惠林沖,潘美紅,陳 微,李威亞,何林玉,張仕林,繆美華,陳振泰,楊海峰

(連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江蘇連云港 222000)

洋蔥(AlliumcepaL.)的葉色為綠色,外葉表面有角質(zhì)層蠟粉覆蓋,角質(zhì)層蠟保護(hù)植物并影響許多生理特征,被認(rèn)為參與角質(zhì)形成以及針對(duì)非生物和生物脅迫的防御反應(yīng),如病原菌[1]、昆蟲[2]、干旱及低溫等[3]。洋蔥蠟粉缺失突變體是由普通有蠟粉突變而來(lái),肉眼觀察植株表面蠟粉缺失,顏色油綠,有光澤,在蔥屬植物洋蔥[4]、大蔥均有突變植株產(chǎn)生,無(wú)蠟粉突變受單個(gè)隱性基因控制[5-6]。按洋蔥表面蠟質(zhì)含量的多少分為“蠟質(zhì)型”和“光澤型”[7]。在視覺(jué)上介于蠟質(zhì)和光澤之間的表型,稱為“半光澤”,“光澤型”相對(duì)于蠟質(zhì)型具有很少的蠟,并且顯示出對(duì)洋蔥薊馬的抗性[8],但是易受噴霧農(nóng)藥損害,病原體侵入[9]和過(guò)度蒸騰的影響[10]。

洋蔥的最外層由角質(zhì)層和表皮蠟組成,蠟主要由植物表皮中的超長(zhǎng)鏈脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物組成。這些化合物由兩條途徑合成,一種途徑是?；€原途徑,涉及初級(jí)醇和蠟酯的生產(chǎn)[11];另一種途徑是脫羰化,包括醛、烷、酮和仲醇的合成,參與種子甘油酯,鞘脂和脂質(zhì)生物膜的合成,并為蠟質(zhì)角質(zhì)層的生物合成提供前體[12]。洋蔥5號(hào)染色體上的區(qū)域可能影響角質(zhì)層蠟生物合成的脫羰途徑[10]。Liu等[13]對(duì)大蔥無(wú)蠟粉突變體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝,超長(zhǎng)鏈脂肪酸代謝,蠟生物合成和氧化還原,可能參與蠟前體的合成。

自2014年開始田間收集洋蔥無(wú)蠟粉材料,擬對(duì)洋蔥無(wú)蠟粉田間表型特征、超微結(jié)構(gòu)及蠟質(zhì)成分進(jìn)行初步研究,為研究洋蔥保持系可視化標(biāo)記、雜交種純度及抗蔥薊馬調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 無(wú)蠟粉突變體材料田間性狀統(tǒng)計(jì)

洋蔥試驗(yàn)材料的生態(tài)類型為中日照,全部來(lái)自于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究室。2017年11月在資源圃中挑選出無(wú)蠟粉突變體洋蔥苗,2018年5月收獲種球,10月種球種植,2019年5月花期進(jìn)行單株套袋自交,收獲的種子于9月份全部播種育苗,11月定植。選取3個(gè)黃皮和3個(gè)紫皮品種有蠟粉洋蔥為對(duì)照,正常使用農(nóng)藥管理,無(wú)蠟粉20份材料,正常肥水管理,全程不使用任何農(nóng)藥,2020年4月統(tǒng)計(jì)洋蔥膨大初期株高、葉片開展度、葉形、薊馬數(shù)量,5月中下旬統(tǒng)計(jì)熟期、平均單球質(zhì)量。每個(gè)小區(qū)15 m2,重復(fù)3次,隨機(jī)分布。5月下旬洋蔥膨大末期,觀察薊馬危害洋蔥葉片情況,統(tǒng)計(jì)洋蔥受害葉面積,建立無(wú)蠟粉突變體抗薊馬評(píng)價(jià)體系。

對(duì)19212、19238、19061 3份材料與有蠟粉采用人工去雄與輔助授粉的方式進(jìn)行正反雜交,每花球留15～25朵花,套羊皮紙袋,重復(fù)3次。收獲的F1進(jìn)行自交,檢測(cè)F2代分離比。

1.2 葉綠素含量的測(cè)定

在洋蔥球膨大初期,取新葉組織0.05 g,在液氮下研磨,放入50 mL試管中,加25 mL的95%乙醇混勻置于黑暗條件下,2 h后,取上清液于652 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)OD值,重復(fù)3次[14]。

葉綠素含量(鮮質(zhì)量%)=(OD652×V)/34.5×W

式中:V為提取液總量(mL);W為葉片鮮質(zhì)量(mg)。

1.3 洋蔥葉片超微結(jié)構(gòu)觀察及蠟質(zhì)成分分析

取19061材料有蠟粉和無(wú)蠟粉的葉片進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。將葉片橫切成面積5 mm×5 mm大小,然后用2%的鋨酸熏蒸 24 h,自然風(fēng)干 24 h,用銀膠固定在樣品臺(tái)上,噴金,于SEM掃描電鏡下進(jìn)行觀察[15]。

將葉片浸沒(méi)在裝有15 mL 正己烷的玻璃試管中提取30 s,再在每個(gè)樣品中加入20 μg 正24碳烷烴(C24,SUPELCO,Sigma)標(biāo)樣作為內(nèi)標(biāo),然后用氮?dú)獯蹈?。加?00 μL N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA,SUPELCO,Sigma),90 ℃恒溫箱衍生30 min。然后用氮?dú)獯蹈裳苌鷦?加入1 mL 正己烷溶解樣品,過(guò)濾轉(zhuǎn)移至新的色譜瓶。采用氣相色譜儀質(zhì)譜儀(Thermo Trace1310 ISQ)分析樣品,色譜柱:30 m×0.25 mm×0.25 μm;柱溫:初溫60 ℃保持5 min,以 3.5 ℃/min升至100 ℃,保持5 min;再以 8 ℃/min升至200 ℃,保持5 min;再以 15 ℃/min升至280 ℃,保持15 min;進(jìn)樣口溫度:280 ℃;載氣流速:1.2 mL/min;不分流;質(zhì)譜條件:離子源溫度:280 ℃,傳輸線溫度:250 ℃;質(zhì)譜:EI源 轟擊電壓:70 eV。自動(dòng)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù),對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)譜圖及參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)機(jī)檢結(jié)果進(jìn)行核對(duì),確定成分,按面積歸一化法計(jì)算各組分含量[16]。

1.4 洋蔥無(wú)蠟粉突變材料SSR篩選及差異分析

利用前期無(wú)蠟粉與有蠟粉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的SSR引物進(jìn)行篩選分析,隨機(jī)選取335對(duì)引物對(duì)同一株有蠟粉植株自交分離的無(wú)蠟粉和有蠟粉材料驗(yàn)證,取新鮮葉片,液氮研磨,采用北京天根DNA試劑盒(型號(hào):DP350-03)提取洋蔥基因組DNA,引物由福州白鯨生物科技有限公司合成(表1),PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)置于TAKARA公司,反應(yīng)體系為25 μL,包括:2 μL DNA(0.1 μg), 2.5 μL 10× PCR buffer,1.25 μL(10 μmol/L)正向引物,1.25 μL(10 μmol/L)反向引物,2 μL dNTPs(10 mmol/L),0.25 μLTaq酶和 15.8 mL ddH2O,95 ℃預(yù)變性 5 min;95 ℃變性 30 s、58 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸 10 min。擴(kuò)PCR產(chǎn)物采用9%的聚丙烯酰氨凝膠垂直電泳檢測(cè),電壓100 V,電泳 3 h,硝酸銀染色,相機(jī)在膠片燈上拍照記錄[14]。對(duì)篩選出有差異位點(diǎn)的引物,選用19212、19238、19061 3份材料有蠟粉和無(wú)蠟粉的材料進(jìn)行標(biāo)記驗(yàn)證。

表1 洋蔥SSR標(biāo)記引物

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥突變材料形態(tài)特征及主要農(nóng)藝性狀

2.1.1 洋蔥無(wú)蠟粉突變株葉片顏色鑒定 無(wú)蠟粉洋蔥苗期因葉片小很難發(fā)現(xiàn),葉片顏色較正常植株呈亮綠色,有光澤(圖1-B),種球秋季種植發(fā)芽后全株葉片均表現(xiàn)無(wú)蠟粉特征(圖1-A左),花薹表面無(wú)明顯白色蠟粉,但有一層薄薄的透明粉層(圖1-B);正常植株葉片表面覆蓋白色蠟粉層(圖1-A右),花薹顏色綠色表面泛白(圖1-C)。

對(duì)19212、19238、19061 3份材料與有蠟粉正反授粉,F1均有蠟粉,套袋單株自交后F2苗期葉片出現(xiàn)分離,有蠟粉與無(wú)蠟粉分離比為約為3∶1(表2),表明洋蔥葉片蠟粉受隱性單基因控制。

2.1.2 洋蔥無(wú)蠟粉突變株農(nóng)藝性狀 對(duì)洋蔥球型、皮色、熟期、葉形、莖高、葉片開展角度、平均單球質(zhì)量、使用殺蟲劑和未使用殺蟲劑后薊馬數(shù)量等農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)觀察,前期在紫皮、黃皮和白皮均有收集到無(wú)蠟粉突變株,但白皮和黃皮材料突變數(shù)量比較少。無(wú)蠟粉洋蔥苗期長(zhǎng)勢(shì)比正常的要弱,葉片細(xì)長(zhǎng),熟期較晚,但對(duì)產(chǎn)量的影響不大,與自身的材料有關(guān),19212、19233單球質(zhì)量分別達(dá)326 g、352 g(表3),已達(dá)到市場(chǎng)商品種的單球質(zhì)量。另外由于苗期長(zhǎng)勢(shì)弱,達(dá)不到春化抽薹的標(biāo)準(zhǔn),因此無(wú)蠟粉突變體均未發(fā)生抽薹,對(duì)照組抽薹在3%～5%。不同洋蔥球膨大初期葉綠素含量之間差異顯著,有蠟粉772、1924、1937 3份總?cè)~綠素含量較高,952、1870、1922有蠟粉與無(wú)蠟粉葉綠素含量差異顯著,另外葉綠素含量多少與洋蔥單球質(zhì)量之間無(wú)相關(guān)性,田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)洋蔥19212雖然葉片直立,葉綠素含量少,但單球質(zhì)量高達(dá)326 g,說(shuō)明葉片生物學(xué)轉(zhuǎn)化率高,適合高密度栽培提高產(chǎn)量,同時(shí)莖桿高達(dá)11.5 cm,適合未來(lái)發(fā)展機(jī)械化去秧。盡管19233單球質(zhì)量最高352 g,單葉片粗、葉片頂部彎,開展度也達(dá)最大60°,田間整體效果不適合高密度栽培和機(jī)械化 發(fā)展。

表3 洋蔥生物學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

莖高和葉片開展度對(duì)薊馬影響不大,對(duì)照正常有蠟粉材料772、952、1870、1922、1924、1937在未使用殺蟲劑的情況下,薊馬數(shù)量顯著高于無(wú)蠟粉材料,與使用殺蟲劑后的效果差不多,表明無(wú)蠟粉突變體材料在不使用殺蟲劑的情況下能夠達(dá)到抗蔥薊馬的效果(表3)。

薊馬主要危害洋蔥葉片表面結(jié)構(gòu),啃食過(guò)后會(huì)在洋蔥葉表面留下白色傷斑(圖2),無(wú)蠟粉洋蔥葉片薊馬數(shù)量少,說(shuō)明無(wú)蠟粉葉片對(duì)薊馬無(wú)吸引力,或者薊馬對(duì)其產(chǎn)生抵觸。根據(jù)無(wú)蠟粉洋蔥葉片被薊馬危害情況,建立評(píng)價(jià)田間自然條件下無(wú)蠟粉突變體對(duì)不同薊馬的抗性級(jí)別標(biāo)準(zhǔn) (表4)。

表4 洋蔥無(wú)蠟粉突變體抗薊馬評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.2 洋蔥葉片表面超微結(jié)構(gòu)觀察

洋蔥膨大初期葉片快速生長(zhǎng),突變型與正常葉片視覺(jué)光滑度差異極為顯著,正常洋蔥葉片覆有蠟粉層,突變體葉片光滑,顏色亮綠。電鏡觀察(圖3)發(fā)現(xiàn)正常葉片表面有蠟質(zhì)晶體,以顆粒狀為主,分散均勻;無(wú)蠟粉葉片表面有少量細(xì)小的顆粒狀晶體、無(wú)聚集,說(shuō)明無(wú)蠟粉突變體葉片并不是沒(méi)有蠟質(zhì),而是蠟質(zhì)晶體非常少,肉眼不足以觀 察到。

箭頭指向?yàn)橄炠|(zhì)晶體;A.正常有蠟粉洋蔥;B.無(wú)蠟粉突變體洋蔥

洋蔥盛花期間,整個(gè)花薹的蠟粉會(huì)越來(lái)越多,形成白色蠟粉霜層,用手輕輕擦拭會(huì)露出綠色組織(圖4-A,4-C),手上留有白色蠟粉;而無(wú)蠟粉突變體葉片生長(zhǎng)過(guò)程中觀察均無(wú)明顯白色蠟粉,但在花薹后期表面有一層光亮的蠟質(zhì),用手擦拭明顯感覺(jué)到一層透明蠟粉被擦拭下來(lái)(圖4-B, 4-D),說(shuō)明無(wú)蠟粉突變體并不是絕對(duì)無(wú)蠟粉。

A.有蠟粉花薹; B.無(wú)蠟粉洋蔥花薹;C.有蠟粉花薹表面蠟粉層被擦除后;D.無(wú)蠟粉花薹表面蠟粉被擦除后

2.3 洋蔥葉片蠟質(zhì)成分分析

采用氣相質(zhì)譜儀對(duì)洋蔥膨大初期葉片表面蠟質(zhì)成分進(jìn)行分析,正常葉片與無(wú)蠟粉葉片分別離鑒定出46和41種化合物,兩者相同化合物有20種,其他均不同。相同的化合物均占總量的92%以上,兩者不同的化合物占比非常少,兩種洋蔥葉片蠟質(zhì)成分相對(duì)含量高的9種化合物,有蠟粉與無(wú)蠟粉葉片蠟質(zhì)化合物分別占總量的96.07%、91.47%,表明洋蔥無(wú)蠟粉葉片的表面并不缺乏蠟質(zhì)成分。洋蔥有蠟粉與無(wú)蠟粉葉片蠟質(zhì)主要成分含量對(duì)比發(fā)現(xiàn),16-三十一酮在無(wú)蠟粉葉片中由相對(duì)含量52.66%降低到2.79%,芥酸酰胺和和2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)兩種化合物含量在無(wú)蠟粉葉片中均增加。其他化合物含量占比均差異不明顯,另外在各自含量較多的9種化合物中,二十五烷和14-二十九烷酮在無(wú)蠟粉單獨(dú)檢測(cè)出,兩者相對(duì)含量占7.77%;二十八烷和醚菌酯在有蠟粉葉片單獨(dú)有檢測(cè)出,兩者相對(duì)含量占4.17%(表5),表明這幾種增加和獨(dú)有的化合物對(duì)洋蔥葉片蠟粉的視覺(jué)表型可能無(wú)影響,而蠟粉中含量最高的16-三十一酮含量的減少是影響洋蔥無(wú)蠟粉突變體表型的主要化合物。

表5 洋蔥葉片蠟質(zhì)成分化合物相對(duì)含量

2.4 洋蔥無(wú)蠟粉突變材料SSR篩選及差異分析

利用355對(duì)SSR引物對(duì)洋蔥19061材料單株自交分離無(wú)蠟粉和有蠟粉葉片混合DNA進(jìn)行篩選,有19對(duì)引物未擴(kuò)增出條帶,在剩余的336對(duì)引物中篩選出兩對(duì)引物196和引物304擴(kuò)增有差異條帶,196引物在無(wú)蠟粉中缺200 bp條帶的差異,差異條帶清晰明顯(圖5),引物304條帶較為淡,其他引物均無(wú)差異或差異不明顯。為驗(yàn)證兩對(duì)引物是否能夠區(qū)分其他無(wú)蠟粉與有蠟粉植株,發(fā)現(xiàn)并不能夠區(qū)分有蠟粉與無(wú)蠟粉植株,而對(duì)19061材料的有蠟粉與無(wú)蠟粉單株DNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),同樣是不能夠區(qū)分無(wú)蠟粉與有蠟粉,而只能區(qū)分其中的一株材料具有差異位點(diǎn),所以引物196和304不能作為分子標(biāo)記來(lái)區(qū)分洋蔥有蠟粉與無(wú)蠟粉材料,作為單株特異性標(biāo)記。

3 討 論

植物表面蠟質(zhì)具有防止非氣孔的水分散失、病蟲害的侵入和太陽(yáng)輻射的生物學(xué)功能[17],洋蔥葉片無(wú)蠟粉突變體在整個(gè)生育周期中,葉片均表現(xiàn)出無(wú)蠟粉的特征,葉片表現(xiàn)亮綠色,能夠明顯區(qū)分正常洋蔥;正反交遺傳表明受隱性單基因控制,與前人研究大蔥[5]、洋蔥[18]、小青菜[19]和甘藍(lán)[20]等葉片無(wú)蠟粉突變遺傳規(guī)律一致。

從收集到的無(wú)蠟粉材料中,部分洋蔥球產(chǎn)量達(dá)到商品種的標(biāo)準(zhǔn),尤其是無(wú)蠟粉材料苗期長(zhǎng)勢(shì)弱,從而避免返春先期抽薹的情況。從表型觀察到無(wú)蠟粉葉色為亮綠色,但總?cè)~綠素含量相對(duì)正常有蠟粉洋蔥低,也進(jìn)一步解釋苗期相對(duì)弱的情況。

植物角質(zhì)層蠟參與角質(zhì)形成以及針對(duì)非生物和生物脅迫的防御反應(yīng)[21]。甘藍(lán)葉表皮蠟質(zhì)含量與跳蚤甲蟲、卷心蟲生物造成的傷害程度之間均存在明顯的負(fù)相關(guān)[22],研究表明甘藍(lán)表皮蠟是抗蟲的重要物質(zhì)[23]。但洋蔥無(wú)蠟粉突變體表現(xiàn)出抗蔥薊馬的特征,在不使用農(nóng)藥的情況下無(wú)蠟粉突變體上薊馬數(shù)量和有蠟粉使用殺蟲劑效果基本相同,另外不同的材料之間的抗薊馬程度也不相同。與國(guó)外研究洋蔥無(wú)蠟粉突變體抗薊馬結(jié)果基本一致,發(fā)現(xiàn)不同基因型的洋蔥葉的顏色和蠟質(zhì)對(duì)薊馬抗性有關(guān):淺綠色至綠色的葉子,葉片蠟含量少,葉子光滑的基因型具有抗性,而葉子不光滑、有蠟粉的基因型易感薊馬[24-25]。另外,研究發(fā)現(xiàn)洋蔥的葉片表皮可以作為取食的引誘劑,因此,更薄的表皮厚度可以減少薊馬的危害[26]。

在有蠟粉(非突變體)洋蔥研究抗薊馬中發(fā)現(xiàn),具有封閉(緊密)葉腋紋(開展度),藍(lán)色至深綠色葉色和蠟質(zhì)葉是洋蔥薊馬的優(yōu)選,而具有開放葉腋形圖案,淺綠色葉色和光澤(非蠟質(zhì))葉子對(duì)薊馬具有一定的抗性[27]。在本研究洋蔥無(wú)蠟粉突變體中,薊馬數(shù)量多少與葉片開張度關(guān)系不大,因?yàn)楸旧頍o(wú)蠟粉具有抗薊馬特征,薊馬數(shù)量相對(duì)少,同時(shí)薊馬是晝伏夜出,所以開張度越小越有利于薊馬的躲藏。不同作物中蔥薊馬對(duì)顏色的吸引有所不同,馬鈴薯田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)蔥薊馬表現(xiàn)出對(duì)中綠色的偏愛(ài),而不是紅色、藍(lán)色和白色[28]。在白、黃、藍(lán)、熒光黃誘捕劑對(duì)蔥薊馬的引誘作用,發(fā)現(xiàn)熒光黃誘捕的薊馬最多[29],洋蔥無(wú)蠟粉突變體葉片顏色的變化,可能對(duì)蔥薊馬有一定的影響。

本研究對(duì)無(wú)蠟粉突變和有蠟粉洋蔥膨大初期的葉片蠟質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)主要成分為酮、脂肪醇和烷三大類,盡管鑒定有46種化合物,但洋蔥蠟質(zhì)主要成分是16-三十一酮,而無(wú)蠟粉葉片16-三十一酮的大量減少導(dǎo)致葉片表現(xiàn)出無(wú)蠟粉的特征,與前人研究一致,16-三十一酮是負(fù)責(zé)洋蔥葉片上的視覺(jué)蠟質(zhì)。在視覺(jué)上介于蠟質(zhì)和光澤之間的 “半光澤”[7],可以保護(hù)葉子免受疾病或環(huán)境脅迫,同時(shí)仍然賦予對(duì)洋蔥薊馬的抗性。Munaiz等[30]研究蠟質(zhì)成分檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)無(wú)蠟粉突變體并不缺失主要蠟質(zhì)成分,只是部分含量的減少,尤其的洋蔥抽薹開花后期,大量的白色蠟質(zhì)集中在花薹上形成白霜層,無(wú)蠟粉突變體也產(chǎn)生少量的白色蠟質(zhì)晶體,與電鏡掃描觀察結(jié)果相一致,進(jìn)一步說(shuō)明16-三十一酮在表型蠟粉中起關(guān)鍵作用。

研究發(fā)現(xiàn)16-三十一酮是控制蠟粉的主要成分,酮類化合物代謝合成途徑中cer1基因被鑒定為控制甘藍(lán)光澤表型的候選基因,39 bp缺失導(dǎo)致mRNA破壞并降低BrCER1基因的表達(dá)。序列分析表明,Brcer1基因的功能缺失突變與Cgl1不同,Cgl1之前已被證明是甘藍(lán)中光澤表型的原因[19],顯示了典型的平行選擇,對(duì)洋蔥表皮蠟生物合成途徑提供研究思路。

為了進(jìn)一步開發(fā)洋蔥無(wú)蠟粉突變體分子相關(guān)標(biāo)記,利用無(wú)蠟粉突變體測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組SSR進(jìn)行篩選,在混和DNA樣品19061中比較有蠟粉與無(wú)蠟粉差異位點(diǎn),初步篩選出196和304兩對(duì)有差異位點(diǎn)的引物,但利用其他無(wú)蠟粉材料的DNA進(jìn)行驗(yàn)證,并不是無(wú)蠟粉特異分子標(biāo)記,需要進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序分析堿基情況。 為直接應(yīng)用洋蔥無(wú)蠟粉突變體抗蔥薊馬特性,后期課題組將會(huì)從綜合性狀優(yōu)良的材料中,利用jnurf13分子標(biāo)記篩選保持株做父本,創(chuàng)制抗蟲不育系,直接應(yīng)用生產(chǎn)全不育型洋蔥無(wú)蠟粉抗蟲雜交新品系,為國(guó)內(nèi)洋蔥自主創(chuàng)新育種奠定基礎(chǔ)。