易雪倩,何 花,曾 羅,舒為杰,楊曉琛

(吉首大學(xué) 生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 湖南吉首 416000)

花是被子植物有性繁殖的重要器官,花部特征被認(rèn)為是對不同傳粉媒介的適應(yīng),是植物與環(huán)境相互作用,長期進(jìn)化的產(chǎn)物[1],多樣性極為豐富且相對穩(wěn)定[2]。因此,花部形態(tài)特征常被用作被子植物分類和系統(tǒng)演化的重要依據(jù)[3]。

依據(jù)形態(tài)學(xué)對植物的分類研究多以葉形態(tài)[4]、花部形態(tài)[5]、花粉形態(tài)[6]、果實(shí)或種子形態(tài)[7-8]等性狀作為分類依據(jù),利用上述性狀的種間差異將物種進(jìn)行區(qū)分。這類研究的采樣主要基于野外自然居群[9-10]或同質(zhì)園栽培居群[11-12]。基于野外采樣所觀測性狀的差異是建立在植物所在生境與遺傳物質(zhì)共同作用的基礎(chǔ)之上,會(huì)導(dǎo)致形態(tài)差異的來源不明確。然而,同質(zhì)園實(shí)驗(yàn)(common garden experiment)是將不同生境居群的個(gè)體或不同物種引種栽培在環(huán)境因素相對一致的同一園地內(nèi)[13-14],可以排除環(huán)境因素對表型變異的影響,從而單獨(dú)考察遺傳因素的影響;如果形態(tài)差異經(jīng)同質(zhì)園栽培后仍然存在,則可以認(rèn)定這種差異來源于遺傳分化[15]。

淫羊藿屬(Epimedium)為小檗科(Berberidaceae)最大的草本屬,全世界約68種,其中85%以上的物種為中國特有[16-17]。該屬植物最原始種類出現(xiàn)在東亞,中國為該屬植物的多樣性中心和地理分布中心,具有顯著資源優(yōu)勢[18-19]。淫羊藿具有增強(qiáng)腎功能、強(qiáng)健筋骨、祛風(fēng)除濕的功效,在中國入藥歷史悠久[20]。

Stearn[18]根據(jù)葉和花的形態(tài)、地理分布和染色體的c帶特征,將淫羊藿分為2個(gè)亞屬、4個(gè)組和4個(gè)系,是目前較為廣泛認(rèn)可的淫羊藿屬分類學(xué)專著,但是該屬屬下分類和種的范圍確定十分困難。

因此,分類學(xué)家們一直致力于該屬植物各類性狀的分析研究,以求更好解決其分類鑒定問題。花粉形態(tài)[21]、核型分析[22]、化學(xué)成分[23]都曾用于淫羊藿屬分類學(xué)研究,但結(jié)果均不理想,不能很好地區(qū)分淫羊藿屬內(nèi)物種。而基于ITS序列[24-25]、atpB-rbcL序列[26]、matK序列[27]以及簡化基因組序列[28]的系統(tǒng)發(fā)育研究也不能完全將淫羊藿屬植物進(jìn)行分類。

先前淫羊藿屬基于形態(tài)的分類主要以花大小、花瓣長短、花序梗有無以及花莖上葉的形態(tài)、數(shù)目為依據(jù),缺乏對萼片、雌雄蕊等詳細(xì)花部性狀分類意義的探討。

因此,為了明確淫羊藿屬物種之間的分類關(guān)系,本研究以同質(zhì)園栽培的21種淫羊藿為研究材料,通過觀測這些物種的花部特征等性狀,旨在回答以下問題:(1)基于同質(zhì)園栽培下的淫羊藿屬植物的花部特征在該屬中是否具有分類學(xué)意義?(2)哪些特征在分類中起主要作用?

對上述問題的回答不僅能為淫羊藿屬植物的分類、系統(tǒng)演化關(guān)系和藥材鑒定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),還能為淫羊藿種質(zhì)資源的保護(hù)與開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究地點(diǎn)與材料

本研究所有觀測均在湖南省湘西州吉首市的吉首大學(xué)淫羊藿屬植物種質(zhì)資源圃(23°17′92″N,104°80′36″E,海拔195 m)中進(jìn)行。21種淫羊藿于2014-2015年從野外原生境移栽至資源圃,各物種在資源圃中長勢良好,每年均能正常開花結(jié)實(shí)。研究物種的具體信息見表1。

表1 試驗(yàn)物種及其產(chǎn)地信息[18,28]

1.2 花部特征觀測

于各物種的盛花期,在花序的不同部位隨機(jī)標(biāo)記20朵即將開放的花,記錄這些花開放及凋謝的時(shí)間,計(jì)算出物種單花壽命(以花冠打開為花開放標(biāo)志,以花冠脫落為花凋謝標(biāo)志)。

每物種從花序的不同部位隨機(jī)采集20朵完全開放的花,對22個(gè)性狀指標(biāo)進(jìn)行觀測:用精度為0.01 mm的數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量花梗長、花直徑、內(nèi)萼片長寬、蜜距長、蜜距口徑、雌雄蕊長度、花藥長、花柱長、柱頭和蜜距口的高度差(以柱頭伸出花冠記為“+”,柱頭隱藏于花冠記為“-”)、花藥與柱頭的高度差等特征(部分觀測部位說明見圖1);同時(shí)觀察以下6個(gè)質(zhì)量性狀:花序類型、有無蜜距、花瓣顏色、內(nèi)萼片顏色、內(nèi)萼片與花瓣相對長度和花粉顏色;在體式顯微鏡(Motic SMZ-171, MOTIC Inc., China)下對子房進(jìn)行解剖統(tǒng)計(jì)胚珠數(shù);在光學(xué)顯微鏡(Lecia D6200, LECIA Inc., Gremany)下統(tǒng)計(jì)各物種花粉粒數(shù)量并測量水合花粉粒直徑。

A. 小花類群的花;B. 大花類群的花。1. 蜜距口徑;2. 蜜距長;3. 內(nèi)萼片長;4. 內(nèi)萼片寬;5. 柱頭和蜜距口的高度差;6. 雄蕊長;7. 花藥與柱頭的高度差;8. 花藥長。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析與比較均在SPSS 26.0 (Statistical Product and Service Solutions, IBM Inc., New York, USA)中進(jìn)行。測量得到的花部特征數(shù)值通過描述統(tǒng)計(jì)進(jìn)行初步分析;而后用廣義線性模型(generalized linear models)中正態(tài)分布(normal distribution)恒等關(guān)聯(lián)函數(shù)(identity-link function)分析比較21個(gè)物種種間花部特征的差異。

最后,對22個(gè)花部特征性狀進(jìn)行聚類分析:數(shù)量性狀以原始數(shù)據(jù)的平均數(shù)進(jìn)行直接賦值,質(zhì)量性狀根據(jù)每一性狀的不同類型進(jìn)行編碼(表2)。

表2 淫羊藿屬植物花部特征質(zhì)量性狀編碼

聚類分析時(shí)首先要數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,消除不同量綱對數(shù)據(jù)分析產(chǎn)生的影響,再對標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)計(jì)算分類單位之間的平均歐式距離系數(shù),然后采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析,最后作出分類單位聚類結(jié)果的樹形圖,即親緣關(guān)系表征圖。主成分分析要在標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)上計(jì)算分類單位之間的相關(guān)系數(shù),然后求出相關(guān)系數(shù)的特征值和特征向量,最后得到特征性狀在前6主成分中的負(fù)荷量。

本研究依據(jù)所觀察到的花部形態(tài)特征編寫了21種淫羊藿屬植物分種檢索表。由于實(shí)驗(yàn)資源圃中無距淫羊藿、天門山淫羊藿、巫山淫羊藿、偏斜淫羊藿、小葉淫羊藿的居群數(shù)量較少,在親自測得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)之上,參考了中國植物志(http://www.iplant.cn/frps)、中國數(shù)字植物標(biāo)本館(https://www.cvh.ac.cn/)以及相關(guān)文獻(xiàn)中對以上物種的特征描述?；诖?也對其他物種的特征值進(jìn)行了校正,確保檢索表的準(zhǔn)確性[29-32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 花部特征

同質(zhì)園栽培的21種淫羊藿的花壽命均存在顯著差異(P<0.01):單花壽命2～7 d,平均(3.6±0.22) d。其中直距淫羊藿花壽命最短,僅(2.10±0.10) d,湖南淫羊藿花壽命最長:(6.40±0.40) d。淫羊藿花兩性,圓錐花序或總狀花序,花直徑5.14～43.46 mm,內(nèi)輪萼片花瓣?duì)?花瓣4,特化成蜜距(無距淫羊藿除外)(圖2),花瓣顏色和內(nèi)萼片顏色多變(圖3、表3)。

A.黔嶺淫羊藿;B.短莖淫羊藿;C.湖南淫羊藿;D.竹山淫羊藿;E.直距淫羊藿;F.巫山淫羊藿;G.紫距淫羊藿;H.綠藥淫羊藿;I.木魚坪淫羊藿;J.保靖淫羊藿;K.金城山淫羊藿;L.無距淫羊藿;M.青城山淫羊藿;N.川鄂淫羊藿;O.柔毛淫羊藿;P.星花淫羊藿;Q.小葉淫羊藿;R.氈毛淫羊藿;S.偏斜淫羊藿;T.普定淫羊藿;U.天門山淫羊藿。

橫向距離表示差異的大小,樹狀結(jié)構(gòu)則表示分類情況,右側(cè)系依據(jù)Stearn[18]的分類系統(tǒng)。

表3 21種淫羊藿質(zhì)量性狀編碼

本研究中21種淫羊藿根據(jù)內(nèi)萼片與花瓣的相對長度[33]可分成大花類型10種(花瓣遠(yuǎn)大于內(nèi)輪萼片,花直徑一般大于1 cm);小花類型11種(花瓣小于內(nèi)輪萼片,花直徑一般小于1 cm)。物種間各花部特征均存在顯著差異(P<0.01,表4a,b)。其中,花直徑、內(nèi)萼片長寬、蜜距長、雌蕊長、柱頭和蜜距口的高度差、胚珠數(shù)、花粉量、花粉直徑等特征種間差異較大。

表4 21種淫羊藿花部特征測量參數(shù)(a)

2.2 主成分分析

在第1主成分中,花直徑、內(nèi)萼片長、花藥長、胚珠數(shù)和花粉直徑等性狀負(fù)載值的絕對值都在0.80以上,信息負(fù)荷量最大,在本屬分類中起主要作用(表5)。在第2主成分中,柱頭和蜜距口的高度差和內(nèi)萼片與花瓣相對長度等性狀負(fù)載值的絕對值都在0.70以上,信息負(fù)荷量較大,對分類較為重要。在第3至第6主成分中,花瓣顏色、有無蜜距和花序類型等性狀負(fù)載值的絕對值在0.59以上,在分類中也有一定的作用。主成分分析結(jié)果顯示:前3個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為66.969%,直到第6個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到85.631%,增值速度適中。

表5 淫羊藿屬植物形態(tài)性狀主成分負(fù)荷值

2.3 聚類分析

21種淫羊藿的系統(tǒng)聚類圖表明在遺傳距離為14的時(shí)候,21種淫羊藿根據(jù)有性繁殖特征分類,分為4支(圖3)。分支 1星花淫羊藿、柔毛淫羊藿、普定淫羊藿、小葉淫羊藿、氈毛淫羊藿、偏斜淫羊藿聚為一支,主要特征為花小,花瓣短于內(nèi)輪萼片,囊狀距或兜狀距,花直徑一般小于1 cm。分支 2直距淫羊藿、綠藥淫羊藿、木魚坪淫羊藿、保靖淫羊藿、金城山淫羊藿、黔嶺淫羊藿、竹山淫羊藿、天門山淫羊藿、紫距淫羊藿、巫山淫羊藿、湖南淫羊藿、短莖淫羊藿聚為一支,均為大花,其主要特征花瓣遠(yuǎn)長于內(nèi)輪萼片,長距狀,花直徑一般大于1 cm。分支 3無距淫羊藿單獨(dú)為一支,花小,花瓣扁平,花瓣沒有特化形成蜜距,花直徑(11.85±0.55) mm。分支4川鄂淫羊藿、青城山淫羊藿聚為一支,花絲伸長明顯,可達(dá)10 mm,花蜜距呈鉆狀,內(nèi)輪萼片長于花瓣,花直徑14～18 mm。

淫羊藿屬21種植物花部特征分種檢索表

3 討 論

物種間花部形態(tài)的變異是導(dǎo)致被子植物多樣性的關(guān)鍵因素[34-35],因此花部特征常被用作被子植物分類和系統(tǒng)演化的重要依據(jù)[36],具有相近親緣關(guān)系的屬、種往往具有相似的花部形態(tài)特征[37]。在包含較多觀賞和藥用植物的云實(shí)亞科(Caesalpinioideae)中,花托、花萼、花冠、雄蕊、雌蕊等花部特征的性狀是重要的分類依據(jù)[38];對蓼科頭狀蓼組(Sect.Cephalophilon)的19個(gè)分類群和與冰島蓼屬(Koenigia)相關(guān)的4個(gè)分類群的花形態(tài)進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)花特征的大小范圍與分類群有關(guān),花被片、雄蕊、花柱等特征是關(guān)鍵的分類依據(jù)[39]。同質(zhì)園條件下21種淫羊藿的花壽命及花部特征均存在顯著差異,尤其是花瓣、內(nèi)萼片的形態(tài)及顏色。在前三主成分中,花直徑、內(nèi)萼片長、花藥長、胚珠數(shù)和花粉直徑等性狀在本屬分類中起主要作用。從聚類分析結(jié)果來看,在遺傳距離為14時(shí),21種淫羊藿屬植物基于花部特征構(gòu)建的聚類樹形成穩(wěn)定的4個(gè)分支,且具有較好的區(qū)分度。這表明淫羊藿屬植物花部特征具有分類學(xué)意義,能通過花部特征將物種進(jìn)行有效區(qū)分。

Stearn[18]將淫羊藿分為2亞屬4組4系,其中中國組(Sect.Diphyllon)中種類最多,均來自中國,此組組下分為4個(gè)系:無距系(Ser.Campanulatae)、寶興系(Ser.Davidianae)、長距系(Ser.Dolichocerae)和小花系(Ser.Brachycerae)。本實(shí)驗(yàn)的淫羊藿材料均來自中國組(Sect.Diphyllon)?；谕|(zhì)園栽培的21種淫羊藿花部特征的聚類分析結(jié)果基本符合Stearn基于花形態(tài)學(xué)對中國組淫羊藿的分類,但不完全支持其對中國組4系的劃分。本研究中分支 1星花淫羊藿、柔毛淫羊藿等花形態(tài)較小的物種聚為一支(屬于Brachycerae系),而在Stearn的分類系統(tǒng)中屬于Dolichocerae系的天門山淫羊藿在本試驗(yàn)與Brachycerae系物種聚為一支。天門山淫羊藿經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)是淫羊藿屬植物大花和小花類群的一個(gè)中間過渡形態(tài),形態(tài)變異巨大,可能是保靖淫羊藿的特殊生態(tài)類型[40];以往對淫羊藿屬植物的分類通常基于臘葉標(biāo)本進(jìn)行描述,但該屬植物花形態(tài)較為立體,制成標(biāo)本后形態(tài)變形嚴(yán)重;此外標(biāo)本數(shù)量有限,對物種性狀的描述并不能全面概括。分支2中出現(xiàn)了Stearn系統(tǒng)中Davidianae系和Dolichocerae系的物種嵌套,該分枝的物種均屬大花類群,具長距,且花瓣長于內(nèi)萼片。但本研究結(jié)果與李超等[41]和張成[28]基于形態(tài)特征構(gòu)建的淫羊藿屬下類群的分類關(guān)系的結(jié)果一致,因此Stearn劃分的Davidianae系和Dolichocerae系中部分物種分類位置有待商榷。分支4中川鄂淫羊藿、青城山淫羊藿聚為一支,沒有與Brachycerae系的其他物種聚在一起。盡管上述2種淫羊藿具有內(nèi)萼片長于花瓣的與小花類群相似的特征,但其花直徑明顯大于典型的小花類群物種介于大花類群和小花類群之間,且花絲明顯伸長,長度可達(dá)10 mm。這與張成[28]基于形態(tài)特征構(gòu)建的聚類關(guān)系結(jié)果一致,建議以后的分類學(xué)處理考慮將這一支成立為新系。

除了通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類外,基于分子手段的系統(tǒng)發(fā)育分析也致力于解決淫羊藿屬的分類問題?；贗TS2序列對中國組15種淫羊藿的研究表明:該序列較為保守,趨異值低,因此ITS2不適合單獨(dú)作為條形碼用于該屬系統(tǒng)發(fā)育分析[25]。Zhang等[26]通過對38種淫羊藿植物的ITS和葉綠體atpB-rbcL 2個(gè)序列的研究,認(rèn)為雖然中國組類群(Sect.Diphyllon)與其他地理區(qū)域類群(Sect.Macroceras、Polyphyllon和Epimedium)有效區(qū)分,但在中國組的各系之間相互嵌套。類似的結(jié)果也出現(xiàn)于近年來的多項(xiàng)研究中,不論是基于核糖體DNA序列[24]、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)數(shù)據(jù)[28],還是質(zhì)體基因組數(shù)據(jù)[42],亦或是基于擴(kuò)增片段長度多態(tài)性[43]等分子標(biāo)記構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,均能強(qiáng)烈支持中國組(Sect.Diphyllon)和大花組(Sect.Macroceras)的姊妹關(guān)系,但不能完全支持Stearn對中國組4系的劃分[18],特別是寶興系(Ser.Davidianae)、長距系(Ser.Dolichocerae)的物種嵌套在各分支中,這與本研究基于同質(zhì)園栽培的21種淫羊藿花部特征的分類結(jié)果一致。出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能與淫羊藿屬中國組分布區(qū)域的輻射型進(jìn)化有關(guān),其祖先可能經(jīng)歷了快速的物種形成[42]。