張洪艷，張燕嬌，鄭靜靜，卞 睿，顧 鑫，李文慧，任衛(wèi)東

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，河北 張家口 075000；3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 張家口 075000）

糖尿病并發(fā)抑郁癥（diabetes mellitus with depression，DD） 是糖尿病患者的一種慢性并發(fā)癥，發(fā)病隱匿且易反復(fù)，患者自殺傾向高，其致死率比單純糖尿病患者高，因此對此進行積極防治具有重大意義［1-2］。DD 的發(fā)病機制復(fù)雜，高糖能引發(fā)炎性因子異常過量表達，誘導(dǎo)強烈的神經(jīng)炎癥，造成神經(jīng)元損傷，是導(dǎo)致DD 的主要病理機制，抑制糖尿病引發(fā)的炎癥可明顯改善抑郁癥狀［3-4］。紫草素是中藥紫草中含有的一種萘醌類活性成分，具有顯著的抗菌消炎、抗氧化、降血糖的作用［5］，可以降低炎性細胞因子表達，通過抑制神經(jīng)炎癥減輕缺血引發(fā)的神經(jīng)元損傷，起到腦保護作用［6］，由此推測紫草素可能對DD 具有治療作用。絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK） 是關(guān)鍵的炎癥信號分子，調(diào)控細胞增殖、凋亡等多種生理行為，在糖尿病引發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛和抑郁癥的發(fā)病過程中起到關(guān)鍵作用，抑制MAPK 信號激活可減弱促炎細胞因子表達，減輕糖尿病引發(fā)的大鼠神經(jīng)病理性疼痛，改善其抑郁樣行為［7-8］，并可通過抑制神經(jīng)炎癥改善阿爾茨海默病小鼠神經(jīng)元突觸可塑性和認知缺陷［9］。但紫草素是否可通過MAPK 信號改善DD 癥狀，目前還未見明確報道，本研究通過構(gòu)建模擬DD 環(huán)境體外細胞模型，探討紫草素對模擬DD 環(huán)境大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護作用。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠，SPF 級，雄性體質(zhì)量350～380 g，雌性體質(zhì)量200～240 g，購自湖南安生美藥物研究院有限公司［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （湘） 2020-0014］，飼養(yǎng)于本院動物中心屏障環(huán)境動物房［實驗動物使用許可證號SYXK （冀） 2019-0016］，環(huán)境相對濕度（51±5）%、溫度（24±1）℃、12 h／12 h 光暗循環(huán)，適應(yīng)性飼喂1 周后開始實驗。本實驗經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號LLS2022 第73 號）。

1.2 藥物與試劑 紫草素（純度＞98%，批號dasf0508，南京道斯夫生物科技有限公司）。皮質(zhì)酮（純度99.63%）、MAPK 激活劑（C16-PAF）、羊抗兔二抗（批號HY-B1618、HY-108635、HY-90126，美國MCE 公司）；膠原酶Ⅰ、葡萄糖、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 試劑盒、尼氏染色液、Annexin V-FITC／PI 凋亡檢測試劑盒、大鼠白細胞介素-6 （interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 酶聯(lián)免疫吸附 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒 （批號17100017、G8150、M1020、C0117、CA1020、PI328、PI915，北京索萊寶科技有限公司）；大鼠海馬神經(jīng)元細胞完全培養(yǎng)基、BCA 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒（批號CM-R107、C503021，武漢普諾賽生命科技有限公司）；胰蛋白酶、RIPA 裂解液［批號A600626-0005、C500005-0050，生工生物工程 （上海） 股份有限公司］；大鼠白細胞介素-18 （interleukin-18，IL-18） ELISA 試劑盒、兔源p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK，p-p38 MAPK）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9 （caspase-9）、B 淋巴細胞瘤-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、β-肌動蛋白 （β-actin） 一抗 （批號ab213909、ab8227、ab60179、ab30275、ab10861、ab10263，英 國Abcam 公司）。

1.3 儀器 MR-96A 型酶標(biāo)儀、DSX100 型光學(xué)顯微鏡、CytoFLEX 型流式細胞儀（北京昊諾斯科技有限公司）；1703930 型轉(zhuǎn)印槽、1659001 型電泳儀 （美國Bio-Rad 公司）；Bio-Best 型化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海人和科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 原代培養(yǎng)大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元 將雌、雄大鼠以1 ∶2 的比例合籠，交配獲得孕鼠，以檢查到陰栓為孕1 d，取孕18 d 的孕鼠，吸入異氟醚麻醉后，開腹取出胎鼠，剪下大腦，分離出海馬組織，剪碎后加入等體積的膠原酶Ⅰ和胰蛋白酶，混勻后充分消化，以200 目篩過濾后1 000 r／min離心5 min，以大鼠海馬神經(jīng)元細胞完全培養(yǎng)基洗滌細胞沉淀后再次離心，加入完全培養(yǎng)基后，將細胞吹打成單細胞懸浮液，計數(shù)并調(diào)整細胞密度為3.0×105／mL，接種在培養(yǎng)瓶中無菌培養(yǎng)。

2.2 構(gòu)建模擬DD 環(huán)境細胞模型并篩選紫草素最佳作用濃度 取培養(yǎng)5 d 的大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)細胞，傳代接種在96 孔板中；其中6 孔不接種細胞，作為空白組。24 h 后分別以0 （對照組）、0.25、0.5、1、2、4 μmol／L紫草素干預(yù)細胞［10］，6 h 后以150 mmol／L 葡萄糖及200 μmol／L 皮質(zhì)酮聯(lián)合干預(yù)細胞，構(gòu)建體外模擬DD 環(huán)境細胞模型［11］，18 h 后加入MTT 溶液10 μL 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除上清，保留底部紫色結(jié)晶，加入Formazan 溶解液110 μL 于搖床上低速振蕩，10 min 后采用酶標(biāo)儀測量各孔在490 nm波長處的吸光值，計算細胞活力。各組均設(shè)6 個復(fù)孔。

2.3 分組處理及細胞活力檢測 將培養(yǎng)5 d 的大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)細胞傳代后接種在96 孔板中，隨機分為對照組、模型組、紫草素（2 μmol／L） 組、C16-PAF（4 μmol／L） 組［12］、紫草素+C16-PAF（2 μmol／L+4 μmol／L）組，24 h 后以2 μmol／L 紫草素和4 μmol／L C16-PAF 分組干預(yù)細胞，6 h 后除對照組外，其他組按“2.2” 項下方法構(gòu)建體外模擬DD 環(huán)境細胞模型，繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后，按“2.2” 項下MTT 法檢測各組細胞活力。各組均設(shè)6 個復(fù)孔。

2.4 細胞損傷情況檢測 將培養(yǎng)5 d 的大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)細胞傳代后接種在24 孔板，按“2.3” 項下方法分組處理后，去除培養(yǎng)液，以PBS 漂洗細胞后固定，加入尼氏染液進行染色，漂洗后于鏡下觀察神經(jīng)元細胞損傷情況。

2.5 細胞凋亡情況檢測 將培養(yǎng)5 d 的大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)細胞傳代后接種在24 孔板，按“2.3” 項下方法分組處理后，收集各組細胞及其培養(yǎng)液。PBS 重懸細胞，計數(shù)后取約含1×106個細胞的細胞懸液，1 000 r／min 離心5 min，洗滌細胞沉淀，依次加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC） 10 μL、Binding Buffer 500 μL、碘化丙啶（propidium iodide，PI） 5 μL，混勻后于37.5 ℃避光孵育15 min，1 000 r／min 離心5 min，再次洗滌細胞沉淀，以500 μL PBS 重懸細胞，混勻后上機檢測，以流式細胞儀自帶的系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)得到細胞凋亡率。各組剩余的細胞懸液1 000 r／min 離心5 min 后保存在液氮中。

2.6 細胞上清液炎性因子TNF-α、IL-6、IL-18 水平檢測 取“2.5” 項下收集得到的各組細胞培養(yǎng)液，1 000 r／min離心5 min，采用試劑盒通過ELISA 法檢測上清液中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-18 水平。

2.7 神經(jīng)元細胞凋亡相關(guān)蛋白及MAPK 信號通路蛋白表達檢測 取“2.5” 項下保存在液氮中的各組細胞，加入高效RIPA 裂解液，于冰水浴中裂解2 h，3 000 r／min 離心20 min，采用BCA 試劑盒測定上清液中蛋白總濃度，各組分別取20 μg 總蛋白變性后電泳分離，濕轉(zhuǎn)后采用5%脫脂奶粉溶液封閉蛋白非特異位點，分別以對應(yīng)兔源p38 MAPK、p-p38 MAPK、caspase-9、Bax、β-actin 一抗（1 ∶1 300） 4 ℃孵育13 h，洗滌后以羊抗兔二抗溶液（1 ∶1 700） 37 ℃孵育1.5 h，洗滌后通過化學(xué)發(fā)光法顯色并拍照，通過Image J 軟件定量各蛋白灰度值，計算出各組蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin 蛋白條帶灰度值的比值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 24.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩之間進一步比較采用SKN-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度紫草素對體外模擬DD 環(huán)境大鼠海馬神經(jīng)元細胞活力的影響 不同濃度紫草素可增強體外模擬DD 環(huán)境大鼠海馬神經(jīng)元細胞活力，并在一定濃度范圍內(nèi)隨濃度升高而作用增強（P＜0.05）。當(dāng)紫草素濃度為2 μmol／L時，進入平臺期，其促生長作用會隨濃度的繼續(xù)升高而減小（P＜0.05），因此選擇2 μmol／L 紫草素進行后續(xù)實驗，見表1。

表1 不同濃度紫草素對體外模擬DD 環(huán)境大鼠海馬神經(jīng)元細胞活力的影響（±s，n＝6）

表1 不同濃度紫草素對體外模擬DD 環(huán)境大鼠海馬神經(jīng)元細胞活力的影響（±s，n＝6）

注：與0 μg／mL 紫草素比較，*P＜0.05；與0.25 μg／mL 紫草素比較，＃ P ＜0.05；與0.5 μg／mL 紫草素比較，△P ＜0.05；與1 μg／mL紫草素比較，▲P＜0.05。

紫草素濃度／（μmol·L-1）細胞活力／%0 100.00±0.00 0.25139.41±10.08*0.5162.71±13.25*＃1 187.53±16.07*＃△2 202.39±21.63*?！鳌? 197.52±19.30*＃△▲

3.2 紫草素對體外模擬DD 環(huán)境大鼠海馬神經(jīng)元細胞活力的影響 與對照組比較，模型組細胞活力降低（P＜0.05）；與模型組比較，紫草素組細胞活力升高（P＜0.05），C16-PAF 組細胞活力降低（P＜0.05）；與紫草素組比較，紫草素+C16-PAF 組細胞活力降低（P＜0.05）；與C16-PAF 組比較，紫草素+C16-PAF 組細胞活力升高 （P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞活力比較（±s，n＝6）

表2 各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞活力比較（±s，n＝6）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與紫草素組比較，△P＜0.05；與C16-PAF 組比較，▲P＜0.05。

組別細胞活力／%對照組100.00±0.00模型組51.23±5.42*紫草素組87.64±10.05＃C16-PAF 組29.76±3.56?！髯喜菟?C16-PAF 組60.18±7.04△▲

3.3 紫草素對體外模擬DD 環(huán)境大鼠海馬神經(jīng)元細胞損傷的影響 對照組神經(jīng)元尼氏小體在神經(jīng)元的樹突和胞體中正常分布；與對照組比較，模型組神經(jīng)元尼氏小體明顯減少，甚至消失，細胞呈現(xiàn)明顯損傷；與模型組比較，紫草素組神經(jīng)元尼氏小體有所恢復(fù)，神經(jīng)元損傷均減輕，C16-PAF 組神經(jīng)元尼氏小體進一步減少，神經(jīng)元損傷均加重；與紫草素組比較，紫草素+C16-PAF 組神經(jīng)元尼氏小體進一步減少，神經(jīng)元損傷均加重，見圖1。

圖1 大鼠海馬神經(jīng)元尼氏染色（×200）

3.4 紫草素對體外模擬DD 環(huán)境大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡的影響 與對照組比較，模型組細胞凋亡率升高 （P＜0.05）；與模型組比較，紫草素組細胞凋亡率降低（P＜0.05），C16-PAF 組細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與紫草素組比較，紫草素+C16-PAF 組細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與C16-PAF 組比較，紫草素+C16-PAF 組細胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖2、表3。

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況

表3 各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡率比較（±s，n＝6）

表3 各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡率比較（±s，n＝6）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與紫草素組比較，△P＜0.05；與C16-PAF 組比較，▲P＜0.05。

組別凋亡率／%對照組3.02±0.43模型組51.96±5.94*紫草素組10.43±1.25＃C16-PAF 組70.65±7.36?！髯喜菟?C16-PAF 組46.31±4.02△▲

3.5 紫草素對體外模擬DD 環(huán)境大鼠海馬神經(jīng)元細胞TNFα、IL-6、IL-18 水平的影響 與對照組比較，模型組細胞TNF-α、IL-6、IL-18 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，紫草素組細胞TNF-α、IL-6、IL-18 水平降低（P＜0.05），C16-PAF 組細胞TNF-α、IL-6、IL-18 水平升高（P＜0.05）；與紫草素組比較，紫草素+C16-PAF 組細胞TNF-α、IL-6、IL-18 水平升高（P＜0.05）；與C16-PAF 組比較，紫草素+C16-PAF 組細胞TNF-α、IL-6、IL-18 水平降低（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-6、IL-18 水平比較（ng／mL，±s，n＝6）

表4 各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞TNF-α、IL-6、IL-18 水平比較（ng／mL，±s，n＝6）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與紫草素組比較，△P＜0.05；與C16-PAF 組比較，▲P＜0.05。

組別TNF-αIL-6IL-18）對照組1.49±0.150.68±0.080.39±0.05模型組3.78±0.37*1.85±0.34*1.12±0.18*紫草素組1.55±0.16＃0.73±0.12＃0.43±0.07＃C16-PAF 組5.16±0.42?！?2.69±0.41＃△ 1.86±0.25?！髯喜菟?C16-PAF 組 3.64±0.39△▲ 1.81±0.37△▲ 1.08±0.13△▲

3.6 紫草素對體外模擬DD 環(huán)境大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡相關(guān)蛋白及MAPK 信號通路蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組細胞caspase-9、Bax、p-p38 MAPK／p38 MAPK蛋白表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，紫草素組細胞caspase-9、Bax、p-p38 MAPK／p38 MAPK 蛋白表達降低（P＜0.05），C16-PAF 組細胞caspase-9、Bax、p-p38 MAPK／p38 MAPK 蛋白表達升高（P＜0.05）；與紫草素組比較，紫草素+C16-PAF 組細胞caspase-9、Bax、p-p38 MAPK／p38 MAPK 蛋白表達升高（P＜0.05）；與C16-PAF 組比較，紫草素+C16-PAF 組細胞caspase-9、Bax、p-p38 MAPK／p38 MAPK 蛋白表達降低（P＜0.05），見圖3、表5。

圖3 各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡相關(guān)蛋白及MAPK 信號通路蛋白印跡圖

表5 各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡相關(guān)蛋白及MAPK 信號通路蛋白表達比較（±s，n＝6）

表5 各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡相關(guān)蛋白及MAPK 信號通路蛋白表達比較（±s，n＝6）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與紫草素組比較，△P＜0.05；與C16-PAF 組比較，▲P＜0.05。

組別caspase-9／β-actinBax／β-actinp-p38 MAPK／p38 MAPK對照組0.27±0.050.42±0.090.18±0.03模型組1.18±0.23*1.35±0.21*0.64±0.05*紫草素組0.33±0.06＃0.49±0.10＃0.22±0.04＃C16-PAF 組1.90±0.41?！?.02±0.27?！?.98±0.12?！髯喜菟?C16-PAF 組1.11±0.28△▲1.28±0.22△▲0.60±0.07△▲

4 討論

近年來，我國糖尿病發(fā)病率逐年上升，繼發(fā)的抑郁癥病例數(shù)也隨之升高，已成為亟需解決的一個社會公共衛(wèi)生問題［13-14］。本研究以葡萄糖聯(lián)合皮質(zhì)酮干預(yù)的方法構(gòu)建模擬DD 環(huán)境海馬神經(jīng)元細胞模型，結(jié)果顯示，體外原代培養(yǎng)的大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元以葡萄糖聯(lián)合皮質(zhì)酮干預(yù)后，炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-18 大量產(chǎn)生，引發(fā)炎癥，造成細胞尼氏小體數(shù)明顯減少，呈現(xiàn)明顯損傷，進而誘導(dǎo)細胞凋亡，表明體外模擬DD 環(huán)境細胞模型構(gòu)建成功。

炎癥狀態(tài)加劇可增加糖尿病患者發(fā)生抑郁的風(fēng)險，減弱大腦中炎癥和氧化應(yīng)激可改善糖尿病大鼠抑郁癥狀，進行抗炎治療是改善DD 癥狀的有效手段［15-16］。紫草素是一種有明顯抗炎活性的天然化合物，可抑制MAPK 信號活化，拮抗炎癥發(fā)生發(fā)展，改善關(guān)節(jié)炎、牙髓炎等炎性疾病癥狀［17-18］，并可減輕氧糖剝奪誘導(dǎo)的大鼠原代皮層神經(jīng)元凋亡［10］，因而推測紫草素可能防治DD。本實驗以不同濃度紫草素處理體外模擬DD 環(huán)境細胞模型，均可增強其細胞活力，當(dāng)紫草素濃度為2 μmol／L 時進入平臺期，故后續(xù)實驗選擇2 μmol／L 紫草素進行。以2 μmol／L 紫草素處理體外模擬DD 環(huán)境細胞模型，可降低炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-18 水平，減弱炎癥，減輕細胞損傷，下調(diào)凋亡蛋白caspase-9 及Bax 表達，進而抑制凋亡，表明紫草素可通過抗炎作用而改善模擬DD 環(huán)境神經(jīng)元細胞損傷，提升其細胞活力，最終保護細胞免于凋亡，揭示紫草素在DD 的治療中有很好的應(yīng)用前景。

MAPK 是一種典型的細胞應(yīng)激反應(yīng)元件，參與介導(dǎo)糖尿病相關(guān)的牙周炎、焦慮和抑郁等并發(fā)癥的產(chǎn)生及病情進展，下調(diào)p38 MAPK 磷酸化水平可減少活性氧及炎性介質(zhì)的生成，拮抗炎癥的產(chǎn)生及進展［19］，改善神經(jīng)炎癥等應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮和抑郁癥狀［20］。本實驗結(jié)果顯示，以MAPK 激活劑C16-PAF 處理模擬DD 環(huán)境海馬神經(jīng)元細胞模型，可加重神經(jīng)元細胞炎癥損傷，促進其凋亡；而紫草素可降低模擬DD 環(huán)境海馬神經(jīng)元細胞中p38 MAPK 的磷酸化水平；以C16-PAF 和紫草素聯(lián)合處理模擬DD 環(huán)境海馬神經(jīng)元細胞，C16-PAF 可減弱紫草素的抗炎活性，拮抗其對模擬DD環(huán)境海馬神經(jīng)元細胞凋亡的抑制功效，逆轉(zhuǎn)紫草素對神經(jīng)元的保護作用，表明MAPK 信號介導(dǎo)紫草素對體外培養(yǎng)的模擬DD 環(huán)境海馬神經(jīng)元細胞的保護作用。

綜上所述，本實驗證實了紫草素可下調(diào)MAPK 蛋白磷酸化水平，進而降低炎性細胞因子水平，抵抗炎癥反應(yīng)發(fā)生及進展，增強模擬DD 環(huán)境海馬神經(jīng)元細胞活力，抑制其凋亡，抑制MAPK 信號激活是紫草素發(fā)揮上述藥理作用的機制之一。