歐小英，歐陽敏

（1.寧遠(yuǎn)縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖南 寧遠(yuǎn) 425600；2.寧遠(yuǎn)縣桐山街道農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，湖南 寧遠(yuǎn) 425600）

近年，我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展迅速，品種多、數(shù)量大、養(yǎng)殖模式多樣化[1]，集約化、現(xiàn)代化、生態(tài)化健康養(yǎng)殖模式是未來發(fā)展趨勢。我國是世界上第一養(yǎng)禽大國，但還不是養(yǎng)禽強(qiáng)國[2]。禽病是影響?zhàn)B禽業(yè)健康發(fā)展最主要的因素，不僅影響禽類的存活率和生長發(fā)育速度，而且還影響家禽的產(chǎn)蛋率和種禽質(zhì)量[3]。

禽病防控面臨的形勢依然嚴(yán)峻，做好禽病綜合防控工作至關(guān)重要，其中疫苗接種是最有效的手段之一[4-5]。新城疫和禽流感是目前對養(yǎng)禽業(yè)危害比較嚴(yán)重的兩種疫病[6-7]，為了探討這兩種疫病免疫預(yù)防時(shí)的相互影響，本試驗(yàn)將市售的雞新城疫-傳染性支氣管炎-禽流感（H9亞型）三聯(lián)滅活疫苗與其他禽類疫苗同時(shí)接種雞，于接種后不同時(shí)間進(jìn)行血清抗體監(jiān)測，并與單獨(dú)接種其他禽類疫苗雞的血清抗體進(jìn)行對比，了解不同疫苗對雞免疫學(xué)功能的影響，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材 料

1.1 試驗(yàn)疫苗

兩批雞新城疫-傳染性支氣管炎-禽流感（H9亞型）三聯(lián)滅活疫苗（La Sota 株+M41 株+YBF003 株），以下簡稱“新支流三聯(lián)”（批號為180010900 和180020900），市售，哈爾濱某公司產(chǎn)品。

1.2 注射器

1 mL 注射器，購自上海治宇醫(yī)療器械有限公司。

1.3 試驗(yàn)蛋雞

14日齡健康海蘭褐蛋雞，市售。

1.4 疫苗、抗原及血清

重組禽流感病毒H5 亞型二價(jià)滅活疫苗（細(xì)胞源，Re-6株+Re-8株），批號為20180401，市售。

禽流感病毒H5 亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原與陽性血清，均購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

2 方 法

2.1 試驗(yàn)分組

取14 日齡海蘭褐蛋雞40 只，分成4 組，每組10 只。第1 組：頸部皮下注射新支流三聯(lián)（批號為180010900）疫苗，注射劑量為0.3 mL·只-1，同時(shí)肌肉注射禽流感H5 亞型二價(jià)滅活疫苗（細(xì)胞源，Re-6 株+Re-8 株），注射劑量為0.3 mL·只-1；第2組：頸部皮下注射新支流三聯(lián)（批號為180020900）疫苗，注射劑量為0.3 mL·只-1，同時(shí)肌肉注射禽流感H5 亞型二價(jià)滅活疫苗（細(xì)胞源，Re-6 株+Re-8株），注射劑量為0.3 mL·只-1；第3 組：肌肉注射重組禽流感病毒H5 亞型二價(jià)滅活疫苗（細(xì)胞源，Re-6 株+Re-8 株），注射劑量為0.3 mL·只-1；第4組（對照組）：不接種任何疫苗。試驗(yàn)雞于疫苗注射后14、21、28天逐只采血，分離血清，進(jìn)行H5亞型Re-6株禽流感HI抗體效價(jià)測定，并通過比較各組HI 效價(jià)的幾何平均值，來分析對雞免疫學(xué)功能是否存在影響。試驗(yàn)分組情況見表1。

表1 試驗(yàn)分組

2.2 檢測方法

2.2.1 臨床觀察

注射疫苗前及注射后28 d，每天系統(tǒng)觀察試驗(yàn)雞的精神狀態(tài)、行為活動、糞便狀況、采食和飲水情況。

2.2.2 HI抗體效價(jià)測定

2.2.2.1 血凝抗原工作液配制

血凝抗原凝集價(jià)測定：取禽流感病毒H9 亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原在96 孔V 型微量反應(yīng)板進(jìn)行血凝試驗(yàn)，每孔加25 μL PBS（0.1 mol·L-1，pH7.0～7.2），第1 排加25 μL 血凝抗原，并進(jìn)行2～4 個(gè)重復(fù)孔，然后進(jìn)行2倍系列稀釋，稀釋后每孔再加入25 μL PBS，最后再加入1%雞紅細(xì)胞懸液25 μL，在微量振蕩器上混勻，室溫靜置20～40 min，當(dāng)對照孔中的紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。以使紅細(xì)胞100%凝集的最高稀釋倍數(shù)作為判定終點(diǎn)。各成分量及加樣順序詳見表1。

血凝抗原工作液（4 HAU）配制：根據(jù)測定的血凝抗原凝集價(jià)，按照公式計(jì)算配制4 個(gè)血凝單位（即4 HAU）工作液稀釋倍數(shù)，即稀釋倍數(shù)=血凝抗原凝集價(jià)/4。如血凝抗原凝集價(jià)為1∶256，則配制4 HAU 血凝抗原工作液時(shí)應(yīng)用PBS 稀釋64 倍（256/4=64）。按照計(jì)算出的倍數(shù)用PBS 配制4 HAU 血凝抗原工作液。

4 HAU血凝抗原工作液檢驗(yàn)：將配制好的4 HAU血凝抗原工作液用PBS 稀釋，使其稀釋度為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，從每一稀釋度中取出25 μL，加入25 μL PBS，再加入1%雞紅細(xì)胞懸液25 μL，振蕩混勻，室溫靜置20～40 min 后判定結(jié)果。如1∶4 稀釋為100%紅細(xì)胞凝集終點(diǎn)，表明配制的是4 HAU血凝抗原工作液；如100%紅細(xì)胞凝集終點(diǎn)是1∶5 或1∶6，表明配制的4 HAU 血凝抗原工作液實(shí)際上高于4 個(gè)單位；如100%紅細(xì)胞凝集終點(diǎn)是1∶2 或1∶3，表明配制的4 HAU 血凝抗原工作液實(shí)際上低于4個(gè)單位。應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整，使抗原工作液為4 HAU血凝抗原工作液。

2.2.2.2 紅細(xì)胞凝集抑制（HI）試驗(yàn)

各成分量及加樣順序詳見表2。

表2 微量血凝抑制試驗(yàn)（微量法）術(shù)式μL

待檢血清樣品稀釋：第1～11 孔加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS。在第1孔加入25 μL待檢血清樣品，充分混勻后吸取25 μL 加至第2 孔，依次2 倍稀釋至第10 孔，從第10 孔吸取25 μL棄去。

加入4 HAU 血凝抗原工作液：第1～11 孔均加入25 μL 的4 HAU 血凝抗原工作液，第12 孔不加4 HAU 血凝抗原工作液作為對照，在室溫（20～25 ℃）下靜置20～40 min進(jìn)行中和。

加入紅細(xì)胞：每孔加入25 μL 1%（V/V）的雞紅細(xì)胞懸液。

血凝抑制反應(yīng)：將反應(yīng)板在振蕩器上振蕩1～2 min 或輕扣反應(yīng)板混合反應(yīng)物，在室溫（20～25 ℃）下靜置20～40 min，根據(jù)血凝圖像判定結(jié)果。對照紅細(xì)胞將呈顯著紐扣狀。（每次測定時(shí)應(yīng)設(shè)陰性血清對照和已知HI 抗體效價(jià)的陽性血清對照）

結(jié)果判定：將微量板傾斜45°。當(dāng)陰性對照血清HI 效價(jià)不高于1∶4（微量法）、陽性對照血清HI效價(jià)與已知效價(jià)相比誤差不超過1個(gè)效價(jià)值時(shí)，試驗(yàn)方法成立。若紅細(xì)胞沉淀呈淚珠狀流淌，判為HI陽性；若紅細(xì)胞在孔底均勻分布或呈鋸齒狀凝集，判為HI陰性。以完全抑制4 HAU血凝抗原工作液的最高稀釋倍數(shù)判為該待檢血清樣品的HI效價(jià)。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床觀察結(jié)果

試驗(yàn)雞臨床表現(xiàn)見表3。

表3 不同組別試驗(yàn)雞臨床觀察結(jié)果

從表3 可以看出，試驗(yàn)觀察期內(nèi)，4 組試驗(yàn)雞全部健活，精神良好，采食、飲水、行為和糞便等未見異常，無其他全身不良反應(yīng)。

3.2 HI抗體效價(jià)檢測

HI抗體檢測結(jié)果見表4。

表4 各組不同時(shí)間點(diǎn)H5亞型禽流感HI抗體效價(jià)測定結(jié)果

從表4 可以看出，注射后14、21 和28 d 同時(shí)接種兩種疫苗，第1 組（新支流三聯(lián)180010900批）雞血清中H5 亞型禽流感HI 抗體效價(jià)分別為1∶68.6、1∶207.9 和1∶415.6，第2 組（新支流三聯(lián)180020900批）雞血清中H5亞型禽流感HI抗體效價(jià)分別為1∶68.6、1∶207.9 和1∶445.7；第三組單獨(dú)注射重組禽流感病毒H5 亞型二價(jià)滅活疫苗（細(xì)胞源，Re-6 株+Re-8 株）組雞血清中H5 亞型禽流感抗體效價(jià)分別為1∶64.0、1∶194.0 和1∶388.0，健康對照組雞血清中H5亞型禽流感HI抗體效價(jià)均不高于1∶24.3。說明接種2種疫苗試驗(yàn)雞血清H5亞型禽流感HI抗體效價(jià)與單獨(dú)注射重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗（細(xì)胞源，Re-6 株+Re-8 株）組無明顯差異，證明不同疫苗免疫對雞免疫學(xué)功能無影響。

4 討 論

在家禽養(yǎng)殖過程中會面臨各種疾病的挑戰(zhàn)，藥物治療存在不對癥、不及時(shí)、效果差等諸多問題，常常會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫是目前較為常用且有效的手段，但預(yù)防不同的疫病要使用不同的疫苗，不同疫苗的同時(shí)接種偶爾會存在相互干擾的情況，如張大俊[8]進(jìn)行了羊痘疫苗與小反芻獸疫疫苗同時(shí)或單獨(dú)免疫效果比較及分析，結(jié)果羊痘疫苗和小反芻獸疫疫苗同時(shí)免疫促進(jìn)了小反芻獸疫疫苗的抗體水平，抑制羊痘的抗體水平，表明羊痘和小反芻獸疫疫苗同時(shí)免疫不利于羊痘疫苗在體內(nèi)產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答。但也有相當(dāng)多的研究表明，不同疫苗同時(shí)多點(diǎn)接種，免疫效果不受影響，孟麗軍等[9]進(jìn)行了豬口蹄疫、豬瘟、高致病性藍(lán)耳病三種疫苗不同組合同時(shí)分點(diǎn)免疫的效果觀察，結(jié)果表明豬口蹄疫、豬瘟、高致病性藍(lán)耳病3 種疫苗同時(shí)分點(diǎn)免疫，免疫副反應(yīng)率比較低，特別是進(jìn)行二免、三免后抗體效價(jià)更高。華利忠等[10]進(jìn)行了雞滑液囊支原體活疫苗（MS-H 株）同時(shí)免疫對新支二聯(lián)活疫苗免疫效力影響的調(diào)查，結(jié)果表明同時(shí)免疫滑液囊支原體活疫苗并未對新支二聯(lián)活疫苗的免疫效力產(chǎn)生影響。沈亞菊等[11]進(jìn)行了重組禽流感病毒（H5+H7）三價(jià)滅活疫苗和雞新城疫、禽流感（H9 亞型）、禽腺病毒病（Ⅰ群4 型）三聯(lián)滅活疫苗聯(lián)合免疫效果研究，結(jié)果表明兩種禽流感疫苗混合后聯(lián)合免疫的安全性和免疫效果與單苗免疫相當(dāng)，無干擾現(xiàn)象，可減少雞群應(yīng)激，節(jié)省人工。本試驗(yàn)結(jié)果也表明新支流三聯(lián)與重組禽流感病毒H5 亞型二價(jià)滅活疫苗接種對雞免疫學(xué)功能無影響。

5 結(jié) 論

不同疫苗免疫對雞免疫功能的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)雞同時(shí)接種雞新城疫-傳染性支氣管炎-禽流感（H9亞型）三聯(lián)滅活疫苗和重組禽流感病毒H5 亞型二價(jià)滅活疫苗（細(xì)胞源，Re-6 株+Re-8株）疫苗所產(chǎn)生的抗體效價(jià)與單獨(dú)接種重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗（細(xì)胞源，Re-6株+Re-8株）的抗體水平相當(dāng)，兩者無明顯差異。說明上述兩種不同疫苗對雞免疫學(xué)功能未產(chǎn)生影響。