皮最外層，對雞冠皮下組織起保護作用，防止皮下組織受到感染［10］。雞冠是一類變異豐富且易于觀察的外觀性狀，其相關(guān)研究多從基因的角度進行遺傳分析，目前已發(fā)現(xiàn)一些常見冠型的改變均源自基因序列變異和異位表達［11］。研究發(fā)現(xiàn)，AR、BMP2、CHADL、DRD1、EDN1、GARNL1、HSPA5、HSPA8、STK32A、PIK3R1、VIP1、VIP2和WNT9A基因具有調(diào)節(jié)雞冠生長發(fā)育的作用，是雞冠性狀選育的重要候選基因［12-16］?！颈狙芯壳腥朦c】生長激素（Growth hormone，GH）基因能夠調(diào)節(jié)糖類、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝，促進機體各個組織的生長發(fā)育［17］。GH基因序列中存在多個SNP［18-19］，部分多態(tài)性位點與開產(chǎn)體質(zhì)量、開產(chǎn)日齡以及生長性狀有顯著關(guān)聯(lián)性［20］。目前關(guān)于GH基因SNP 與寧都黃雞公雞雞冠性狀的關(guān)聯(lián)分析少見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究GH基因上游調(diào)控區(qū)域（5'-側(cè)翼區(qū)）和內(nèi)含子1 區(qū)域序列單核苷酸多態(tài)位點對寧都黃雞公雞雞冠性狀的影響，尋找地方雞種雞冠性狀選育的分子標(biāo)記。選取前期篩選的GH基因SNP，采用SAS 軟件分析雞冠性狀關(guān)聯(lián)的SNP，解析優(yōu)勢基因型，為寧都黃雞雞冠性狀的分子輔助選育積累理論基礎(chǔ)，進而為改良寧都黃雞的繁殖性狀奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的499 只4～16 周齡寧都黃雞公雞的雞冠表型數(shù)據(jù)來源于實驗室前期記錄［3］，包括7 個周齡（分別為4、6、8、10、14、16 周齡）的冠高、冠長、冠厚、肉垂長、肉垂厚和冠齒數(shù) 6 個雞冠性狀指標(biāo)。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因頻率和基因型頻率 假設(shè)基因座兩個等位基因分別為A、a，基因型為AA、Aa、aa，則基因頻率（p、q）、基因型頻率（PAA、PAa、Paa）計算公式如下：

式中，n表示該基因型個體數(shù)。

1.2.2 Hardy-weinberg 平衡狀態(tài)檢驗 對處于Hardy-weinberg 平衡狀態(tài)下的群體，可以通過χ2適合性檢驗判定。

式中，Ei為理論期望值，Oi為實際觀察值，n為等位基因數(shù)。

1.2.3 遺傳多樣性分析 采用群體雜合度（Heterozygosity,He）、群體純合度（Homozygosity,Ho）和多態(tài)信息含量（Polymorphism information content,PIC）等衡量種群內(nèi)的遺傳多樣性。

式中，Pi為任意位點上第i個等位基因頻率。

1.2.4 基因型與性狀關(guān)聯(lián)分析 以實驗室前期篩查到的GH基因5'-側(cè)翼區(qū)域和內(nèi)含子1 中的45 個SNP 為雞冠性狀候選標(biāo)記位點［21］，采用SAS8.1 軟件GLM 模塊，對所篩選SNP 與雞冠性狀進行關(guān)聯(lián)分析，采用的混合模型如下：

式中，Y為表型變異，μ為群體均值，G為基因型效應(yīng)，D為母體效應(yīng)，H為批次效應(yīng)，e為殘差效應(yīng)。

等位基因的加性效應(yīng)是用2 個純合子離差的均值計算，加性效應(yīng)=(AA-BB)/2；等位基因顯性效應(yīng)是用雜合子與2 種純合子均值的離差來計算，顯性效應(yīng)=AB-(AA+BB)/2。其中，AA、BB 和AB分別為基因型AA、BB和AB的表型最小二乘均值。顯著水平檢驗水平為雙側(cè)0.05，對于多重比較采用Bonferroni 法進行校正，在遺傳多態(tài)性關(guān)聯(lián)分析中，校正次數(shù)為同一基因中檢驗的不同SNP個數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GH 基因45 個SNP 基因頻率和基因型頻率分析

分別計算GH基因5'-側(cè)翼區(qū)域和內(nèi)含子1 中45 個SNP 的基因頻率、基因型頻率，以及He、Ho、PIC，結(jié)果顯示（表1），有14 個位點的PIC＞ 0.25；經(jīng)χ2適應(yīng)性檢驗顯示，25 個位點的χ2值沒有達到顯著水平，處于Hardy-weinberg平衡狀態(tài)。

2.2 GH 基因SNP 與雞冠性狀的相關(guān)性

采用SAS 軟件將45 個SNP 與不同雞冠性狀指標(biāo)進行關(guān)聯(lián)分析，選取P＜0.05 的位點。結(jié)果（表2）表明，13 個SNP 與7 個冠高性狀指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)，包括G1271800A、C1272225T、G1272384A、G1272611A、T1271213G、C1271211T、G1271198A、C1271195A、C1270902T、T1270805C、A1270769G、T1270451C 和G1270155A。其中，A1270769G 與7 個周齡冠高指標(biāo)均顯著關(guān)聯(lián)，G1272611A 與5 個周齡冠高指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)，T1271213G、C1270902T 分別與4個周齡冠高指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)。5 個位點與16 周齡冠高顯著關(guān)聯(lián)，分別為C1272225T、G1272384A、G1272611A、A1270769G、T1270451C。經(jīng)過Bonferroni 法校正后，A1270769G 與4 周齡冠高、C1272225T 與16 周齡冠高相關(guān)性達到顯著水平。

表2 與寧都黃雞冠高顯著相關(guān)的13 個SNP 位點P 值Table 2 P value of 13 SNPs significantly related to comb height of Ningdu yellow chickens

10 個SNP 與7 個冠長性狀顯著關(guān)聯(lián)（表3），分別為C1272225T、G1272611A、C1271211T、C1270902T、A1270769G、G1270640C、T1270578C、G1270503C、T1270451C、C1270032T。其中，C1271211T 與6 個周齡冠長指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)，C1270032T 與5 個周齡冠長指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)，G1272611A 與5 個周齡冠長指標(biāo)顯著關(guān)聯(lián)；與16 周齡冠長顯著關(guān)聯(lián)的位點為C1272225T、G1272611A、C1271211T、T1270451C。經(jīng) 過Bonferroni 法校正后，G1272611A 與16 周齡冠長的相關(guān)性達到顯著水平。

表3 與寧都黃雞冠長顯著相關(guān)的10 個SNP 位點P 值Table 3 P value of 10 SNPs significantly related to comb length of Ningdu yellow chickens

表4 與寧都黃雞其他雞冠性狀顯著相關(guān)的4 個SNP 位點P 值Table 4 P value of 4 SNPs significantly related to other comb traits of Ningdu yellow chickens

位點 C1271836T 分別與8 周齡冠厚、10 周齡肉垂長顯著關(guān)聯(lián)，T1271646G 與16 周齡肉垂厚顯著關(guān)聯(lián)，C1272225T 與4 周齡冠厚顯著關(guān)聯(lián)，A1272784G與16 周齡肉垂厚顯著關(guān)聯(lián)（表 4）。經(jīng)過 Bonferroni法校正后，均未達到顯著水平。此外，供試的 45個 SNP 與冠齒數(shù)性狀均無顯著關(guān)聯(lián)。

2.3 A1270769G、G1272611A 位點不同基因型與寧都黃雞冠高性狀的相關(guān)性

分析寧都黃雞公雞GH基因A1270769G、G1272611A 兩個位點不同基因型與7 個周齡冠高性狀的相關(guān)性，并計算其加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)值（表5）。多重比較分析發(fā)現(xiàn)，A1270769G 位點的不同基因型中，AA 型個體的4、6、8、10、14、16 周齡冠高顯著低于AG 和GG 型個體，12周齡冠高的AA 型個體顯著低于AG 型個體；從位點對冠高性狀的作用方式看，該位點主要以加性方式起作用，GG 型更加有利。多重比較分析發(fā)現(xiàn)，G1272611A 位點的不同基因型中，GG 型個體的5 個周齡冠高均顯著高于GA 型個體。

表5 GH 基因 A1270769G、G1272611A 位點與寧都黃雞冠高（mm）性狀的相關(guān)性Table 5 Correlation between A1270769G,G1272611A in GH gene and comb height (mm) of Ningdu yellow chickens

2.4 C1271211T、G1272611A 位點不同基因型與寧都黃雞冠長性狀的相關(guān)性

分析寧都黃雞公雞GH基因C1271211T、G1272611A 兩個位點與7 個周齡冠長性狀的相關(guān)性，并計算其加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)值（表6）。多重比較分析發(fā)現(xiàn)，C1271211T 位點的不同基因型中，CC 型個體的4、6、8、10、12、16 周齡冠長均顯著高于CT 和TT 型個體，14 周齡冠長的CC 型個體只顯著高于CT 型個體；從該位點對于4、6、8、10、12、14、16 周齡冠長的作用方式看，該位點加性方式起作用，CC 型更加有利。G1272611A 位點的不同基因型中，GG型個體的8、10、12、14、16 周齡冠長顯著高于GA 型個體。

表6 GH 基因C1271211T、G1272611A 位點與寧都黃雞冠長（mm）性狀的相關(guān)性Table 6 Correlation between C1271211T and G1272611A in GH gene and comb length (mm) of Ningdu yellow chickens

3 討論

本研究采用前期記錄的寧都黃雞公雞生長早期（4～16 周齡）的冠高、冠長、冠厚、肉垂長、肉垂厚和冠齒數(shù)性狀數(shù)據(jù)，與GH基因5'-側(cè)翼區(qū)域和內(nèi)含子1 區(qū)域的SNP 進行關(guān)聯(lián)性分析，首先分析了與不同周齡雞冠性狀分別關(guān)聯(lián)的SNP，發(fā)現(xiàn)較少位點與雞冠厚、肉垂長和肉垂厚存在關(guān)聯(lián)性，而與冠長和冠高關(guān)聯(lián)位點較多，推測GH基因主要調(diào)控雞冠的長度和高度發(fā)育；進一步選取與5 個連續(xù)周齡冠長或冠高性狀指標(biāo)均關(guān)聯(lián)且與16 周齡顯著關(guān)聯(lián)的位點進行不同基因型多重比較分析，發(fā)現(xiàn)3 個位點對應(yīng)的優(yōu)勢基因型分別為A1270769G 位點GG 基因型、C1271211T 位點CC 基因型、G1272611A 位點GG 基因型。經(jīng)過Bonferroni 法校正后，A1270769G 與4 周齡冠高、G1272611A 與16 周齡冠長相關(guān)性達到顯著水平。Hardy-weinberg 檢驗結(jié)果表明，A1270769G、C1271211T 均處于平衡狀態(tài)，而G1272611A 未達到平衡狀態(tài)。綜上，A1270769G 可為雞冠性狀的潛在關(guān)鍵候選分子標(biāo)記。

本課題組前期研究時發(fā)現(xiàn)，G1272611A 位點與16 周齡肉雞的睪丸性狀存在顯著關(guān)聯(lián)［3］，表明位點G1272611A 既與雞冠性狀又與睪丸性狀顯著關(guān)聯(lián)，推測該位點為調(diào)控雞冠性狀和睪丸性狀的功能位點，對該位點不同基因型對應(yīng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子類型進行分析發(fā)現(xiàn)，GG 基因型對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子主要有p53、myogenin，AA 基因型對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子主要為En-1、C/EBPalpha［21］，雞冠性狀的優(yōu)勢基因型為GG，推測轉(zhuǎn)錄因子p53、myogenin 更有利于雞冠發(fā)育通路的激活，這些位點的調(diào)控功能還有待進一步驗證。綜合分析，G1272611A 可作為地方雞繁殖性狀選育的重要候選標(biāo)記，可進一步開展大群體驗證。本研究還發(fā)現(xiàn)，C1272225T 與12、14、16 周齡的冠高和冠長均顯著相關(guān)，且該位點與16 周齡冠高的相關(guān)性經(jīng)過Bonferroni 法校正后達到顯著水平；C1271211T與6 個周齡的冠長顯著關(guān)聯(lián)，而這2 個位點也與16 周齡睪丸性狀顯著關(guān)聯(lián)，說明這些位點變異可能影響GH基因表達，進而調(diào)控雞冠和睪丸發(fā)育。

在家禽生產(chǎn)中，雞冠性狀是遺傳育種選育中重要的表型性狀，與重要的經(jīng)濟性狀如開產(chǎn)性狀、睪丸重等有密切聯(lián)系［13，20］。雞冠是家禽的第二性征，生長發(fā)育受遺傳因素、激素及光照環(huán)境等影響。睪酮的分泌影響雞冠和肉垂的發(fā)育［22］，其與雞冠表皮層和真皮層的受體結(jié)合影響雞冠發(fā)育。雞冠的的生長狀況在一定程度上反映雞的性功能是否優(yōu)良［13，23-24］。韋金兌［25］發(fā)現(xiàn)清遠麻雞和廣西麻雞各冠型各日齡公雞的冠高、冠長和肉垂長之間均呈較高程度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)在0.498～0.763 之間。肖?。?6］對清遠麻公雞性早熟進行研究，發(fā)現(xiàn)雞冠和睪丸的生長發(fā)育有很大的關(guān)聯(lián)性。周敏等［3］、王琨等［9］和姬杰菲等［27］的研究驗證了性成熟前雞冠與公雞睪丸性狀、母雞開產(chǎn)性狀具有較強的相關(guān)性。通過這些結(jié)果推測，以冠高或冠長為參數(shù)進行分子選育時可達到改良雞繁殖性能性狀的效果。而本研究發(fā)現(xiàn)的G1272611A 位點與冠高、冠長性狀、睪丸性狀均顯著關(guān)聯(lián)，進一步體現(xiàn)了雞冠、睪丸性狀的相關(guān)性，可能是因為雞冠、睪丸的發(fā)育過程受到同一基因的調(diào)控。雞冠是一種復(fù)雜性狀，由多基因共同調(diào)控，目前已知雞冠性狀候選基因有AR、BMP2、CHADL、DRD1、EDN1、GARNL1、HSPA5、HSPA8、STK32A、PIK3R1、VIP1、VIP2和WNT9A等［12-17］，GH基因序列變異關(guān)聯(lián)雞冠性狀的挖掘?qū)榻馕鲭u冠性狀的多基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新的參考。

4 結(jié)論

GH基因可作為調(diào)控雞冠長度和高度發(fā)育的重要候選基因，位于該基因5'-側(cè)翼的G1272611A 位點及位于內(nèi)含子1 區(qū)域的C1271211T、A1270769G位點與寧都黃雞冠長或冠高性狀顯著關(guān)聯(lián)。A1270769G、G1272611A 均 對8、10、12、14、16周齡冠高性狀指標(biāo)的影響達到顯著水平（P＜ 0.05），這兩個位點可作為冠高性狀的分子輔助選育候選分子標(biāo)記；G1272611A、C1271211T 均對8、10、12、14、16 周齡冠長性狀的影響達到顯著水平（P＜ 0.05），這兩個位點可作為冠長性狀的分子輔助選育候選分子標(biāo)記。G1272611A 位點與5 個連續(xù)周齡冠長或冠高性狀指標(biāo)均關(guān)聯(lián)，可作為調(diào)控雞冠性狀的候選分子標(biāo)記。