張桂榮 ，李楊松 ，羅 婕 ，張 瑾 ，楊轉(zhuǎn)珍 ，朱寶潔 ，江莉媛 ，呂光華 ，龍 飛 #（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；2.西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611137）

蕓香科黃檗屬植物在全球約有4 種，主產(chǎn)于亞洲東部，在我國(guó)有2 個(gè)種及1 個(gè)變種：黃檗Phellodendron amurenseRupr.、川黃檗P.chinenseSchneid.及變種禿葉黃檗P.chinensevar.glabriusculumSchneid.?！吨袊?guó)藥典》自2005年版起，將川黃柏與關(guān)黃柏列為2種藥材，以“川黃柏”作“黃柏”，關(guān)黃柏單列[1]。黃檗為中藥關(guān)黃柏的基原植物，主要分布在黑龍江、河北、山西、內(nèi)蒙古、陜西等地[2]。川黃檗為中藥黃柏的基原植物，因被過度開采使用導(dǎo)致其野生資源急劇減少。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，至20世紀(jì)末，野生的川黃檗植物基本消失殆盡，而今中藥黃柏的主流商品來源實(shí)則為變種禿葉黃檗，主要分布在四川、重慶、貴州、湖北、湖南和云南等地[3]。

禿葉黃檗的樹皮作為黃柏藥材使用，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，主要用于治療濕熱瀉痢、熱淋澀痛、骨蒸勞熱、盜汗、遺精、瘡瘍腫毒等病癥[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃檗屬植物除樹皮可作藥用之外，其果實(shí)也可入藥[5—6]。李煥榮等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黃檗的果實(shí)中含有揮發(fā)油類、酚酸類、生物堿類和三萜類成分，其水煎液和揮發(fā)油均有祛痰止咳作用，民間多用于治療慢性支氣管炎[5—6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，禿葉黃檗果實(shí)的主要成分包括揮發(fā)油類、生物堿類和三萜類化合物[8]，但其作藥用還未見報(bào)道。本研究擬通過氨水引咳和藥物祛痰小鼠模型實(shí)驗(yàn)研究禿葉黃檗果實(shí)的祛痰止咳作用；利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLCMS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)禿葉黃檗果實(shí)的揮發(fā)油和非揮發(fā)性部位進(jìn)行成分分析；并在藥效研究和成分分析鑒定的基礎(chǔ)上，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步探索禿葉黃檗果實(shí)祛痰止咳的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，為禿葉黃檗果實(shí)資源的綜合利用研究提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括7890A-5975C 系列GCMS 聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）、Vanquish 型超高效液相色譜聯(lián)用Q-Exactive 四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、SQP型十萬(wàn)分之一天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、Spectra-Max i3x型酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

藥材樣品采自四川省雅安市滎經(jīng)縣，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院龍飛副教授鑒定為蕓香科黃檗屬植物禿葉黃檗P.chinensevar.glabriusculumSchneid.的成熟果實(shí)，低溫干燥后密封儲(chǔ)存。甜菜堿、小檗堿、小檗紅堿、綠原酸、木犀草素對(duì)照品（批號(hào)分別為CYR-T0049200815、CYRX0024210628、CYR-X004021022、CYR-L0098200419、CYR-M0072200308）均購(gòu)自四川萃益潤(rùn)生物科技有限公司，熊果苷、檸檬苦素、紅景天苷、山柰酚、延胡索乙素、秦皮甲素、巴馬汀、黃柏酮、黃柏堿、吳茱萸堿對(duì)照品（批號(hào)分別為PS020727、PS010363、PS011476、PS011676、PS000988、PS012121、PS020011、PS010197、PS000447、PS012147）均購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司，葫蘆巴堿對(duì)照品（批號(hào)RDD-H05711801010）購(gòu)自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司，鹽酸藥根堿對(duì)照品（批號(hào)20081905）購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，槲皮素對(duì)照品（批號(hào)CHB190110）購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司，所有對(duì)照品的純度均≥98%。氫溴酸右美沙芬片（批號(hào)51-221211，規(guī)格15 mg）購(gòu)自北京天衡藥物研究院南陽(yáng)天衡制藥廠；氯化銨（分析純）購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司。乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF 級(jí)健康KM 小鼠，共70 只，雌雄各半，體重18～22 g，購(gòu)自北京SPF生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0010。將小鼠飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)為2021-80。

2 方法與結(jié)果

2.1 試藥的制備

2.1.1 禿葉黃檗果實(shí)水煎液試藥

稱取禿葉黃檗果實(shí)粉末（過三號(hào)篩）200 g，用10 倍體積的水回流煎煮2 h，用紗布過濾后濾渣再用6倍體積的超純水回流煎煮2 h，合并2 次煎液，減壓濃縮定容至100 mL，得生藥量為2 g/mL的禿葉黃檗果實(shí)浸膏，臨用時(shí)用生理鹽水稀釋至給藥濃度。

2.1.2 禿葉黃檗果實(shí)揮發(fā)油試藥

稱取禿葉黃檗果實(shí)粉末（過三號(hào)篩）100 g，加入10倍體積的水，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，揮發(fā)油得率為1.43%，臨用時(shí)用2%聚山梨酯80稀釋至給藥濃度。

2.2 禿葉黃檗果實(shí)水煎液和揮發(fā)油的止咳祛痰活性考察

2.2.1 止咳活性考察

采用氨水引咳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察，具體操作參照文獻(xiàn)[9]。取小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組（生理鹽水），右美沙芬組（陽(yáng)性對(duì)照氫溴酸右美沙芬片，15 mg/kg），禿葉黃檗果實(shí)水煎液高、低劑量組（后文簡(jiǎn)稱為“水煎液高、低劑量組”，給藥劑量以生藥量計(jì)分別為12、3 g/kg），禿葉黃檗果實(shí)揮發(fā)油高、低劑量組（后文簡(jiǎn)稱為“揮發(fā)油高、低劑量組”，給藥劑量以揮發(fā)油量計(jì)分別為0.8、0.2 g/kg），每組10只。灌胃相應(yīng)藥物/生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。末次灌胃后0.5 h，將小鼠放入1 000 mL燒杯中，再迅速放入注有0.4 mL濃氨水的棉球刺激小鼠，以小鼠腹肌強(qiáng)烈收縮且張嘴為咳嗽動(dòng)作指標(biāo)，記錄其咳嗽潛伏期和2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。采用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步的組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，各給藥組小鼠的咳嗽潛伏期均顯著延長(zhǎng)（P＜0.05 或P＜0.01），右美沙芬組、水煎液高劑量組和揮發(fā)油高劑量組小鼠2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)均顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠的咳嗽潛伏期、2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)及氣管中酚紅分泌量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

表1 各組小鼠的咳嗽潛伏期、2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)及氣管中酚紅分泌量測(cè)定結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常對(duì)照組比較，P＜0.01；b：與正常對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別正常對(duì)照組右美沙芬組/氯化銨組水煎液高劑量組水煎液低劑量組揮發(fā)油高劑量組揮發(fā)油低劑量組酚紅分泌量/（μg/mL）0.91±0.079 1.36±0.070a 1.45±0.121a 1.22±0.119b 1.19±0.037b 1.12±0.058咳嗽潛伏期/s 45.20±5.213 69.90±4.375a 68.90±4.100a 57.80±3.593b 68.70±3.887a 55.00±5.108b 2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)/次44.30±1.862 31.40±1.368a 35.10±0.936b 42.50±5.636 34.20±3.010b 36.80±2.752

2.2.2 祛痰活性考察

采用藥物祛痰小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察。動(dòng)物選取及給藥方式同“2.2.1”項(xiàng)，陽(yáng)性對(duì)照藥變更為氯化銨（1 g/kg）。末次給藥0.5 h 后，各組小鼠按1 g/kg 腹腔注射5%酚紅溶液，0.5 h后頸椎脫臼處死小鼠。取下氣管放入2 mL生理鹽水中，加1 mol/L NaOH 溶液0.2 mL，以3 000 r/min離心15 min，取上清液于酶標(biāo)儀546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD）值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝0.059 6X－0.028 3（R2＝0.996 9）（式中X為酚紅質(zhì)量濃度，Y為OD 值）計(jì)算氣管中酚紅分泌量。數(shù)據(jù)結(jié)果按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，氯化銨組和水煎液高劑量組、水煎液低劑量組、揮發(fā)油高劑量組小鼠氣管中的酚紅分泌量均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表1。

2.3 禿葉黃檗果實(shí)揮發(fā)油的GC-MS成分分析

2.3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent HP-5MS 柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；采用程序升溫：初始溫度50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 升溫至280 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度為280 ℃；載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min；分流比為20∶1；進(jìn)樣量為1 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件

電離方法為電子轟擊電離（electron ionization，EI）；電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；質(zhì)量掃描范圍為20～450；質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)為NIST14。

2.3.3 GC-MS分析供試品溶液的制備

取禿葉黃檗果實(shí)打粉，過三號(hào)篩，精密稱取粉末約100 g，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，得淡黃色揮發(fā)油液體約1.5 mL。加入無(wú)水硫酸鈉約0.5 g，靜置過夜，以除去水分。取揮發(fā)油約1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醚定容，以0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析

將所得質(zhì)譜裂解數(shù)據(jù)信息與NIST14 數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，得到匹配度≥90%的化合物共38 個(gè)，總離子流圖見圖1。其中，相對(duì)百分含量＞1%的主要化合物有8個(gè)，分別為α-蒎烯（1.27%）、月桂烯（64.08%）、石竹烯（1.07%）、germacrene D（2.77%）、isospathulenol（1.08%）、α-cadinol（1.32%）、4（15），5，10（14）-大根香葉三烯-1-醇（1.24%）、金合歡醇（1.29%），具體化合物的匹配度與相對(duì)百分含量信息見表2。

圖1 禿葉黃檗果實(shí)揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖

表2 禿葉黃檗果實(shí)主要揮發(fā)油成分及其相對(duì)百分含量

2.4 禿葉黃檗果實(shí)非揮發(fā)油的UPLC-Q-Orbitrap HRMS成分分析

2.4.1 色譜條件

采用Thermo Acclaim RSLC 120 C18色譜柱（100 mm×3 mm×2.2 μm），以0.1%甲酸溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，5%B→8%B；5～12 min，8%B；12～13 min，8%B→10%B；13～17 min，10%B；17～25 min，10%B→15%B；25～28 min，15%B→22%B；28～32 min，22%B→25%B；32～35 min，25%B；35～42 min，25%B→28%B；42～48 min，28%B→30%B；48～52 min，30%B→55%B；52～63 min，55%B→100%B）；流速為0.2 mL/min；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源，在正、負(fù)離子模式下檢測(cè)。噴霧電壓為3.5 kV；輔助氣溫度為350 ℃；輔助氣流速為10 arb；鞘氣流速為35 arb；離子傳輸管溫度為320 ℃。掃描模式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級(jí)掃描（Full MS/dd-MS2），一級(jí)分辨率為70 000，二級(jí)分辨率為17 500；掃描范圍為m/z100～1 500；階梯碰撞能量為20、40、60 eV。

2.4.3 對(duì)照品溶液的制備

取甜菜堿、葫蘆巴堿、熊果苷、紅景天苷、秦皮甲素、綠原酸、黃柏堿、槲皮素、山柰酚、延胡索乙素、小檗紅堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿、木犀草素、吳茱萸堿、檸檬苦素和黃柏酮對(duì)照品各適量，置于同一容量瓶中，加入甲醇配制成各成分質(zhì)量濃度均約為100 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，混勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4.4 UPLC-MS分析供試品溶液的制備

精密稱取禿葉黃檗果實(shí)粉末1.0 g，置于50 mL錐形瓶中，加入30 mL 甲醇，超聲（功率45 kHz，頻率250 W）處理30 min，過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸干，加入適量甲醇溶解后，置于10 mL容量瓶中并以甲醇定容，以0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4.5 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果

將采集得到的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer 3.0軟件，通過其向?qū)гO(shè)置及方法模板，建立未知化合物的鑒定流程，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對(duì)齊和峰提取。通過提取得到的分子離子色譜峰、同位素峰擬合出可能的分子式，并將二級(jí)碎片實(shí)測(cè)譜圖與mzCloud網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)及本地中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)OTCML 進(jìn)行匹配，對(duì)匹配結(jié)果設(shè)置過濾參數(shù)為：峰面積閾值80 000，一級(jí)及二級(jí)質(zhì)量偏差5 ppm，匹配度分值高于80。對(duì)過濾后的離子與數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物信息及對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和在線數(shù)據(jù)庫(kù)（PubChem）對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步的分析鑒定。結(jié)果，通過UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)，共從禿葉黃檗果實(shí)中鑒定出69個(gè)化合物，包括酚酸類化合物16個(gè)、生物堿類化合物13個(gè)、黃酮類化合物10個(gè)、氨基酸類化合物7個(gè)、核苷類化合物5個(gè)、香豆素類化合物3個(gè)、三萜類化合物3個(gè)、其他類化合物12個(gè)，其中18個(gè)化合物經(jīng)過對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)。在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下，禿葉黃檗果實(shí)供試品及混合對(duì)照品UPLC-Q-Orbitrap HRMS的總離子流圖見圖2，具體化合物信息見表3。

圖2 禿葉黃檗果實(shí)與混合對(duì)照品UPLC-Q-Orbitrap HRMS的總離子流圖

表3 禿葉黃檗果實(shí)非揮發(fā)性化學(xué)成分分析結(jié)果

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理實(shí)驗(yàn)篩選禿葉黃檗果實(shí)祛痰止咳的活性成分及機(jī)制

2.5.1 活性成分的篩選

以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%和類藥性（drug-likeness，DL）＞0.18 為篩選條件對(duì)“2.3”和“2.4”項(xiàng)下所鑒定出的禿葉黃檗果實(shí)的化學(xué)成分進(jìn)行活性篩選[10]。結(jié)果顯示，滿足篩選條件的化學(xué)成分共有10個(gè)，包括槲皮素、延胡索乙素、山柰酚、小檗紅堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿、木犀草素、吳茱萸苦素、黃柏酮。此外，雖然所鑒定成分中α-蒎烯和月桂烯的DL 值略低于0.18，綠原酸的OB 值略低于30%，但據(jù)報(bào)道[6，11—12]，三者均具有良好的祛痰止咳活性，故也納入后續(xù)研究中。因此，共篩選獲得13個(gè)活性成分。

2.5.2 潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過SwissTargetPrediction、TCMSP 和SuperPred 等數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得活性成分的靶點(diǎn)681個(gè)，以“cough”和“expectoration”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得與咳嗽和咳痰相關(guān)的疾病靶點(diǎn)378個(gè)。在Venny2.1.0在線作圖工具平臺(tái)上獲取兩者交集靶點(diǎn)，即為潛在作用靶點(diǎn)，共57個(gè)。

2.5.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心靶點(diǎn)獲取

通過String 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)分析，使用Cytoscape 3.7.1 軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行可視化分析，選取連接度最大的5個(gè)節(jié)點(diǎn)作為核心作用靶點(diǎn)，結(jié)果見圖3。圖3中包含55個(gè)節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)的顏色由淺逐漸變深，而顏色越深表示節(jié)點(diǎn)的連接度越大；核心靶點(diǎn)為腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase proteins，AKT1）、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）。

圖3 禿葉黃檗果實(shí)祛痰止咳靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5.4 通路富集分析

利用DAVID 網(wǎng)站對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，以P＜0.05進(jìn)行篩選，共得到生物過程通路233 條、細(xì)胞組成通路35 條、分子功能通路49條，均選擇其中P值排前10位的條目繪制GO富集分析條形圖，見圖4A。結(jié)果顯示，GO 功能條目包括對(duì)脂多糖的反應(yīng)、肽基絲氨酸磷酸化的正向調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成過程的積極調(diào)節(jié)等生物過程。同樣選擇P值排前10 位的KEGG 信號(hào)通路繪制KEGG 分析氣泡圖，結(jié)果見圖4B。結(jié)果顯示，KEGG 信號(hào)通路包括癌癥、非小細(xì)胞肺癌、癌癥中的蛋白聚糖等信號(hào)通路。

圖4 禿葉黃檗果實(shí)祛痰止咳GO 富集分析條形圖和KEGG富集分析氣泡圖

2.5.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

使用AutoDock Tools 1.5.6 軟件將“2.5.1”項(xiàng)下篩選獲得的活性成分、鎮(zhèn)咳陽(yáng)性藥物右美沙芬與“2.5.3”項(xiàng)下分析所得的5個(gè)核心作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表4。一般認(rèn)為，對(duì)接結(jié)合能≤－5.0 kcal/mol（1 cal＝4.184 J），說明兩者結(jié)合活性較好[13]。本研究中，除靶點(diǎn)VEGFA 與成分月桂烯和α-蒎烯的結(jié)合能略大于－5.0 kcal/mol 外，其他成分和靶點(diǎn)的結(jié)合能均不大于－5.0 kcal/mol，提示其均具有較好的結(jié)合能力。這說明所篩選的活性成分均有可能是禿葉黃檗果實(shí)祛痰止咳的物質(zhì)基礎(chǔ)成分。

表4 右美沙芬、禿葉黃檗果實(shí)活性成分與核心靶點(diǎn)分子的對(duì)接結(jié)合能（kcal/mol）

3 討論

據(jù)報(bào)道，黃檗果實(shí)水煎液祛痰止咳的治療劑量以每日15 g為宜[5]。以成人體質(zhì)量60 kg計(jì)，按照小鼠與人劑量的換算系數(shù)12.3計(jì)算，得到小鼠給藥劑量約為3 g/kg。另有研究表明，灌胃給予小鼠0.2～0.8 g/kg 的黃檗果實(shí)揮發(fā)油對(duì)小鼠有明顯的祛痰作用[6]。本研究參考黃檗果實(shí)的治療劑量，將12、3 g/kg 和0.8、0.2 g/kg 分別作為水煎液和揮發(fā)油祛痰止咳的高、低治療劑量。此外，氯化銨在藥物祛痰實(shí)驗(yàn)研究中常被用作陽(yáng)性對(duì)照藥物；右美沙芬屬于非成癮性中樞鎮(zhèn)咳藥，主要通過抑制延髓咳嗽中樞而發(fā)揮鎮(zhèn)咳作用，常被用作小鼠鎮(zhèn)咳實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照藥物。故本研究選擇右美沙芬和氯化銨作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，其給藥劑量參考文獻(xiàn)[9]設(shè)置。本研究結(jié)果表明，禿葉黃檗果實(shí)水煎液和揮發(fā)油均具有明顯的祛痰止咳作用，并呈明顯的劑量依賴趨勢(shì)。

晏晨等[14]研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地川黃檗果實(shí)的揮發(fā)油化學(xué)成分組成有較大差異。蔣太白等[8]研究表明，貴州產(chǎn)禿葉黃檗果實(shí)的揮發(fā)油主要成分為月桂烯（相對(duì)百分含量為66.9%）。本研究首次鑒定了四川產(chǎn)禿葉黃檗果實(shí)揮發(fā)油的化學(xué)成分組成，發(fā)現(xiàn)其主要成分同樣為月桂烯（相對(duì)百分含量為64.08%），表明不同產(chǎn)地禿葉黃檗果實(shí)的揮發(fā)油化學(xué)成分組成具有良好的一致性。本研究首次采用UPLC-MS技術(shù)對(duì)禿葉黃檗果實(shí)非揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定分析，共鑒定出酚酸類、生物堿類、黃酮類等69個(gè)化合物，進(jìn)一步補(bǔ)充完善了其化學(xué)成分的研究。

筆者查閱所鑒定出的化合物的祛痰止咳活性研究報(bào)道后發(fā)現(xiàn)，α-蒎烯具有祛痰止咳的活性，是祛痰藥桉檸蒎腸溶軟膠囊的指標(biāo)性成分之一[11]。據(jù)《中華本草》記載，黃檗果實(shí)揮發(fā)油鎮(zhèn)咳作用的有效單體為月桂烯[7]；綠原酸為返魂草、石韋等祛痰止咳中藥的指標(biāo)成分之一[12，15]；木犀草素為石韋、筋骨草和三子養(yǎng)親湯等祛痰止咳中藥和方劑的指標(biāo)成分之一[15—16]；小檗堿為藏成藥十味龍膽花顆粒的指標(biāo)成分之一，適用于治療慢性支氣管炎[17]。且分子對(duì)接結(jié)果表明，上述成分與祛痰止咳核心靶點(diǎn)間均有較好的結(jié)合活性。因此，筆者推斷α-蒎烯、月桂烯、綠原酸、木犀草素和小檗堿等成分可能為禿葉黃檗果實(shí)祛痰止咳的物質(zhì)基礎(chǔ)。

筆者利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究了禿葉黃檗果實(shí)祛痰止咳的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其核心作用靶點(diǎn)為TNF、EGFR、VEGFA、AKT1和TLR4。其中，TNF可誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生并導(dǎo)致組織損傷，還可以進(jìn)一步激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路中炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展[18]。TLR4 被激活后可通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活NF-κB，使其入核并結(jié)合促炎基因啟動(dòng)子，從而增強(qiáng)炎癥基因表達(dá)，釋放炎癥細(xì)胞因子[19]。AKT在細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、增殖、炎癥和血管生成方面有重要作用，其亞型AKT1參與細(xì)胞的生長(zhǎng)與存活，并在多種組織中表達(dá)[20]。咳嗽、咳痰是慢性支氣管炎患者最典型的癥狀，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢性支氣管炎是因感染或其他非感染因素引起的支氣管及其周圍組織的非特異性炎癥。這說明，禿葉黃檗果實(shí)揮發(fā)油和水煎液可能主要通過緩解支氣管及其周圍組織的非特異性炎癥從而達(dá)到祛痰止咳的作用。GO分析和KEGG富集分析結(jié)果表明，禿葉黃檗果實(shí)祛痰止咳的作用機(jī)制主要是通過影響脂多糖的反應(yīng)、肽基絲氨酸磷酸化的正向調(diào)節(jié)、一氧化氮生物合成過程的積極調(diào)節(jié)等生物過程，調(diào)節(jié)癌癥、非小細(xì)胞肺癌、癌癥中的蛋白聚糖等信號(hào)通路。

綜上所述，禿葉黃檗果實(shí)主要通過作用于TNF、EGFR、VEGFA、AKT1 和TLR4 等靶點(diǎn)及其顯著富集的信號(hào)通路發(fā)揮祛痰止咳的作用，其物質(zhì)基礎(chǔ)可能為α-蒎烯、月桂烯、綠原酸、木犀草素和小檗堿等成分。但是，本研究?jī)H對(duì)禿葉黃檗果實(shí)的化學(xué)成分作了GC-MS 和UPLC-MS 的定性分析，以及通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了其祛痰止咳的物質(zhì)基礎(chǔ)，缺乏對(duì)物質(zhì)基礎(chǔ)化學(xué)成分的定量分析。本課題組后續(xù)將繼續(xù)開展對(duì)物質(zhì)基礎(chǔ)成分的定量研究工作，為禿葉黃檗果實(shí)資源的進(jìn)一步開發(fā)利用研究奠定理論基礎(chǔ)。