王 君 唐慶強(qiáng) 李二鵬 楊 方 曹曉鋼* 王曉龍

(1.拉薩海關(guān)技術(shù)中心,拉薩 850002;2.福州海關(guān)技術(shù)中心,福州 350001)

藏香是一類以柏木泥為主料,以榆樹皮等為黏合劑,添加一種或多種純天然藥材及香料制成的燃香,在西藏地區(qū)有長(zhǎng)達(dá)1 300多年的使用歷史,素有“有炊煙的地方就能聞到藏香的芬芳”的說(shuō)法,是西藏地區(qū)百姓不可或缺的生活用品[1]。藏香獨(dú)特的制作工藝,純天然的原材料,使藏香由“寺廟專貢格局”發(fā)展為如今“跨出區(qū)外走向世界”的趨勢(shì),在中國(guó)香港、中國(guó)臺(tái)灣、東南亞、美國(guó)、歐洲等地都可以聞到來(lái)自雪域高原的氤氳芬芳[2]。據(jù)藏香協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),近年來(lái)藏香產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,年均銷售額達(dá)20多億元,正成為西藏經(jīng)濟(jì)發(fā)展新的增長(zhǎng)點(diǎn)。隨著藏香市場(chǎng)需求的擴(kuò)大,常有不法商家用其他地區(qū)生產(chǎn)的燃香“貼牌”假冒藏香銷售。為了保護(hù)地方特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展,維護(hù)藏香品牌價(jià)值,急需開(kāi)發(fā)西藏藏香產(chǎn)地判別的方法。

藏香起源于藏醫(yī)藥,原料來(lái)源復(fù)雜,種類眾多,以西藏地區(qū)的特色植物為主,受西藏特殊地理環(huán)境的影響,其元素含量與西藏以外地區(qū)(區(qū)外)燃香存在差異,元素含量分析結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)已成為不同產(chǎn)品進(jìn)行產(chǎn)地判別最有效的手段之一[3-5],這為藏香的產(chǎn)地判別提供了研究基礎(chǔ)。目前,對(duì)燃香中多元素的檢測(cè)方法研究較少,且都集中在少數(shù)重金屬元素上。燃香中元素檢測(cè)方法包括電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法[6-9],未涉及稀土元素的檢測(cè),且均未考察基質(zhì)效應(yīng)。稀土元素作為地球化學(xué)示蹤劑,在產(chǎn)地判別上具有很大的應(yīng)用價(jià)值[10-12],對(duì)包括稀土在內(nèi)的多種元素的測(cè)定可為產(chǎn)地判別提供有潛力的特征指標(biāo)。

微波消解耗酸量少,用時(shí)短,不易引入外界污染,對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品更易消解完全。電感耦合等離子體質(zhì)譜法靈敏度高、檢出限低,可同時(shí)檢測(cè)多種元素,在多樣本量多元素的測(cè)定中具有較大的優(yōu)勢(shì)。本研究建立西藏藏香中34種元素含量測(cè)定的微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法,對(duì)西藏藏香和區(qū)外燃香樣品進(jìn)行檢測(cè),并結(jié)合方差分析、正交偏最小二乘判別(OPLS-DA)分析、線性判別(LDA)分析和主成分(PCA)分析,確定不同區(qū)域樣品中元素的含量特征及差異性,篩選出特征指標(biāo),建立西藏藏香的產(chǎn)地判別模型。為基于元素含量的藏香產(chǎn)地判別提供檢測(cè)方法,為西藏藏香產(chǎn)地判別提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品采集與制備

采集西藏藏香36份(拉薩地區(qū)22份、山南地區(qū)14份),西藏地區(qū)以外(區(qū)外)燃香樣品31份(福建7份、廣東10份、江蘇11份、印度香3份),將樣品粉碎,過(guò)60目(0.25 mm)篩子,混勻,待用。

1.2 儀器與試劑

微波消解儀(安東帕 Multiwave 3000),電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(安捷倫 7700e),電子天平(賽多利斯 LE225D,感量為0.000 1 g),超純水儀(密理博 Milli-Q,電阻率18.2 MΩ·cm)。

硝酸(優(yōu)級(jí)純,CNW),過(guò)氧化氫(優(yōu)級(jí)級(jí),國(guó)藥集團(tuán)),16種稀土元素鈧(Sc)、釔(Y)、鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鐿(Yb)、镥(Lu)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100 μg/mL,鋼研納克),釩(V)、鈷(Co)、砷(As)、鎳(Ni)、銅(Cu)、鉛(Pb)、硒(Se)、鎘(Cd)、鉬(Mo)、銦(In)、錫(Sn)、銻(Sb)、鉈(Tl)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鋅(Zn)、銣(Rb)、鋇(Ba)單元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100 μg/mL,鋼研納克);鍺(Ge)、銠(Rh)、鉍(Bi)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100 μg/mL,鋼研納克);鋰(Li)、鎂(Mg)、鈷(Co)、鈰(Ce)、鉈(Tl)、釔(Y)調(diào)諧溶液(1 μg/L,安捷倫科技有限公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:通過(guò)對(duì)藏香元素測(cè)定的預(yù)實(shí)驗(yàn),將34種元素分為兩組,元素含量較低的29種元素Sc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、V、Co、As、Ni、Cu、Pb、Se、Cd、Mo、In、Sn、Sb、Tl為A組,標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為0、2、5、10、20、50、100 μg/L;元素含量較高5種元素Cr、Mn、Zn、Rb、Ba為B組,標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度范圍為0、20、50、100、200、500、1 000 μg/L。

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確量取Ge、Rh、Bi內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100 μg/mL)各1.0 mL于100 mL容量瓶中,加入2.0 mL硝酸,用超純水定容至刻度,得到1.0 mg/L內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,供34種元素測(cè)定時(shí)在線使用。

1.4 樣品前處理

取0.3 g(精確到0.000 1 g)藏香樣品于微波消解罐內(nèi),加入4 mL硝酸和2 mL H2O2,冷消解過(guò)夜后用微波消解儀進(jìn)行消解。消解程序:1)10 min,功率升至500 W,保持10 min;2)15 min,功率升至800 W,保持20 min;3)20 min,功率升至1 200 W,保持30 min;4)30 min,功率降至0 W。消解完成冷卻至室溫后,取出消解內(nèi)罐超聲5 min,用超純水潤(rùn)洗轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,定容至刻度,混勻,所得樣品消解溶液用ICP-MS測(cè)定。同時(shí)做樣品空白實(shí)驗(yàn)。

1.5 儀器工作條件

采用濃度為1.0 μg/L的調(diào)諧溶液,優(yōu)化ICP-MS 7700e儀器工作參數(shù),優(yōu)化后的條件見(jiàn)表1。

表1 ICP-MS儀器工作條件

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析和線性判別分析(LDA),利用Sicma 14.0軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA),利用MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行主成分分析(PCA)與熱圖聚類分析。由于藏香樣品各元素含量數(shù)量級(jí)差異較大,在分析之前對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品取樣量

藏香的原材料為各類木料、香辛料及中藥材,配方復(fù)雜,不易消解。樣品取樣量過(guò)少,會(huì)對(duì)一些含量較低的元素檢測(cè)造成較大的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差;樣品取樣量過(guò)多,容易造成消解不徹底,還會(huì)增加含量較高元素污染儀器設(shè)備的風(fēng)險(xiǎn)。本方法采取微波消解體系,根據(jù)消解方式和儀器設(shè)備的特點(diǎn),比較了0.1、0.3和0.5 g取樣量時(shí)的情況,結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明,對(duì)不同取樣量的同一藏香樣品平行測(cè)定6次,取樣量為0.3 g時(shí)各元素的精密度(RSD)最小,為1.7%～4.5%,且消解后樣品澄清。取樣量為0.1 g時(shí)RSD值為2.0%～10.2%,取樣量為0.5 g時(shí)RSD值為1.8%～7.4%,且消解后的樣液呈淺棕色,并有沉淀物,因此,實(shí)驗(yàn)選擇消解效果最好的0.3 g作為方法的取樣量。

圖1 不同取樣量下藏香各元素含量RSD值(n=6)

2.2 微波消解酸體系

微波消解通常采用HNO3或HNO3與其他酸混合來(lái)消解樣品。因?yàn)槁然铩⒘蛩猁}的引入,會(huì)帶入35Cl16O+、37Cl14N+、34S16O1H+、35Cl16O1H+、32S16O2+、32S2+、37Cl37Cl+、40Ar35Cl+、38Ar37Cl+等分子離子,進(jìn)而對(duì)51V、52Cr、64Zn,74Se、75As等元素產(chǎn)生嚴(yán)重干擾,因此首先排除了HCl和H2SO4作為消解溶液[13]。在濕法消解中常用的HClO4因強(qiáng)氧化性對(duì)有機(jī)物有很好的消解作用,但HClO4膨脹系數(shù)大,加熱后在密閉環(huán)境中容易爆炸,不宜在微波消解中采用[14]。HF對(duì)樣品中的Si有很好的消解作用,但消解過(guò)程中生成了難溶性氟化稀土物,會(huì)導(dǎo)致部分稀土元素結(jié)果偏低[15]。中藥材、香辛料等基質(zhì)多采用HNO3、HNO3+H2O2進(jìn)行微波消解[16-18],重點(diǎn)考察這兩種消解方式。分別考察6 mL HNO3、4 mL HNO3+2 mL H2O2時(shí)的消解效果。結(jié)果表明,采用6 mL HNO3消解時(shí)會(huì)有較多的沉淀,而使用4 mL HNO3+2 mL H2O2的消解液澄清,這說(shuō)明HNO3和H2O2配合使用具有更強(qiáng)的氧化性,適合藏香等復(fù)雜基質(zhì)的樣品。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜干擾主要有同量異位素干擾、豐度較大的同位素對(duì)相鄰元素的干擾、多原子離子干擾、物理干擾和基體抑制等[13,19-20]。通過(guò)選擇豐度和靈敏度高、干擾相對(duì)少的同位素及調(diào)整分辨率來(lái)提高分析的準(zhǔn)確度,通過(guò)適當(dāng)稀釋(定容至50 mL)及采用涵蓋高、中、低質(zhì)量數(shù)元素的內(nèi)標(biāo)(Ge、Rh、Bi)優(yōu)化儀器參數(shù),減少物理干擾和基質(zhì)效應(yīng)。氦氣碰撞反應(yīng)池技術(shù)(KED)可以有效消除氬氣系統(tǒng)及高基體背景下形成的干擾,提高準(zhǔn)確度。此外,55Mn易受本底分子離子40Ar14N1H+、40Ar15N+、36Ar18O1H+、38Ar16O1H+、37Cl17O1H+的干擾,63Cu則受36Ar12C14N1H+、14N12C37Cl+、16O12C35Cl+、46Ca16O1H+等的嚴(yán)重干擾,75As會(huì)被40Ar35Cl+、36Ar38Ar1H+、38Ar37Cl+、43Ca16O16O+、23Na12C40Ar+、40Ca35Cl+等干擾,從而導(dǎo)致這些元素的結(jié)果偏高。為了進(jìn)一步減少干擾,考察不同碰撞氣流量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,測(cè)試3.0、4.0、5.0 mL/min時(shí)的碰撞氣效果,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同碰撞氣流量對(duì)Mn(a)、Cu(b)、As(c)回收率的影響

結(jié)果表明,碰撞氣流量為5.0 mL/min時(shí),雖然55Mn、63Cu、75As回收率都較為合理,但34種元素中一些低含量元素的回收率較低,一些低質(zhì)量端元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)較差。碰撞氣流量為4.0 mL/min時(shí),雖然55Mn的高濃度回收率121%略微偏高,但其余各元素的回收率和標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)都較好,因此實(shí)驗(yàn)選擇4.0 mL/min的碰撞氣流量。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的影響

藏香配方多樣,原料復(fù)雜,由此帶來(lái)的基質(zhì)效應(yīng)很有可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。參考GONZALEZ 等[21]的方法,以2%硝酸配制的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為SlopeS,用藏香消解液為溶劑配制的相同標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為SlopeM,按基質(zhì)效應(yīng):ME=(S-M)/S×100%的公式計(jì)算藏香樣品的基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 藏香樣品中基質(zhì)效應(yīng)情況

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1 線性關(guān)系、檢出限和定量下限

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按儀器工作條件測(cè)定,采用內(nèi)標(biāo)法定量,以各元素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),各元素與內(nèi)標(biāo)測(cè)量值的比值為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線。按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)11個(gè)空白溶液進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(s),將3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差(3s)作為方法檢出限,10倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差(10s)作為定量下限。34種元素的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及方法檢出限,定量下限見(jiàn)表2。

表2 34種元素的線性、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

從圖3中可以看出,藏香34種元素ME值在-10%～16.6%。根據(jù)基質(zhì)效應(yīng)的判斷方法,當(dāng)|ME|<20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng),20%<|ME|<50%時(shí)為中等強(qiáng)度基質(zhì)效應(yīng),|ME|>50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng),由此可以得出,本方法處理藏香的基質(zhì)效應(yīng)多處在弱基質(zhì)效應(yīng)范圍里,表明方法的前處理效果良好,不需要進(jìn)一步進(jìn)行基質(zhì)補(bǔ)償,可以滿足檢測(cè)方法的要求。

2.5.2 方法的精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取同一藏香樣品,在低、中、高3個(gè)添加水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),對(duì)本底值較低的A組元素分別添加2、10、20 μg/L三個(gè)水平,對(duì)本底值較高的B組元素則添加20、100和200 μg/L三個(gè)濃度水平,分別平行測(cè)定6次,計(jì)算測(cè)定值的精密度(RSD)和加標(biāo)回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 元素回收率和精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(n=6)

由表3可知,采用本實(shí)驗(yàn)儀器工作條件和實(shí)驗(yàn)方法,加標(biāo)回收率在88.7%～121%,RSD值在1.5%～5.6%,滿足檢測(cè)方法的要求。

2.6 產(chǎn)地判別分析

2.6.1 元素含量特征分析

應(yīng)用本方法分析67份樣品,測(cè)定結(jié)果及顯著性差異見(jiàn)表4。從表4可知,西藏藏香樣品中V、Cr、As、Se、In、Sc、Y、Ce、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu等19種元素含量與區(qū)外燃香樣品差異顯著(p<0.05),由此可見(jiàn),西藏藏香和區(qū)外燃香的元素含量有較明顯的地域差異。測(cè)定的16種稀土元素中,其中有14種在西藏藏香中平均含量較區(qū)外燃香高,這提示在西藏特有的地理環(huán)境條件下,植物可能更容易富集稀土元素。

表4 樣品分析結(jié)果

2.6.2 正交偏最小二乘判別(OPLS-DA)分析

以34種元素含量作為因變量,不同產(chǎn)地作為自變量,進(jìn)行OPLS-DA分析,自變量擬合指數(shù)(R2x)為0.809,因變量擬合指數(shù)(R2y)為0.716,模型預(yù)測(cè)指數(shù)(Q2)為0.576,R2和Q2超過(guò)0.5表示模型擬合結(jié)果可接受[22],西藏藏香主要處于第三、四象限,區(qū)外燃香主要處于第二象限,地域差別顯著(圖4a),有5份區(qū)外燃香處于置信區(qū)間以外,這可能是因?yàn)閰^(qū)外燃香樣品產(chǎn)地較多,且燃香配方多變?cè)斐傻摹＿M(jìn)行200次置換檢驗(yàn)(Permutation test),如圖4b所示,置換檢驗(yàn)的R2=0.138,Q2=-0.333,表明該模型沒(méi)有過(guò)擬合現(xiàn)象(R2<0.5,Q2<0),模型驗(yàn)證有效,該模型可用于西藏藏香的產(chǎn)地判別分析。34種元素VIP值見(jiàn)表4,VIP值越大,對(duì)判別的影響越顯著。VIP>1表明其對(duì)樣品判別結(jié)果權(quán)重影響率>50%,對(duì)判別結(jié)果影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[23]。以VIP>1、p<0.05為標(biāo)準(zhǔn),篩選得到Sc、V、Cr、As、Y、In、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu共17種具有顯著差異的元素。

圖4 不同地區(qū)燃香OPLS-DA分析樣品得分圖(a)和模型置換檢驗(yàn)結(jié)果(b)

2.6.3 線性判別(LDA)分析

采用LDA法進(jìn)一步考察17種元素含量對(duì)藏香產(chǎn)地的判別情況,以這17種元素含量作為判別分析的自變量,建立產(chǎn)地判別模型。通過(guò)逐步判別分析,對(duì)藏香產(chǎn)地判別存在顯著差異的Sc、Cr、In、Gd、Tb、Tm元素被引入到判別模型中,構(gòu)建的典型判別函數(shù)為:F=0.931Sc-0.840Cr+0.4In-9.066Gd+11.358Tb-2.164Tm。利用回代檢驗(yàn)和留一交叉驗(yàn)證兩種方法對(duì)LDA判別模型進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果見(jiàn)表5,西藏藏香和區(qū)外燃香2個(gè)區(qū)域樣品回代檢驗(yàn)判別正確率為97.0%,留一法交叉檢驗(yàn)的判別正確率為95.5%,說(shuō)明6種特征元素構(gòu)建的判別模型可以有效地判別藏香產(chǎn)地。Fisher線性判別函數(shù)如下:

表5 不同產(chǎn)地藏香樣品判別分析分類結(jié)果

Y(西藏)=1.460Sc-1.317Cr+0.627In-14.213Gd+17.808Tb-3.393Tm-1.850

Y(區(qū)外)=-1.696Sc+1.530Cr-0.728In+16.506Gd-20.680Tb+3.940Tm-2.428

2.6.4 主成分(PCA)分析及熱圖聚類

為了進(jìn)一步驗(yàn)證6種特征元素對(duì)西藏藏香產(chǎn)地判別的準(zhǔn)確性,以6種特征元素含量進(jìn)行PCA分析,見(jiàn)圖5,前3個(gè)主成分PC1、PC2、PC3方差貢獻(xiàn)率分別為68.5%、18.1%、11.2%,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)97.8%,因此選取前3個(gè)主成分分析樣本具有較強(qiáng)的可靠性。2個(gè)不同區(qū)域的樣品雖出現(xiàn)個(gè)別重疊的情況,但具有較為明顯的分類趨勢(shì),且不同產(chǎn)地樣品的分布相對(duì)集中。6種特征元素含量熱圖分析,見(jiàn)圖6,可以看出2個(gè)不同區(qū)域的樣品有顯著差異,具有較好的分類效果。西藏藏香樣品中Sc、Gd、Tb、Tm、In 5種元素含量較突出,區(qū)外燃香中Cr含量較突出。因此,6種特征元素的PCA分析對(duì)西藏藏香的產(chǎn)地判別具有較高的準(zhǔn)確性和可行性。

圖5 基于PCA分析不同地區(qū)燃香3D圖

圖6 不同產(chǎn)地燃香的特征元素聚類熱圖

3 結(jié)論

建立了微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定藏香中34種元素含量的方法,樣品用微波消解,利用在線內(nèi)標(biāo)和氦氣碰撞反應(yīng)池技術(shù)減少基質(zhì)效應(yīng)和離子干擾,內(nèi)標(biāo)法定量。應(yīng)用本方法測(cè)定區(qū)內(nèi)、區(qū)外樣品67份,發(fā)現(xiàn)西藏藏香中19種元素含量與區(qū)外燃香存在地域差異。通過(guò)OPLS-DA、LDA分析,建立了有效的產(chǎn)地判別模型,經(jīng)逐步篩選,將因變量34種元素降維到6種元素。以6種元素進(jìn)行PCA分析及熱圖聚類分析也可以準(zhǔn)確有效地對(duì)西藏藏香進(jìn)行產(chǎn)地判別。本研究能為藏香中多元素的測(cè)定提供快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,為利用元素特征對(duì)藏香的產(chǎn)地判別提供方法支持。