杜 姣，張夢(mèng)婕，黃聯(lián)杰

（武漢存濟(jì)口腔醫(yī)院綜合科，湖北 武漢 430020）

牙周炎是臨床常見的一種細(xì)菌感染性疾病，其可破壞口腔牙周組織進(jìn)而影響牙槽骨的吸收，人牙齦成纖維細(xì)胞是牙齦的主要組成細(xì)胞，牙齦成纖維細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)等均可引起牙周炎的發(fā)生。研究表明唑來膦酸、柚皮素等可調(diào)控牙齦成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及成骨分化等過程［1-2］。鳶尾苷元是一種異黃酮類化合物，其含有3 個(gè)酚羥基與1 個(gè)甲氧基，為葛花的有效成分，研究表明其具有抗氧化、炎癥等作用［3］，但其對(duì)牙周炎的治療效果及可能作用機(jī)制尚未闡明。微小RNA （miRNA） 在牙齦成纖維細(xì)胞中異常表達(dá)，并可能調(diào)控炎癥反應(yīng)進(jìn)而參與牙周炎的發(fā)生過程［4］。微小RNA-449a （miR-449a） 在腦缺血再灌注損傷中表達(dá)降低，丹酚酸A 通過調(diào)節(jié)miR-499a／DDK1 抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕腦缺血再灌注損傷［5］。JAK／STAT 信號(hào)通路可介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程，一旦激活后可明顯誘導(dǎo)炎癥因子的聚集從而加重細(xì)胞損傷［6］。但miR-449a 和JAK／STAT 信號(hào)通路是否可介導(dǎo)鳶尾苷元調(diào)控牙齦成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的過程尚未可知。因此，本研究主要探討鳶尾苷元對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探究其對(duì)miR-449a 表達(dá)和JAK／STAT 信號(hào)通路的調(diào)控作用。

1 材料

1.1 牙齦組織來源 收集2018 年2 月至2019 年8 月于本院診治的青少年的牙齦組織，拔除智齒時(shí)切取少量無炎癥牙齦組織，患者共25 例，其中男性15 例，女性10 例；年齡18～25 歲，平均年齡（23.12±3.15） 歲，牙齦組織于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。使用含有青鏈霉素雙抗的PBS洗滌牙齦組織，采用組織塊貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)［7］，得人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過（批號(hào)20180019）。

1.2 藥物與試劑 鳶尾苷元（純度≥98%，批號(hào)20191203，成都格利普生物科技有限公司）；Lipofectamine2000 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen公司）；cDNA 合成與實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RTqPCR） 試劑［天根生化科技（北京） 有限公司］；甲基噻唑基四唑（MTT） 試劑、凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；兔抗人細(xì)胞周期蛋白1 （Cyclin D1）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 （cleaved caspase-3）抗體（美國Santa Cruz 公司）；兔抗人磷酸化Janus 激酶（p-JAK）、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（p-STAT） 抗體、辣根過氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥 取對(duì)數(shù)生長期HGFs （1×105／mL） 接種于96 孔板，每孔100 μL，分別加入含不同濃度（50、100、200 μmol／L） 鳶尾苷元的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h［8］，分別記作鳶尾苷元低、中、高劑量組，同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組。分別將miR-NC、miR-449a mimics、anti-miR-NC、anti-miR-449a 轉(zhuǎn)染至HGFs，分別記作miR-NC 組、miR-449a 組、anti-miR-NC 組、anti-miR-449a 組。分別將antimiR-NC、anti-miR-449a 轉(zhuǎn)染至HGFs 后加入含200 μmol／L鳶尾苷元的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別記作鳶尾苷元+antimiR-NC 組、鳶尾苷元+anti-miR-449a 組。

2.2 MTT 法檢測細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長期HGFs （1×105／mL） 接種于96 孔板，每孔100 μL，按“2.1” 項(xiàng)下分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔分別加入MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后每孔加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度（A） 值，以A值間接表示細(xì)胞活力。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 收集各組HGFs，加入預(yù)冷PBS 洗滌后棄上清，加入500 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后按照凋亡試劑盒檢測各組細(xì)胞凋亡率。

2.4 RT-qPCR 法檢測細(xì)胞miR-449a表達(dá) 收集各組HGFs，采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)，按照試劑盒說明書配置反應(yīng)體系并設(shè)置反應(yīng)條件，應(yīng)用羅氏LightCycler480 熒光定量PCR 儀檢測miR-449a相對(duì)表達(dá)量。

2.5 Western blot 法檢測細(xì)胞Cyclin D1、cleaved caspase-3、p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá) 收集各組HGFs，用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，分別孵育一抗（1 ∶1 000） 與二抗（1 ∶5 000），暗室內(nèi)曝光顯影后應(yīng)用Image J 軟件分析各條帶灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以（±s） 表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與對(duì)照組比較，鳶尾苷元各劑量組細(xì)胞活力和Cyclin D1 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），凋亡率及cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響（±s，n＝9）

表1 鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響（±s，n＝9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別Cyclin D1cleaved caspase-3A 值凋亡率／%對(duì)照組0.86±0.080.32±0.030.986±0.097.13±0.64鳶尾苷元低劑量組0.72±0.06*0.48±0.04*0.765±0.08*13.16±1.05*鳶尾苷元中劑量組0.58±0.05*0.72±0.07*0.536±0.05*18.93±1.73*鳶尾苷元高劑量組0.41±0.04*0.79±0.06*0.457±0.04*25.43±2.34*

圖1 鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞凋亡（A） 及Cyclin D1、cleaved caspase-3 蛋白（B） 的影響

3.2 鳶尾苷元對(duì)HGFs 中miR-449a表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，鳶尾苷元各劑量組miR-449a表達(dá)升高（P＜0.05），見表2。

表2 鳶尾苷元對(duì)HGFs 中miR-449a 表達(dá)的影響（±s，n＝9）

表2 鳶尾苷元對(duì)HGFs 中miR-449a 表達(dá)的影響（±s，n＝9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別miR-449a對(duì)照組1.00±0.11鳶尾苷元低劑量組1.57±0.12*鳶尾苷元中劑量組2.24±0.21*鳶尾苷元高劑量組2.64±0.23*

3.3miR-449a對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-449a 組細(xì)胞活力及Cyclin D1 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），凋亡率、miR-449a表達(dá)及cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)均升高 （P＜0.05）。與anti-miR-NC 組比較，antimiR-449a 組細(xì)胞活力及Cyclin D1 蛋白表達(dá)均升高 （P＜0.05），凋亡率、miR-449a表達(dá)及cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），見圖2、表3。

表3 miR-449a 對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響（±s，n＝9）

表3 miR-449a 對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響（±s，n＝9）

注：與miR-NC 組比較，*P＜0.05；與anti-miR-NC 組比較，＃P＜0.05。

組別miR-449aCyclin D1cleaved caspase-3A 值凋亡率／%miR-NC 組1.00±0.100.88±0.080.33±0.030.991±0.097.23±0.71 miR-449a 組1.85±0.14*0.41±0.04*0.76±0.07*0.506±0.05*20.64±1.82*anti-miR-NC 組1.01±0.090.84±0.070.31±0.020.983±0.087.14±0.62 anti-miR-449a 組0.38±0.03＃1.13±0.10＃0.08±0.01＃1.286±0.11＃3.04±0.27＃

圖2 miR-449a 對(duì)HGFs 細(xì)胞凋亡（A） 及Cyclin D1、cleaved caspase-3 蛋白（B） 的影響

3.4anti-miR-449a逆轉(zhuǎn)鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與鳶尾苷元+anti-miR-NC 組比較，鳶尾苷元+antimiR-449a 組細(xì)胞活力及Cyclin D1 蛋白表達(dá)均升高 （P＜0.05），凋亡率、miR-449a表達(dá)及cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），見圖3、表4。

表4 anti-miR-449a 逆轉(zhuǎn)鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響（±s，n＝9）

表4 anti-miR-449a 逆轉(zhuǎn)鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞增殖、凋亡的影響（±s，n＝9）

注：與鳶尾苷元+anti-miR-NC 組比較，*P＜0.05。

組別miR-449aCyclin D1cleaved caspase-3A 值凋亡率／%鳶尾苷元+anti-miR-NC 組1.00±0.100.43±0.040.81±0.070.447±0.0424.13±2.14鳶尾苷元+anti-miR-449a 組0.40±0.04*0.82±0.08*0.38±0.03*0.861±0.07*11.58±1.24*

圖3 anti-miR-449a 逆轉(zhuǎn)鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞凋亡（A） 及Cyclin D1、cleaved caspase-3 蛋白（B） 的影響

3.5miR-449a及鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞JAK／STAT 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，200 μmol／L 鳶尾苷元組p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與anti-miRNC 組比較，anti-miR-449a 組p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與鳶尾苷元+anti-miR-NC 組比較，鳶尾苷元+anti-miR-449a 組p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá)升高 （P＜0.05），見圖4、表5。

表5 miR-449a 及鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞p-JAK、p-STAT蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝9）

表5 miR-449a 及鳶尾苷元對(duì)HGFs 細(xì)胞p-JAK、p-STAT蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝9）

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與anti-miR-NC 組比較，＃P ＜0.05；與鳶尾苷元+anti-miR-NC 組比較，＆P＜0.05。

組別p-JAKp-STAT對(duì)照組0.73±0.060.62±0.05鳶尾苷元組0.33±0.03*0.28±0.02*anti-miR-NC 組0.74±0.060.63±0.06 anti-miR-449a 組1.11±0.10＃0.93±0.09＃鳶尾苷元+anti-miR-NC 組0.31±0.030.26±0.02鳶尾苷元+anti-miR-449a 組0.65±0.06＆0.57±0.04＆

圖4 各組細(xì)胞p-JAK、p-STAT 蛋白條帶圖

4 討論

牙周炎發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，牙周組織再生對(duì)治療牙周炎具有重要意義，牙周組織再生、修復(fù)等與牙齦成纖維細(xì)胞增殖、遷移及分化等密切相關(guān)，既往研究顯示脂聯(lián)素、硝苯地平等均可影響牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明［9-10］。miRNA 可能作為牙周炎治療的潛在靶標(biāo)［11］。但關(guān)于藥物與miRNA 在治療牙周炎中的作用機(jī)制也尚未闡明。

鳶尾苷元具有清除氧自由基、降血糖等作用，還可減輕急性心肌梗死小鼠的心肌損傷［12］；可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖及炎癥反應(yīng)的發(fā)生［13］；可抑制LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)從而減輕小鼠急性肺損傷［14］。本研究結(jié)果顯示，鳶尾苷元可降低細(xì)胞活力，提高細(xì)胞凋亡率，提示鳶尾苷元可促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞凋亡。

miR-449a可通過調(diào)節(jié)高遷移率族框蛋白1 抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖、遷移和炎癥反應(yīng)［15］；還可調(diào)控AREG 減輕腦缺血損傷［16］。本研究結(jié)果顯示，鳶尾苷元可提高miR-449a表達(dá)；miR-449a過表達(dá)可降低細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；而抑制miR-449a表達(dá)可提高細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，提示miR-449a過表達(dá)可抑制牙齦成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究顯示，鳶尾苷元與anti-miR-449a共處理后可增強(qiáng)細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡率，提示抑制miR-449a表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)鳶尾苷元對(duì)HGFs細(xì)胞增殖及凋亡的作用。JAK 與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后發(fā)生磷酸化，STAT 與受體結(jié)合后在p-JAK 的催化下形成p-STAT，其可促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的分泌及生成，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡［17-19］。本研究結(jié)果顯示，鳶尾苷元可降低HGFs中p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá)；抑制miR-449a表達(dá)可促進(jìn)p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá)；且抑制miR-449a表達(dá)可逆轉(zhuǎn)鳶尾苷元對(duì)p-JAK、p-STAT 蛋白表達(dá)的抑制作用，提示鳶尾苷元可能通過調(diào)控miR-449a而抑制JAK／STAT 信號(hào)通路的活化從而發(fā)揮作用。

綜上所述，鳶尾苷元可抑制HGFs 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與上調(diào)miR-449a表達(dá)及抑制JAK／STAT信號(hào)通路活化有關(guān)，可為進(jìn)一步闡明牙周炎發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，還可為揭示鳶尾苷元治療牙周炎的分子機(jī)制提供參考。