張麗曉 ，戴守方 ，李 蕾 ，王瑞鋒 ，楊麗麗 ，邱金霞 ，尹永波 （1.邢臺市人民醫(yī)院中醫(yī)內科，河北 邢臺 05000；.邢臺市人民醫(yī)院放射科，河北 邢臺 05000；.邢臺市人民醫(yī)院內分泌科，河北 邢臺 05000；.邢臺市人民醫(yī)院耳鼻喉科，河北 邢臺 05000）

糖尿病足與糖尿病神經病變、外周血管疾病有關，是1 型和2 型糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率有逐年增加的趨勢；其特征是血管生成受損，如果治療不當，嚴重時會導致患者截肢或引發(fā)膿毒血癥，嚴重影響了患者的生活質量和生命健康[1—3]。促進血管生成及創(chuàng)面愈合是治療糖尿病足的有效方法之一[4]。因此，研究糖尿病足的發(fā)病機制對于探索新的治療藥物具有重要意義。穿心蓮內酯（andrographolide，Andro）具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，Andro 可通過降低糖尿病小鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）、甘油三酯、腎/體重比、血尿素氮、血清肌酐、24 h 尿蛋白，抑制氧化應激產物活性氧產生和增加促炎細胞因子，從而改善小鼠的糖尿病腎病[6]。Liang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Andro 通過減輕氧化應激、炎癥和細胞凋亡能延緩糖尿病心肌病的進展。Hippo通路及其效應物Yes 相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）在調節(jié)器官生長、組織修復和再生方面起著重要作用[8]。Hippo通路的活化使YAP 失活，從而抑制細胞存活、增殖和血管生成，該通路和YAP是血管生成和傷口愈合的關鍵調節(jié)因子[9—10]，但尚不清楚Andro 能否通過調控Hippo-YAP 信號通路影響糖尿病足血管生成。因此，本研究主要探究Andro 對糖尿病足大鼠血管生成的影響以及其機制，以期為糖尿病足的治療提供新的參考依據。

1 材料

1.1 主要儀器

ACCU-CHEK Performa 型卓越快速血糖儀購自美國羅氏生物科技公司；3100型全自動生化分析儀購自日本日立有限公司；H1-16K 型冷凍高速離心機購自湖南可成儀器設備有限公司；DM500型光學顯微鏡購自德國Leica儀器有限公司；FACSCalibur型流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 主要藥品與試劑

Andro標準品（純度≥98%，貨號B20207）、維替泊芬（Hippo-YAP 信號通路特異性抑制劑，純度為97%，貨號S80258）均購自上海源葉生物科技有限公司；鏈脲佐菌素（貨號S0130）購自上海寶曼生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒（貨號YT8951）購自北京伊塔生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（貨號G1120-100）購自北京索萊寶科技有限公司；空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）ELISA 試劑盒（貨號FY-A014648）購自上海富雨生物科技有限公司；兔源缺氧誘導因子1α（hypoxiainducible factor 1α，HIF-1α）單克隆抗體（貨號ab179483）、兔源血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單克隆抗體（貨號ab32152）、兔源哺乳動物Ste20樣激酶1（mammalian sterile20-like kinase 1，MST1）單克隆抗體（貨號ab245190）、兔源磷酸化MST1（p-MST1）單克隆抗體（貨號ab51134）、兔源大腫瘤抑制基因1（large tumor suppressor gene1，LATS1）單克隆抗體（貨號ab243656）、兔源磷酸化LATS1（p-LATS1）單克隆抗體（貨號ab111334）、兔源磷酸化YAP（p-YAP）單克隆抗體（貨號ab76252）、兔源YAP單克隆抗體（貨號ab81183）、兔源三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體（貨號ab9485）均購自美國Abcam 公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白G二抗（貨號XY0650）購自上海信裕生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF 級SD 大鼠，5～7 周齡，雌雄各半，體重180～200 g，購自武漢云克隆動物有限公司，生產許可證編號為SCXK（鄂）2018-0021。設置飼養(yǎng)溫度為22 ℃，濕度為55%～60%，12 h光暗循環(huán)適應性喂養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 動物建模、分組和給藥

將90 只大鼠隨機分成Control 組（12 只）和建模組（78 只），各組大鼠雌雄各半。Control 組用普通飼料喂養(yǎng)。建模組參考相關文獻[11]，采用小劑量鏈脲佐菌素聯(lián)合高脂高糖飲食復制2型糖尿病大鼠模型，高脂高糖飲食喂養(yǎng)4周后，按35 mg/kg一次性腹腔注射0.3%鏈脲佐菌素（Control 組按10 mL/kg 注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液），注射后3、7、10 d 取尾靜脈血測量大鼠FBG，連續(xù)3 次測得FBG≥16.7 mmol/L，則為糖尿病模型造模成功。在此基礎上，采用燙傷法建立糖尿病足大鼠模型[12]：將糖尿病模型大鼠用普通飼料喂養(yǎng)4周后，按30 mg/kg 腹腔注射3%戊巴比妥鈉，用恒溫恒壓電熱燙傷儀在壓力為0.5 kg、溫度為80 ℃、作用時間為4 s的設置下，在大鼠右后肢足背造成燙傷，深至皮下，觀察燙傷處皮膚出現(xiàn)蒼白、腫脹、破潰等癥狀；Control組同法進行燙傷處理。將建模成功的大鼠（共60 只）隨機分為Model 組，Andro 低、中、高劑量組和抑制劑組，每組12只。Andro 低、中、高劑量組分別灌胃1、10、20 mg/kg 的Andro溶液[7]和腹腔注射等體積的生理鹽水，抑制劑組灌胃20 mg/kg 的Andro 溶液和腹腔注射100 mg/kg 的維替泊芬[13]，每日1次，連續(xù)給藥2周；Control組、Model組灌胃和腹腔注射等體積的生理鹽水。

2.2 大鼠創(chuàng)面愈合情況的檢測

在造模及給藥期間對大鼠創(chuàng)面邊緣進行測量并拍照，采用Image Pro Plush 6.0 圖像分析系統(tǒng)對創(chuàng)面面積進行測定，并計算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率（%）＝（原始創(chuàng)面面積－未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

2.3 大鼠FBG及FINS含量的測定

藥物處理結束后，大鼠禁食不禁水12 h，剪尾取血，用卓越快速血糖儀測定大鼠的FBG。腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，腹主動脈取血，離心后得到血清，于－20 ℃保存。嚴格按照FINS ELISA試劑盒說明書測量大鼠的FINS含量。

2.4 大鼠創(chuàng)面組織損傷及毛細血管數(shù)的檢測

藥物處理結束后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，分離大鼠創(chuàng)面組織及創(chuàng)面周邊肉芽組織，部分創(chuàng)面及創(chuàng)面周邊肉芽組織在4%多聚甲醛中過夜固定，經蔗糖梯度脫水、石蠟包埋后切片（3 μm）。切片經二甲苯、乙醇脫蠟和水化，以HE染色，然后在顯微鏡下觀察染色結果并拍照，錄入MPIAS-400 彩色病理圖文分析系統(tǒng)，觀察毛細血管數(shù)。

2.5 大鼠外周血內皮祖細胞數(shù)量的檢測

藥物處理結束后，大鼠腹主動脈取血，用流式細胞儀檢測大鼠外周血內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）數(shù)量，具體操作參考文獻[14]。結果以EPCs數(shù)量占外周血單核細胞數(shù)量的百分比表示。

2.6 大鼠血清生化指標的檢測

取“2.3”項下血清，用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）的含量。

2.7 大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 及Hippo-YAP 信號通路相關蛋白表達的檢測

采用Western blot 法進行檢測。提取6 只大鼠創(chuàng)面組織總蛋白，對蛋白進行定量后變性處理。取變性后的蛋白適量，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉至聚偏二氟乙烯膜上，在室溫條件下封閉2 h；加入HIF-1α、VEGF、MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、p-YAP、YAP、GAPDH 一抗（p-MST1 的稀釋比例為1∶2 000，其余一抗稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗（稀釋比例為1∶2 000），37 °C孵育90 min；洗膜后顯影，以Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。以HIF-1α、VEGF 蛋白與內參蛋白（GAPDH）條帶的灰度值比值表示上述蛋白的表達水平，以p-MST1 與MST1、p-LATS1與LATS1、p-YAP 與YAP 蛋白條帶的灰度值比值表示MST1、LATS1、YAP蛋白的磷酸化水平。

2.8 統(tǒng)計與分析

采用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 Andro對大鼠創(chuàng)面愈合情況的影響

Control組，Model組，Andro低、中、高劑量組及抑制劑組大鼠創(chuàng)面愈合率分別為（42.75±2.31）%、（19.65±1.24）% 、（23.68±1.37）% 、（27.83±1.51）% 、（34.26±2.04）%、（21.59±1.26）%。與Control 組比較，Model 組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Andro 低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與Andro 高劑量組比較，抑制劑組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著降低（P＜0.05）。

3.2 Andro對大鼠FBG及FINS含量的影響

與Control 組比較，Model 組大鼠FBG、FINS 含量均顯著升高（P＜0.05）；與Model 組比較，Andro 低、中、高劑量組大鼠FBG、FINS含量均顯著降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與Andro 高劑量組比較，抑制劑組大鼠FBG、FINS含量均顯著升高（P＜0.05），結果見表1。

表1 各組大鼠FBG 及FINS 含量的測定結果（±s，n＝12）

表1 各組大鼠FBG 及FINS 含量的測定結果（±s，n＝12）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Andro低劑量組比較，P＜0.05；d：與Andro中劑量組比較，P＜0.05；e：與Andro高劑量組比較，P＜0.05。

FINS/（mU/L）15.37±1.12 37.52±2.65a 32.10±2.14b 25.45±1.48bc 18.64±1.21bcd 30.25±2.08e分組Control組Model組Andro低劑量組Andro中劑量組Andro高劑量組抑制劑組FBG/（mmol/L）4.67±0.64 19.38±1.36a 16.52±1.21b 12.37±1.04bc 6.87±0.79bcd 17.65±1.34e

3.3 Andro對大鼠創(chuàng)面組織損傷及毛細血管數(shù)的影響

Control 組大鼠創(chuàng)面組織結構正常，細胞排列有序，毛細血管數(shù)較多；與Control 組比較，Model 組大鼠創(chuàng)面組織結構不完整，有大量炎癥細胞浸潤，毛細血管數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與Model 組比較，Andro 低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面組織結構稍顯完整，炎癥細胞浸潤減少，毛細血管數(shù)顯著增加，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與Andro 高劑量組比較，抑制劑組大鼠創(chuàng)面組織結構損傷嚴重，炎癥細胞浸潤增加，毛細血管數(shù)顯著減少（P＜0.05），結果見圖1和表2。

圖1 各組大鼠創(chuàng)面組織HE染色圖

表2 各組大鼠毛細血管數(shù)、EPCs比例的檢測結果（±s，n＝12）

表2 各組大鼠毛細血管數(shù)、EPCs比例的檢測結果（±s，n＝12）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Andro低劑量組比較，P＜0.05；d：與Andro中劑量組比較，P＜0.05；e：與Andro高劑量組比較，P＜0.05。

EPCs比例/%3.57±0.28 2.12±0.14a 2.78±0.17b 3.62±0.21bc 4.35±0.33bcd 2.63±0.12e分組Control組Model組Andro低劑量組Andro中劑量組Andro高劑量組抑制劑組毛細血管數(shù)/根20.14±1.57 5.13±0.46a 8.79±1.02b 13.48±1.12bc 17.94±1.25bcd 10.43±1.10e

3.4 Andro對大鼠外周血EPCs數(shù)量的影響

與Control 組比較，Model 組大鼠EPCs 比例顯著降低（P＜0.05）；與Model 組比較，Andro 低、中、高劑量組大鼠EPCs 比例均顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與Andro高劑量組比較，抑制劑組大鼠EPCs比例顯著降低（P＜0.05），結果見圖2和表2。

圖2 各組大鼠外周血EPCs數(shù)量檢測的流式細胞圖

3.5 Andro 對大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 含量的影響

與Control 組比較，Model 組大鼠TC、TG、LDL-C 含量均顯著升高（P＜0.05），HDL-C 含量均顯著降低（P＜0.05）；與Model組比較，Andro低、中、高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C 含量均顯著降低，HDL-C 含量均顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與Andro 高劑量組比較，抑制劑組大鼠TC、TG、LDL-C含量均顯著增加，HDL-C含量顯著降低（P＜0.05），結果見表3。

表3 各組大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的檢測結果（±s，n＝12，mmol/L）

表3 各組大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的檢測結果（±s，n＝12，mmol/L）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Andro低劑量組比較，P＜0.05；d：與Andro中劑量組比較，P＜0.05；e：與Andro高劑量組比較，P＜0.05。

分組Control組Model組Andro低劑量組Andro中劑量組Andro高劑量組抑制劑組TC 1.05±0.32 6.37±0.51a 5.03±0.43b 3.95±0.41bc 1.73±0.38bcd 4.17±0.36e TG 0.71±0.16 1.76±0.24a 1.42±0.26b 1.04±0.17bc 0.74±0.15bcd 1.15±0.18e HDL-C 1.43±0.10 0.41±0.04a 0.67±0.05b 0.88±0.06bc 1.13±0.08bcd 0.73±0.07e LDL-C 0.18±0.02 0.87±0.12a 0.64±0.07b 0.41±0.04bc 0.20±0.03bcd 0.53±0.05e

3.6 Andro 對大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 及Hippo-YAP信號通路相關蛋白表達的影響

與Control 組比較，Model 組大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平，MST1、LATS1、YAP 蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）；與Model組比較，Andro低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF蛋白表達水平，MST1、LATS1、YAP 蛋白的磷酸化水平均顯著升高，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；與Andro 高劑量組比較，抑制劑組大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平，MST1、LATS1、YAP 蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖3和表4。

圖3 各組大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 及Hippo-YAP信號通路相關蛋白表達的電泳圖

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 及Hippo-YAP信號通路相關蛋白表達情況比較（±s，n＝6）

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 及Hippo-YAP信號通路相關蛋白表達情況比較（±s，n＝6）

a：與Control組比較，P＜0.05；b：與Model組比較，P＜0.05；c：與Andro低劑量組比較，P＜0.05；d：與Andro中劑量組比較，P＜0.05；e：與Andro高劑量組比較，P＜0.05。

分組Control組Model組Andro低劑量組Andro中劑量組Andro高劑量組抑制劑組HIF-1α/GAPDH 0.98±0.11 0.11±0.02a 0.29±0.03b 0.57±0.06bc 0.88±0.09bcd 0.24±0.03e VEGF/GAPDH 1.23±0.14 0.19±0.03a 0.52±0.05b 0.84±0.07bc 1.12±0.10bcd 0.37±0.04e p-MST1/MST1 0.89±0.07 0.10±0.01a 0.27±0.02b 0.58±0.06bc 0.84±0.08bcd 0.23±0.02e p-LATS1/LATS1 0.95±0.09 0.07±0.01a 0.28±0.03b 0.59±0.08bc 0.92±0.10bcd 0.27±0.04e p-YAP/YAP 0.92±0.07 0.15±0.02a 0.26±0.04b 0.58±0.05bc 0.87±0.09bcd 0.31±0.03e

4 討論

糖尿病足是糖尿病的嚴重并發(fā)癥，也是糖尿病患者住院的最常見原因之一。糖尿病足發(fā)生的常見危險因素包括血糖控制不良、周圍神經病變、外周血管疾病和免疫抑制等，具有傷口極易感染、較難愈合、反復發(fā)作等特點[15]。糖尿病足患者傷口愈合延遲的關鍵因素是局部新生毛細血管生成和外周血流的減少。因此，促進血管新生及創(chuàng)面愈合、改善并恢復足部血流是治療糖尿病足的關鍵。大量研究表明，二甲雙胍可通過減少炎癥、氧化應激、減輕局部胰島素抵抗和促進血管生成等促進創(chuàng)面愈合，但也有研究表明二甲雙胍能通過抑制角質細胞增殖延長創(chuàng)面愈合時間[16]。此外，尚未有研究表明二甲雙胍可以通過調節(jié)Hippo-YAP 信號通路促進糖尿病足大鼠血管生成，因此本研究未用二甲雙胍作為陽性對照藥物進行研究。

Andro是從草本植物穿心蓮中分離出來的一種二萜類化合物，具有廣泛的藥理活性[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Andro 能夠通過抑制氧化應激與炎癥反應，改善糖尿病腎病、糖尿病心肌病[6—7]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，Andro 具有一定的糖代謝調節(jié)能力，與沒食子酸聯(lián)用可顯著降低鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠的血糖[17—18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Andro 能有效降低糖尿病足大鼠FBG、FINS、TC、TG、LDL-C 含量，顯著增加HDL-C 含量，表明Andro 具有降低糖尿病足大鼠血糖、血脂的作用。由此推測，Andro可能對糖尿病足創(chuàng)面愈合有一定的積極作用。

HIF-1α/VEGF 軸功能受損是糖尿病相關血管生成障礙的主要機制。HIF-1是一種由翻譯后調控的α-亞基和組成型表達的β-亞基組成的異源二聚體，被廣泛認為是氧穩(wěn)態(tài)的主要調節(jié)因子。在缺氧組織條件下，HIF-1α的羥基化作用減弱，導致HIF-1α蛋白不穩(wěn)定，并啟動多個對血管生成至關重要的基因表達，最明顯的是VEGF[19]。糖尿病患者HIF-1α 的功能活性降低，這種變化導致VEGF 不能上調以應對軟組織缺血，使血管生成和傷口愈合受損。研究已經證明，上調HIF-1α/VEGF軸可有效促進糖尿病足大鼠血管生成及傷口愈合[19]。EPCs 既能分化為內皮細胞，又能分泌生長因子、細胞因子和血管活性物質，促進血管生成，維持血管穩(wěn)態(tài)[20]。EPCs 的數(shù)量和功能異常是判斷糖尿病血管病變嚴重程度的一種可靠指標，也是導致患者傷口不愈合的關鍵因素[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病足大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平，創(chuàng)面愈合率，毛細血管數(shù)和外周血中EPCs比例均明顯降低，而給予Andro后則顯著提高了糖尿病足大鼠創(chuàng)面組織中HIF-1α、VEGF 蛋白表達水平，創(chuàng)面愈合率，毛細血管數(shù)和外周血中EPCs 比例，提示Andro具有促進糖尿病足大鼠血管生成及傷口愈合的作用。

Hippo-YAP 信號通路包含MST1/2、調節(jié)蛋白和LATS1/2。YAP 和帶有PDZ 結合基序的轉錄輔激活因子是Hippo 通路的主要下游效應物。MST1/2 磷酸化并激活LATS1/2，LATS1/2 在Ser-127 或Ser-381 位點磷酸化YAP，導致其細胞質保留和降解，并隨后抑制其靶基因轉錄。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞胞外陷阱可抑制Hippo-YAP 信號通路，使YAP 與轉錄因子Smad2 結合，并從細胞質轉移到細胞核，從而促進內皮-間充質轉化，最終阻礙糖尿病足小鼠血管生成并延遲傷口愈合[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，Andro 可提高糖尿病足大鼠創(chuàng)面組織中MST1、LATS1、YAP蛋白的磷酸化水平，提示Andro可能通過激活Hippo-YAP信號通路，從而起到促進糖尿病足大鼠血管生成及創(chuàng)面愈合的作用；使用Hippo-YAP信號通路抑制劑維替泊芬后，減少了Hippo-YAP信號通路蛋白的表達，減弱了Andro對血管生成及創(chuàng)面愈合的促進作用，再次說明了Andro 可能通過激活Hippo-YAP 信號通路，促進糖尿病足大鼠血管生成及創(chuàng)面愈合。

綜上所述，Andro 具有降低糖尿病足大鼠血糖、血脂，促進糖尿病足大鼠血管生成及創(chuàng)面愈合的作用，其作用機制可能與激活Hippo-YAP 信號通路有關。然而本研究尚存在不足之處，僅驗證了Andro 對Hippo-YAP信號通路的作用，未對其他靶點、途徑進行驗證，后續(xù)研究將會進一步明確Andro在糖尿病足中的作用機制。