喬雨晴 ， 李媛 ， 羅國安 ， 徐燕婷 ， 汪天娜 ， 蘇秀

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 浙江 杭州 311300； 2. 余姚市林業(yè)服務(wù)中心, 浙江 余姚 315400； 3. 景寧畬族自治縣沙灣鎮(zhèn)人民政府, 浙江 景寧 323507； 4. 杭州市臨安區(qū)植物檢疫站, 浙江 杭州 311300）

曼地亞紅豆杉Taxus×media是東北紅豆杉Taxus cuspidata和歐洲紅豆杉Taxusbaccata的雜交種，其植物學(xué)特征介于雙親之間，生長速度快，生物學(xué)特性穩(wěn)定。自20 世紀(jì)90 年代我國引種后，現(xiàn)已在各地廣泛栽植。曼地亞紅豆杉體內(nèi)紫杉醇含量較高，藥用價(jià)值極高[1-2]，同時(shí)也具有較高的生態(tài)價(jià)值，對環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于水土保持林、水源涵養(yǎng)林[3]。

曼地亞紅豆杉常見病害主要有紅豆杉莖腐病、紅豆杉白絹病、紅豆杉炭疽病等[4-5]。枝枯病是近年來日益嚴(yán)重的病害，其病原侵染性強(qiáng)，病害蔓延迅速，常導(dǎo)致枝條枯死，嚴(yán)重時(shí)可造成大面積植株死亡。在杭州臨安、余杭等地，曼地亞紅豆杉枝枯病發(fā)病較為普遍，嚴(yán)重地區(qū)發(fā)病率可達(dá)80%左右，造成巨大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失。目前，曼地亞紅豆杉枝枯病病原尚未明確，影響了病害的科學(xué)防控。

本研究對采集于浙江臨安的曼地亞紅豆杉枝枯病病樣進(jìn)行組織分離，基于病原形態(tài)學(xué)、致病性和分子序列特征對病原進(jìn)行了鑒定，并采用菌絲生長速率法測定了6 種常用殺菌劑的毒力，以期為該病害的科學(xué)診斷與有效防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020 年10 月，從臨安區(qū)潛川鎮(zhèn)銀福紅豆杉基地采集曼地亞紅豆杉枝枯病病枝，用于組織分離、純化和培養(yǎng)。同時(shí)，將基地中采集的3 a 生健康曼地亞紅豆杉樹苗，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)室培養(yǎng)用于接種。

選擇常用的6 種殺菌劑作為供試藥劑。50%多菌靈可濕性粉劑（WP），安徽華星化工有限公司；250 g/L 吡唑醚菌酯乳油（EC），巴斯夫植物保護(hù)有限公司；75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑（WG），拜耳股份公司；60%吡唑醚菌酯·代森聯(lián)WG，巴斯夫歐洲公司；48%苯甲·嘧菌酯懸浮劑（SC），惠州銀農(nóng)科技股份有限公司；啶氧菌酯SC，美國杜邦公司。

1.2 病原菌的分離鑒定

選取發(fā)病枝條病健交界組織采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離純化[6]，直至獲得純培養(yǎng)物。制作臨時(shí)玻片，參照蔡磊 等[7]的方法通過光學(xué)顯微鏡觀察病原菌形態(tài)和培養(yǎng)特征。采用創(chuàng)傷接種法將分離純化得到的菌株接種至健康樹苗側(cè)枝部位，測定其致病性。采用生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)的真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒提取分離菌株總DNA，進(jìn)行rDNA-ITS、β-tubulin、tef1基因序列的PCR 擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件均參照石凌波[8]的方法進(jìn)行。rDNA-ITS 的PCR 擴(kuò)增引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[9]，βtubulin引物為Bt2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）和Bt2b（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）[10]，tef1擴(kuò)增引物為EF1-526F（5′-GTCGTYGTYATYGGHCAYGT-3′）和EF1-1567R（5′-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3′）[11]。取PCR 產(chǎn)物5 μL，采用1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶是否單一清晰，切膠回收后送公司測序。將測序結(jié)果提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫，經(jīng)BLAST 數(shù)據(jù)分析后，選取合適的參比菌株的基因序列，采用MEGA7 軟件進(jìn)行同源性分析，對串聯(lián)后的序列基于鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 藥劑室內(nèi)毒力測定

采用菌絲生長速率法[12]測定6 種殺菌劑對病原菌的毒力。50%多菌靈WP 的質(zhì)量濃度梯度為0.5，0.4，0.3，0.2，0.1 mg/L，其他藥劑的質(zhì)量濃度梯度均為8，4，2，1，0.5，0.25 mg/L。配制不同質(zhì)量濃度的含藥PDA 平板。取培養(yǎng)4 d 的病原菌菌落，用打孔器取直徑7 mm 的菌餅，將菌餅分別接種在含有不同質(zhì)量濃度藥劑的PDA 培養(yǎng)基上，以加入清水的培養(yǎng)基作為對照。每個(gè)處理重復(fù)3 次。接種病原菌后將培養(yǎng)皿倒置放于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，待對照組菌絲長至培養(yǎng)皿的2/3 后，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4 數(shù)據(jù)處理

計(jì)算每個(gè)菌落直徑的平均值和藥劑對菌絲生長的抑制率。使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，將藥劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)化為以10 為底的對數(shù)值作橫坐標(biāo)，各處理質(zhì)量濃度的生長抑制率轉(zhuǎn)化成概率值作縱坐標(biāo)，求出各藥劑的毒力回歸方程、半最大效應(yīng)濃度（EC50值）和相關(guān)系數(shù)[13]，根據(jù)EC50值評價(jià)殺菌劑的毒力大小。

菌絲生長抑制率(%)=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-菌餅直徑)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)和發(fā)病癥狀

經(jīng)組織分離純化的菌株高度一致，選取代表菌株LA-02 在PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)6 d 后，菌落呈白色輪紋絮狀（圖1A，B），15 d 后菌落上出現(xiàn)含分生孢子的黑色黏液（圖1C）。分生孢子呈梭形、橢圓形或近圓柱形，直或稍彎曲，大小為（21 ～29）μm × （7 ～ 9）μm，孢身4 個(gè)隔膜；頂端細(xì)胞透明，中間3 個(gè)細(xì)胞著色，圓錐或圓柱形，細(xì)胞壁薄且光滑，具有2 ～ 3 根頂端附屬絲，一根基部附屬絲（圖1D）。菌株LA-02 形態(tài)學(xué)特征與新擬盤多毛孢屬Neopestalotiopsissp. 真菌較為一致[14]。

圖1 曼地亞紅豆杉枝枯病病原菌落特點(diǎn)Fig. 1 Pathogen colony morphology of T. × media branch blight

接種LA-02 后的發(fā)病植株病斑部位再次組織分離獲得菌株的菌落特征、分生孢子形態(tài)等均與LA-02 一致；感病部位呈淡褐色，逐漸凹陷、溢縮，呈現(xiàn)明顯凹斑，皮層干枯（圖2A，B）；對照組傷口無任何感病癥狀（圖2C）。因此，分離菌株LA-02確定為曼地亞紅豆杉枝枯病的病原菌，符合科赫法則。

圖2 曼地亞紅豆杉枝枯病發(fā)病癥狀Fig. 2 Symptom of T. × media branch blight

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株LA-02 與新擬盤多毛孢屬棒狀新擬盤多毛孢菌N.clavispora聚類在一個(gè)小的分支上（圖3）。LA-02 的ITS 序列（ON394607）與NCBI 中ITS 序列（MG729676.1）相似度達(dá)100%，β-tubulin序列（OQ 790164）與NCBI 中β-tubulin序列（OP654877.1）相似度達(dá)100%，tef1序列（OQ790165）與NCBI 中tef1序列（MT745889.1）相似度達(dá)98.83%。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析與形態(tài)學(xué)鑒定特征，將曼地亞紅豆杉枝枯病病原菌LA-02 確定為棒狀新擬盤多毛孢N.clavispora。

圖3 聯(lián)合rDNA-ITS，β-tubulin 和tef1 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of LA-02 constructed by combining rDNA-ITS, β-tubulin and tef1 gene sequences

2.3 殺菌劑的毒力

6 種殺菌劑均對菌株LA-02 的菌絲生長有不同程度的抑制作用（表1）。50%多菌靈WP 和250 g/L吡唑醚菌酯EC 對菌絲的抑制效果較好，EC50分別為0.065，0.548 mg/L，且無顯著差異。

表1 藥劑對曼地亞紅豆杉枝枯病病原菌的室內(nèi)毒力Tab. 1 Laboratory toxicity of different fungicides to pathogen of T. × media branch blight

3 討論

新擬盤多毛孢屬真菌屬于子囊菌門Ascomycota，其寄主?；圆桓?，可侵染多種植物，引起枝枯、葉枯、葉斑等不同癥狀，是重要的植物病原菌[15-16]。由于形態(tài)學(xué)指標(biāo)的界限不明顯，擬盤多毛孢屬真菌的分類一直存在爭議，曾經(jīng)過多次修正[17]。2014 年，Maharachchikumbura 等以LSU 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹為依據(jù)，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis進(jìn)一步分為新擬盤多毛孢屬Neopestalotiopsis、擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis以及假擬盤多毛孢屬Pseudopestalotiopsis[18]。

Jeewon 等[19-20]指出，新擬盤多毛孢屬真菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征具有對應(yīng)關(guān)系，將兩者相結(jié)合進(jìn)行鑒定，結(jié)果更為準(zhǔn)確，尤其是多基因序列聯(lián)合分析能夠更為科學(xué)地對新擬盤多毛孢屬真菌進(jìn)行鑒定，聯(lián)合ITS、tef1和β-tubulin進(jìn)行串聯(lián)系統(tǒng)發(fā)育分析能夠較好地區(qū)分?jǐn)M盤多毛孢的模式種，是目前較為準(zhǔn)確的鑒定方式[21-22]。有學(xué)者基于形態(tài)學(xué)觀察，并通過聯(lián)合rDNA-ITS、β-tubulin、tef1進(jìn)行多基因分析，將引起廣東地區(qū)女貞葉斑病病原確定為棒狀新擬盤多毛孢N.clavispora[23]；也有學(xué)者聯(lián)合rDNA-ITS、核糖體大亞基（LSU）將引起福建地區(qū)南方紅豆杉葉斑病的病原確定為N.clavispora[24]。本研究分離得到曼地亞紅豆杉枝枯病病原代表菌株LA-02，經(jīng)形態(tài)學(xué)、致病性測定和rDNA-ITS、βtubulin、tef1基因聯(lián)合分析，鑒定其為棒狀新擬盤多毛孢N.clavispora。

通過對供試菌株進(jìn)行室內(nèi)毒力測定可以看出，多種供試藥劑對LA-02 菌絲生長具有很好的抑制效果，其中50%多菌靈WP 和250 g/L 吡唑醚菌酯EC 對菌絲生長有較強(qiáng)的抑制作用。多菌靈為高效低毒內(nèi)吸性殺菌劑，對許多植物真菌病害都有良好防效，且對土壤微生物影響小[25]。李青杰 等[26-27]研究發(fā)現(xiàn)吡唑醚菌酯對N.clavispora抑制效果最好，具有較高的抑菌活性，可深入進(jìn)行田間防治試驗(yàn)。溫浩 等[28]發(fā)現(xiàn)咪鮮胺、戊唑醇等藥劑對新擬盤多毛孢病菌均有一定抑制作用。因此，咪鮮胺、戊唑醇等可作為備選藥劑以應(yīng)對N.clavispora的抗性發(fā)展。

供試殺菌劑的EC50僅作為室內(nèi)毒力參考，不能直接應(yīng)用于林間，實(shí)際應(yīng)用中會(huì)受到多種環(huán)境因素的影響，因此本研究的結(jié)果還需進(jìn)行林間防治試驗(yàn)加以驗(yàn)證，明確其發(fā)病規(guī)律和發(fā)生原因，綜合分析誘發(fā)因素，以更準(zhǔn)確地指導(dǎo)曼地亞紅豆杉枝枯病的科學(xué)防治。