蔣曉宏 ,霍宗利 ,朱 峰 ,周永林 ,沈 菲*

(1.拉薩市疾病預(yù)防控制中心,拉薩 850000;2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心,南京 210000)

糌粑是藏族人民的傳統(tǒng)食品,它是以產(chǎn)于西藏、青海、甘肅等高寒地區(qū)的青稞為原料,經(jīng)除雜、清洗、晾干、翻炒、磨粉等工藝制成的粉末狀食物,也被稱(chēng)為青稞炒面[1]。糌粑擁有非常豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,富含蛋白質(zhì)、糖、脂肪、纖維素、氨基酸和礦物質(zhì),缺少瓜果蔬菜的高寒地區(qū)的人民經(jīng)常食用,可避免營(yíng)養(yǎng)缺乏[2-4]。與全國(guó)其他地區(qū)的糧食產(chǎn)業(yè)相比,糌粑產(chǎn)業(yè)相對(duì)比較落后,管理、生產(chǎn)體系尚未規(guī)范,生產(chǎn)過(guò)程中可能存在產(chǎn)品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。糌粑產(chǎn)品中含有約6%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的水分,其在溫度和濕度均較高的環(huán)境存放,極易吸潮結(jié)塊,促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng),進(jìn)而變質(zhì),影響?hù)佤蔚钠焚|(zhì)[5-6]。

真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,具有致癌、致畸、致突變的特性,易導(dǎo)致急性或慢性中毒。迄今為止,已有超過(guò)500種真菌毒素被發(fā)現(xiàn),研究主要聚焦于二十多種對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物有明確毒性作用的化合物。根據(jù)真菌毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其與人類(lèi)和動(dòng)物健康的相關(guān)性,可將其劃分為主要真菌毒素(包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、單端孢霉烯族毒素、伏馬菌素、棒曲霉素和玉米赤酶烯酮類(lèi)毒素)、新興真菌毒素[鏈格孢霉毒素和新興鐮刀菌毒素(白僵菌素和恩鐮孢菌素)]和其他真菌毒素等[7]。這些毒素可通過(guò)多種方式污染食品,如直接感染谷類(lèi)等農(nóng)作物,污染原料導(dǎo)致咖啡、果汁等加工食品受到污染,飼料中的毒素遷移導(dǎo)致肉、蛋、奶等動(dòng)物源性食品污染等[8]。

糌粑作為藏族獨(dú)有的傳統(tǒng)主食,在原料生長(zhǎng)與采收、成品加工、貯藏及運(yùn)輸中都易受到產(chǎn)毒真菌的侵染,并且可能被多種產(chǎn)毒真菌同時(shí)侵染[9],但目前鮮有相關(guān)報(bào)道,因此有必要建立糌粑中真菌毒素的檢測(cè)方法。近年來(lái),QuECh ERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)由于其高效、簡(jiǎn)便和環(huán)保的特點(diǎn),能夠有效地提取和凈化基質(zhì)中多種真菌毒素,廣泛應(yīng)用于食品中真菌毒素的分析[10-13]。

本工作以Qu ECh ERS 作為樣品前處理方法,選取了植物源性食品中主要真菌毒素污染物[脫氧雪腐鐮刀菌烯醇類(lèi)、黃曲霉毒素類(lèi)、伏馬毒素類(lèi)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、雜色曲霉毒素(ST)等]作為研究對(duì)象,提出了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定糌粑中15種真菌毒素含量的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-30A 型超高效液相色譜儀;QTRAP 5500型三重四極桿質(zhì)譜儀;2-16KL 型臺(tái)式冷凍離心機(jī);1-14型臺(tái)式離心機(jī);OA-SYS型氮吹儀;Vortex-Genie 2型渦旋混合器。

單標(biāo)準(zhǔn)溶液:脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-ACDON)、3-乙?；撗跹└牭毒┐?3-ACDON)、HT-2 毒素(HT-2)、T-2 毒素(T-2)、ZEN 標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度均為100 mg·L－1;伏馬毒素B1(FB1)、伏馬毒素B2(FB2)、伏馬毒素B3(FB3)、ST 標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度均為50 mg·L－1;OTA 為10 mg·L－1,黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素B1(AFB1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度均為2 mg·L－1,黃曲霉毒素G2(AFG2)、黃曲霉毒素B2(AFB2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度均為0.5 mg·L－1。使用時(shí)用乙腈稀釋至所需質(zhì)量濃度。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別取適量的15種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,用乙腈稀釋成DON、15-ACDON、3-ACDON、HT-2的質(zhì)量濃度為1 mg·L－1,其余真菌毒素質(zhì)量濃度為0.1 mg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于－20 ℃保存。

硫酸鈉、氯化鈉、硫酸鎂均為分析純;乙腈、甲酸均為色譜純;試驗(yàn)用水為質(zhì)譜級(jí)。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);流量0.3 mL·min－1;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10μL;流動(dòng)相A 為0.2%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B 為乙腈。梯度洗脫程序:0～1.5 min時(shí),B為5%;1.5～4.5 min時(shí),B 由5%升至23%;4.5～11.0 min 時(shí),B 由23% 升至50%,保持3.0 min;14.0～16.0 min時(shí),B 由50%升至100%;16.0～16.1 min 時(shí),B 由100%跳轉(zhuǎn)至5%,保持0.9 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,離子源溫度550 ℃,正離子(ESI＋)、負(fù)離子(ESI－)模式同時(shí)掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;毛細(xì)管電壓5 500 V(ESI＋模式)/－4 500 V(ESI－模式);氣簾氣流量31.8 L·min－1,霧化氣流量8.4 L·min－1,輔助氣流量6.8 L·min－1。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1,其中“*”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g(精確至0.001 g)均質(zhì)過(guò)的糌粑粉末,置于50 mL 離心管中,加入5 mL 水和10 mL含10%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的乙腈溶液,渦旋振蕩提取10 min,加入鹽析劑(4 g硫酸鈉,1 g氯化鈉),渦旋振蕩10 min,以轉(zhuǎn)速10 000 r·min－1離心10 min。取1.5 mL上清液,置于裝有150 mg硫酸鎂、100 mg C18、100 mgN-丙基乙二胺(PSA)的2 mL凈化管中,渦旋振蕩5 min,以轉(zhuǎn)速14 800 r·min－1離心10 min。取0.8 mL 上清液,氮吹至近干,用0.4 mL 20%(體積分?jǐn)?shù))乙腈溶液復(fù)溶,渦旋混合5 min,過(guò)0.22μm 濾膜后,按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器工作條件的選擇

采用針泵方式進(jìn)樣,將200μg·L－1單標(biāo)準(zhǔn)溶液以7μL·min－1的流量注入質(zhì)譜儀,在ESI＋、ESI－模式下,分別進(jìn)行Q1母離子和Q3子離子掃描,ZEN 在ESI－模式下響應(yīng)高,其他14種真菌毒素均在ESI＋模式下響應(yīng)較好,分別選取最合適的離子對(duì),優(yōu)化最優(yōu)的去簇電壓、碰撞能量等參數(shù),得到最佳質(zhì)譜參數(shù),具體見(jiàn)1.2.2節(jié)。

試驗(yàn)考察了不同水相[0.1%(體積分?jǐn)?shù))氨水、0.2%甲酸溶液、水]和不同有機(jī)相(甲醇、乙腈)組合的流動(dòng)相對(duì)化合物響應(yīng)值和分離度的影響。結(jié)果表明,對(duì)于含有乙酰氧基團(tuán)的真菌毒素,乙腈-水體系的洗脫效果和化合物的響應(yīng)均好于甲醇-水體系,因?yàn)橐阴Ｑ躅?lèi)化合物在甲醇溶劑中不穩(wěn)定[14]。由于待測(cè)真菌毒素多數(shù)是ESI＋模式掃描,甲酸可增強(qiáng)ESI＋模式下大部分真菌毒素的離子化效率,提高目標(biāo)化合物的響應(yīng),雖然甲酸對(duì)ESI－下ZEN 的靈敏度略有影響,但是能滿(mǎn)足檢測(cè)需求。綜合考慮,試驗(yàn)選用0.2%甲酸溶液-乙腈體系為流動(dòng)相。

在優(yōu)化的儀器工作條件下,得到的提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 15種真菌毒素的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 15 mycotoxins

2.2 提取劑的選擇

試驗(yàn)考察了甲醇、乙腈作為提取劑時(shí)目標(biāo)物的提取效率。結(jié)果表明:甲醇極性小,溶解性強(qiáng),提取時(shí)基質(zhì)效應(yīng)較為明顯,且對(duì)DON 的提取效率影響較大;乙腈的選擇性更好,可有效減少脂肪、色素等雜質(zhì)的提取。綜合考慮,試驗(yàn)選擇乙腈作為提取劑。

由于伏馬毒素類(lèi)和赭曲霉毒素類(lèi)真菌毒素具有羧基,水溶性強(qiáng),對(duì)酸具有敏感性,加入甲酸可增強(qiáng)其穩(wěn)定性,提高提取效率,因此試驗(yàn)進(jìn)一步比較了乙腈、含1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的乙腈溶液、含5%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的乙腈溶液、含10%甲酸的乙腈溶液對(duì)真菌毒素回收率的影響。結(jié)果表明:使用乙腈提取時(shí),FB1、FB2、FB3和OTA 的回收率均低于5.0%,其余真菌毒素的回收率在50.0%～80.0%內(nèi);使用含1%甲酸的乙腈溶液提取時(shí),OTA的回收率提高至30.0%,FB1、FB2、FB3的回收率均未變化,其余真菌毒素的回收率在60.0%～85.0%內(nèi);使用含5%甲酸的乙腈溶液提取時(shí),FB1、FB2、FB3的回收率在25.0%～45.0%內(nèi),OTA 的回收率提高至90.0%,其余真菌毒素的回收率均在75.0%以上;使用含10%甲酸的乙腈溶液提取時(shí),15種真菌毒素的回收率均大于75.0%。因此,試驗(yàn)選擇含10%甲酸的乙腈溶液作為提取劑。

2.3 凈化劑及其用量的選擇

C18主要用于去除脂質(zhì)等非極性雜質(zhì);PSA 用于消除各種有機(jī)酸、色素、糖,并同時(shí)消除部分水;石墨化碳黑(GCB)可去除類(lèi)甾體、葉綠素等色素,但GCB具有強(qiáng)吸附性,在使用時(shí)部分被測(cè)物不易洗脫。試驗(yàn)探討了不同用量的PSA、C18和GCB 對(duì)15種真菌毒素回收率的影響,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。其中,凈化劑中硫酸鎂的主要作用是吸附水分,對(duì)目標(biāo)化合物的回收不會(huì)有影響,故此處不再討論硫酸鎂的用量。

固定PSA、C18用量均為100 mg,考察了不添加GCB以及GCB用量為5,10,20 mg時(shí)對(duì)真菌毒素回收率的影響,如圖2所示。

圖2 GCB用量對(duì)15種真菌毒素回收率的影響Fig.2 Effect of GCB amount on the recovery of 15 mycotoxins

由圖2可知:GCB的用量對(duì)部分真菌毒素的回收率影響很大。相較于不添加GCB,GCB 用量為5 mg時(shí)ST 的回收率下降了50%;GCB用量增加至20 mg 時(shí)ST 的回收率低于5.0%,AFB1、AFB2、OTA 的回收率也明顯下降。GCB對(duì)具有平面分子結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)(如甾醇和葉綠素等)吸附效果好,對(duì)具有平面分子結(jié)構(gòu)或不完全平面分子結(jié)構(gòu)的真菌毒素也有較強(qiáng)的吸附作用[15]。ST、AFB1、AFB2具有明顯的平面結(jié)構(gòu),易被GCB吸附,因此GCB對(duì)這些真菌毒素的回收率影響較大。綜合考慮,樣品處理過(guò)程中不使用GCB。

固定PSA 用量為100 mg,不加入GCB,試驗(yàn)考察了不添加C18以及C18用量為50,100 mg時(shí)對(duì)真菌毒素回收率的影響,如圖3所示。

圖3 C18用量對(duì)15種真菌毒素回收率的影響Fig.3 Effect of C18 amount on the recovery of 15 mycotoxins

由圖3可知:不添加C18時(shí),FB2的回收率低于50.0%,隨著C18用量的增加,FB2的回收率有明顯提升;C18用量對(duì)3-ACDON、AFG1、HT-2、T-2、OTA 回收率的影響不大;AFG2、AFB2的回收率在C18用量為50 mg時(shí)最優(yōu),其余真菌毒素的回收率均在C18用量為100 mg時(shí)最佳。固定C18用量為100 mg,不加入GCB,考察了不添加PSA 以及PSA 用量為50,100 mg時(shí)對(duì)真菌毒素回收率的影響,如圖4所示。

由圖4可知:不添加PSA 時(shí),AFB1和ST 的回收率低于50.0%,二者回收率均隨著PSA 用量的增加而提高;HT-2的回收率有隨著PSA 用量增加而降低的趨勢(shì),AFG2、FB3、T-2、OTA 的回收率在PSA 用量為50 mg時(shí)最優(yōu),其余真菌毒素的回收率在PSA 用量為100 mg時(shí)最佳。

綜合考慮,試驗(yàn)最終優(yōu)化得到的凈化劑用量為PSA 100 mg和C18100 mg,在此條件下各真菌毒素回收率均達(dá)到75.0%以上。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致峰形拖尾、線(xiàn)性差及重現(xiàn)性差,可利用不同濃度水平的目標(biāo)化合物在空白溶劑中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率和在基質(zhì)溶液中的工作曲線(xiàn)斜率進(jìn)行計(jì)算[16]。試驗(yàn)采用空白糌粑基質(zhì)提取液和空白溶劑分別配制標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,獲得工作曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(相關(guān)系數(shù)均大于0.990 0),基質(zhì)效應(yīng)＝(工作曲線(xiàn)的斜率－標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率)/標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率×100%。結(jié)果表明:T-2、3-ACDON、AFG1的基質(zhì)效應(yīng)絕對(duì)值均在20.0%～50.0%內(nèi),AFB2、FB2、ZEN 的基質(zhì)效應(yīng)絕對(duì)值均在10.0%～20.0%內(nèi),其余真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)絕對(duì)值均小于10.0%。說(shuō)明大多數(shù)真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)較小,只有3種真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)絕對(duì)值在20.0%～50.0%內(nèi)。使用內(nèi)標(biāo)和基質(zhì)校正標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(即工作曲線(xiàn))定量是常用的去除基質(zhì)效應(yīng)的方法,而真菌毒素種類(lèi)較多,找到對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)難度較大,且真菌毒素的內(nèi)標(biāo)價(jià)格非常昂貴,為了降低檢測(cè)成本,試驗(yàn)采用基質(zhì)校正標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行準(zhǔn)確定量,可以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 工作曲線(xiàn)、檢出限與測(cè)定下限

取陰性糌粑樣品,按照試驗(yàn)方法制備空白基質(zhì)提取液,用其配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,其中DON、15-ACDON、3-ACDON、HT-2 的質(zhì)量濃度為5.0,20,50,100,200μg·L－1,其余真菌毒素的質(zhì)量濃度為0.5,2.0,5.0,10,20μg·L－1。以化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線(xiàn),得到的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 線(xiàn)性參數(shù)、檢出限及測(cè)定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

以3倍信噪比(S/N)確定化合物的檢出限(3S/N),以10 倍信噪比確定化合物的測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6 精密度與回收試驗(yàn)

選取空白糌粑樣品,按2 倍測(cè)定下限(低)、10倍測(cè)定下限(中)、20倍測(cè)定下限(高)等3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平選取6個(gè)平行樣,按照試驗(yàn)方法測(cè)定,計(jì)算真菌毒素的回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,15種真菌毒素在糌粑中的回收率為75.8%～105%,測(cè)定值的RSD 為0.10%～9.5%。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 樣品分析

從拉薩市購(gòu)買(mǎi)不同廠家的糌粑共10批,包括糌粑(3批)、黑糌粑(2批)、豌豆糌粑(1批)、水磨糌粑(1批)、仲嘎糌粑(1批)、羅布瓊孜糌粑(1批)、萌動(dòng)糌粑(1 批),按照試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,10批糌粑中有7批檢出OTA,檢出率高達(dá)70%,檢出量為0.4～32.3μg·kg－1,其余真菌毒素均未檢出,說(shuō)明OTA 污染的概率較高。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761－2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定谷物及其制品中OTA 的限量為5μg·kg－1,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩批糌粑中OTA 含量超標(biāo),亟需重視糌粑中真菌毒素的安全性,并進(jìn)行相關(guān)監(jiān)控。

本工作采用Qu ECh ERS 樣品前處理方法,以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定糌粑中15種真菌毒素的含量。方法前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、精密度好、穩(wěn)定可靠,可用于糌粑中真菌毒素的含量測(cè)定和安全性防控。