鐘文嘉，黃益穗，劉灼波

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

廣藿香揮發(fā)油是廣藿香的主要藥用有效成分[1]，具有芳香化濁、解暑的功效[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，廣藿香揮發(fā)油具有抗菌、抗炎、調(diào)整胃腸運(yùn)動(dòng)功能等作用[3]。由于廣藿香揮發(fā)油具脂溶性，口服入藥難于在胃腸道被吸收，制成微乳制劑（O/W型）可改善其在胃腸道的吸收性，從而提高生物利用度[4]。微乳制劑是由一定比例的油相、水相、表面活性劑和助表面活性劑配制而成的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，其粒徑一般介于10~100 nm之間。要獲得穩(wěn)定性好的O/W型微乳，找準(zhǔn)O/W型微乳成型臨界點(diǎn)尤為重要。目前的報(bào)道[5-6]多為目測(cè)法，即肉眼觀察體系由混濁至澄清作為O/W型微乳成型臨界點(diǎn)；也有報(bào)道[7-9]提到建立電導(dǎo)率-含水量曲線法，以電導(dǎo)率最大值時(shí)對(duì)應(yīng)的含水量值作為O/W型微乳成型臨界點(diǎn)，但是沒有采用更為直觀的指標(biāo)來證實(shí)電導(dǎo)率-含水量曲線法的精確性。本研究基于此背景，分別采用目測(cè)法、電導(dǎo)率-含水量曲線法確定微乳的O/W型微乳成型臨界點(diǎn)，按各自獲得的臨界點(diǎn)分別配制微乳，通過比較平均粒徑、多分散系數(shù)（polydiseperse Index，PDI），證實(shí)電導(dǎo)率-含水量曲線法比目測(cè)法確定的O/W型微乳成型臨界點(diǎn)更為精確，并在此基礎(chǔ)上，使用該方法制備并優(yōu)化廣藿香揮發(fā)油微乳，以期為中藥微乳制劑的工業(yè)化發(fā)展提供借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Zetasizer Nano ZS90型納米粒徑電位分析儀（MALVERN公司）；HT7700型透射式電子顯微鏡（HITACHI公司）；MS603S型天平（美國(guó)梅特勒-托利多公司）；二級(jí)反滲透純化水制水機(jī)（廣州萬冠制藥設(shè)備公司）。

1.2 試藥 廣藿香揮發(fā)油（批號(hào)：P905696-23）、肉豆蔻酸異丙酯（IPM）（批號(hào)：1811858）均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；油酸（OA）（批號(hào)：20220120）、吐溫80（TW80）（批號(hào)：20211201）、聚乙二醇400（PEG400）（批號(hào)：20211215）、1,2-丙二醇（批號(hào)：20210901）、無水乙醇（批號(hào)：20211201）均購(gòu)于天津大茂化學(xué)試劑廠；聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40）（批號(hào)：2022032038R）購(gòu)于廣東翁江試劑公司；所有試劑均為分析純，藥用級(jí)別純化水等。

2 方法與結(jié)果

2.1 目測(cè)法和電導(dǎo)率-含水量曲線法制備空白微乳和廣藿香揮發(fā)油微乳 從預(yù)試驗(yàn)篩選出3個(gè)穩(wěn)定的空白微乳處方，分別制備3個(gè)空白微乳和3個(gè)載藥微乳。（見表1）（1）電導(dǎo)率-含水量曲線法：以處方3為例，將助表面活性劑、表面活性劑先混勻，再加入油相，在500 r/min轉(zhuǎn)速下磁力攪拌10 min，獲得4 g的微乳原液，然后加入0.2 g的純化水，攪拌20 s后，測(cè)電導(dǎo)率值并記錄，重復(fù)上述操作步驟，直至測(cè)得微乳含水量80%時(shí)電導(dǎo)率值，將得到的微乳含水量值、對(duì)應(yīng)的電導(dǎo)率值，使用軟件Origin 2021繪制電導(dǎo)率-含水量曲線，將電導(dǎo)率獲得最大值時(shí)，對(duì)應(yīng)的含水量值作為O/W型微乳成型臨界點(diǎn)。（見圖1）（2）目測(cè)法：將助表面活性劑、表面活性劑先混勻，再加入油相，500 r/min轉(zhuǎn)速下磁力攪拌10 min，獲得4 g的微乳原液，然后慢慢加入純化水，攪拌，觀察微乳狀態(tài)，重復(fù)上述操作，直至微乳由混濁狀態(tài)變?yōu)槌吻?，記錄加入純化水的質(zhì)量，此時(shí)微乳的含水量值即為O/W型微乳成型臨界點(diǎn)。

圖1 處方3 空白微乳、處方6 載藥微乳的電導(dǎo)率-含水量曲線圖

表1 空白微乳和載藥微乳處方組成、配比

上述兩種配制方法，由3名操作人員單獨(dú)進(jìn)行，將獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，作為目測(cè)法和電導(dǎo)率-含水量曲線法的O/W型微乳成型臨界點(diǎn)，然后進(jìn)一步比較兩種方法制備的微乳的平均粒徑和多分散系數(shù)（PDI）。由于單獨(dú)使用廣藿香揮發(fā)油作為油相取代處方1、2的OA、處方3的IPM，均不能獲得穩(wěn)定的微乳（出現(xiàn)混濁、分層）；將廣藿香揮發(fā)油與OA、廣藿香揮發(fā)油與IPM按質(zhì)量比2∶1混勻后，作為混合油相，按表1處方1、2、3的配比，獲得微乳的平均粒徑、PDI偏大，穩(wěn)定性一般；將廣藿香揮發(fā)油與OA、廣藿香揮發(fā)油與IPM按質(zhì)量比1∶1混勻后，獲得微乳的平均粒徑、PDI均較小，穩(wěn)定性較好，故選定該比例作為混合油相，備用。

2.2 目測(cè)法和電導(dǎo)率-含水量曲線法結(jié)果對(duì)比 依據(jù)“2.1”項(xiàng)表格的處方單獨(dú)進(jìn)行，將獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，作為目測(cè)法和電導(dǎo)率-含水量曲線法的O/W型微乳成型臨界點(diǎn)。各取兩種方法獲得的微乳適量，稀釋100倍后測(cè)量平均粒徑、PDI，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，目測(cè)法測(cè)得的O/W型微乳成型臨界點(diǎn)普遍靠前，在該臨界點(diǎn)下測(cè)得微乳的平均粒徑、PDI比電導(dǎo)率-含水量曲線法偏大，將處方1~6微乳各取適量，分別滴入亞甲基藍(lán)試劑和蘇丹Ⅲ試劑，靜置觀察，可見上述微乳中，亞甲基藍(lán)試劑的擴(kuò)散速度均明顯大于蘇丹Ⅲ試劑，表明上述微乳類型均為O/W型。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了目測(cè)法和電導(dǎo)率-含水量曲線法均能對(duì)O/W型微乳成型臨界點(diǎn)有較準(zhǔn)確的判斷，但是電導(dǎo)率-含水量曲線法精確度更高，獲得的微乳更為穩(wěn)定，證實(shí)了目測(cè)法確定的O/W型微乳成型臨界點(diǎn)，體系可能處于W/O型和O/W型雙連續(xù)相轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W型的最后階段[10-11]，尚未完全轉(zhuǎn)變?yōu)镺/W型。該結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了電導(dǎo)率-含水量曲線法確定的臨界點(diǎn)比目測(cè)法更為精確。

表2 目測(cè)法、電導(dǎo)率-含水量曲線法檢測(cè)結(jié)果

2.3 工藝篩選

2.3.1 電導(dǎo)率-含水量曲線法制備工藝的設(shè)定 將廣藿香揮發(fā)油分別與OA、IPM按質(zhì)量比1∶1的比例混勻，作為油相備用，選取預(yù)試驗(yàn)中篩選出的RH40、TW80 作為表面活性劑，PEG400、1,2-丙二醇、無水乙醇作為助表面活性劑。選擇在室溫（25 ℃）下進(jìn)行試驗(yàn)，首先使用磁力攪拌器在500 r/min轉(zhuǎn)速下將表面活性劑和助表面活性劑按照固定質(zhì)量配比Km值（Km值=表面活性劑/助表面活性劑）為2∶1混勻，再按（含藥油相/總表面活性劑）質(zhì)量比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，在500 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌10 min制成微乳原液4 g，然后加入0.2 g純化水，攪拌20 s，測(cè)電導(dǎo)率，再加入0.2 g純化水，攪拌，測(cè)電導(dǎo)率，直至體系含水量為80%時(shí)，將獲得的含水量、電導(dǎo)率值輸入Origin 2021繪圖，建立電導(dǎo)率-含水量曲線，將電導(dǎo)率最大時(shí)的含水量值作為O/W型微乳成型臨界點(diǎn)，對(duì)于不能成乳或者成乳后平均粒徑未在10~100 nm范圍的處方予以剔除；此外，部分微乳成乳后，靜置24 h又重新出現(xiàn)混濁，這類處方也予以剔除；最后，根據(jù)油相、總表面活性劑、水相的占比，使用Origin 2021軟件給合格的微乳處方繪制偽三元相圖。

2.3.1.1 油相、表面活性劑、助表面活性劑類型的選定 按“2.3.1”項(xiàng)的方法，將不同類型的油相、表面活性劑、助表面活性劑一一組合，按照固定配比Km為2∶1，混合油相、總表面活性劑質(zhì)量比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，配制微乳，將合格的微乳處方繪制偽三元相圖。結(jié)果顯示，圖2D的微乳成乳區(qū)域最大，故選定廣藿香揮發(fā)油/IPM作為含藥油相，TW80作為表面活性劑、PEG400作為助表面活性劑，用于下階段Km值的篩選。（見圖2）

圖2 不同微乳處方的偽三元相圖

2.3.1.2 Km值的選定 按“2.3.1”項(xiàng)的方法，將微乳處方廣藿香揮發(fā)油/IPM，TW80、PEG400，選定Km為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，含藥油相、總表面活性劑質(zhì)量比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、6∶4、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，配制微乳，篩選Km值。結(jié)果顯示，當(dāng)Km值為3∶1時(shí)微乳成乳區(qū)域最大。（見圖3）

圖3 不同Km 值的偽三元相圖

2.3.2 單因素試驗(yàn)“2.3.1.1”項(xiàng)和“2.3.1.2”項(xiàng)篩選結(jié)果表明，含藥油相與總表面活性劑質(zhì)量比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4時(shí)，可獲得合格微乳，含藥油相與總表面活性劑質(zhì)量比為7∶3、8∶2、9∶1時(shí)不能配制成乳，故選定含藥油相占比最小為10%，最大為60%（即廣藿香揮發(fā)油占比5%~30%）用于下一階段響應(yīng)面法工藝篩選；“2.3.1.2”項(xiàng)篩選結(jié)果表明，表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量配比Km值為2∶1、3∶1時(shí)可獲得較大的微乳成乳區(qū)域，當(dāng)Km值為4∶1或1∶1時(shí)微乳成乳區(qū)域明顯變小，說明上述兩種質(zhì)量配比下，不能獲得較大的含藥油相占比（微乳載藥量）。當(dāng)Km值＞4∶1或Km值＜1∶1時(shí)，微乳成乳區(qū)域會(huì)進(jìn)一步縮小，因此選定最大Km值為4∶1，最小Km值為1∶1進(jìn)行下一階段響應(yīng)面法工藝篩選。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速的不同，對(duì)微乳的成乳效果有一定的影響，為了考察磁力攪拌器轉(zhuǎn)速對(duì)微乳成乳效果的影響，采取固定含藥油相與總表面活性劑質(zhì)量比為1∶9、Km為3∶1，考察磁力攪拌器轉(zhuǎn)速對(duì)微乳成乳效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速低于500r/min時(shí)成乳時(shí)間較長(zhǎng)，且攪拌不夠均勻，不利于后續(xù)微乳的配制。當(dāng)磁力攪拌器轉(zhuǎn)速高于1 100 r/min時(shí)，過高的轉(zhuǎn)速帶動(dòng)了燒杯的轉(zhuǎn)動(dòng)影響了攪拌效果，且過高的轉(zhuǎn)速有可能將空氣帶入，制得的微乳有氣泡分散在體系中?；谏鲜鲈?，選定磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為500~1100 r/min。

2.3.3 響應(yīng)面法工藝篩選[12-13]

2.3.3.1 響應(yīng)面法考察因素 按“2.3.2”項(xiàng)的結(jié)果制定響應(yīng)面法考察因素水平表。（見表3）

表3 響應(yīng)面法考察因素水平表[14-15]

2.3.3.2 方案設(shè)計(jì)及結(jié)果[16]使用軟件Design-Expert 12.0對(duì)表3進(jìn)行響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見表4。

表4 工藝和結(jié)果

對(duì)表4的獲得的結(jié)果進(jìn)行平均粒徑、PDI的方差分析，見表5~6。結(jié)果顯示，平均粒徑、PDI獲得的數(shù)學(xué)模型均為極顯著性，且失擬項(xiàng)不具顯著性，表明上述數(shù)學(xué)模型模擬的情況較為準(zhǔn)確[17-18]。顯著因素廣藿香揮發(fā)油（%）、Km對(duì)粒徑、PDI響應(yīng)面分析見圖4。平均粒徑、PDI取最低值時(shí)擬合方程分別為：平均粒徑=27.230+5.790A+1.875B-0.426C+2.905AB-0.688AC+1.835BC-2.912A2+2.105B2+0.344AC2；PDI=0.102+0.037A+0.024B+0.005C+0.039AB+0.001AC+0.015BC-0.006A2+0.044B2-0.001C2。由于平均粒徑對(duì)微乳體系的影響更為重要，故選擇最小平均粒徑對(duì)應(yīng)的點(diǎn)作為最優(yōu)處方點(diǎn)，即廣藿香揮發(fā) 油 為10.07%、IPM 為10.07%、TW80 為60.43%、PEG400 為19.43%，Km為3.11，攪拌速率為622 r/min，獲得的平均粒徑理論值為17.64 nm，PDI為0.069。

圖4 廣藿香揮發(fā)油、Km 對(duì)平均粒徑、PDI 的響應(yīng)面圖

表5 平均粒徑的方差分析

表6 PDI 的方差分析

2.3.3.3 最優(yōu)工藝驗(yàn)證 對(duì)“2.3.3.2”獲得的最優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行3批次驗(yàn)證。結(jié)果顯示，平均粒徑、PDI值和模擬結(jié)果非常接近，說明此處方篩選結(jié)果可靠。（見表7）

表7 最優(yōu)工藝驗(yàn)證

2.4 微乳的理化性質(zhì)及穩(wěn)定性考察

2.4.1 微乳的電鏡圖 取“2.3.3.3”項(xiàng)微乳適量滴至銅網(wǎng)上，靜置10 min后，使用濾紙吸干，再加入2%的磷鎢酸負(fù)染10 min，再用濾紙吸干剩余液體，置于電鏡下觀察。圖片顯示微乳外觀飽滿、圓整，穩(wěn)定性較好。（見圖5）

圖5 微乳的形態(tài)

2.4.2 高速離心考察 將微乳于5 000 r/min轉(zhuǎn)速下高速離心30 min。結(jié)果顯示，微乳依舊澄清、透明，未見分層，表明微乳穩(wěn)定性好。

2.4.3 微乳類型鑒定及25 ℃下遮光、不遮光考察 取“2.3.3.3”項(xiàng)微乳適量，分別滴入亞甲基藍(lán)和蘇丹Ⅲ試劑，靜置5 min。圖6A、6B顯示，亞甲基藍(lán)在微乳中的擴(kuò)散效果明顯，而蘇丹Ⅲ停留在液面幾乎不擴(kuò)散，表明該微乳為O/W型，再取“2.3.3.3”項(xiàng)微乳適量，在室溫（25 ℃）條件下，分別作遮光處理和不作遮光處理，放置60 d后測(cè)平均粒徑、PDI，試驗(yàn)平行3次。圖6C、6D顯示，兩種狀態(tài)下微乳的顏色無明顯差異；遮光狀態(tài)下，測(cè)得微乳的平均粒徑為（19.23±0.26）nm、PDI為（0.085±0.005）；不遮光狀態(tài)下，測(cè)得微乳的平均粒徑為（19.47±0.31）nm、PDI為（0.089±0.009）。試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明，在25 ℃下，微乳放置60 d后平均粒徑、PDI雖略為增大，但依舊穩(wěn)定。

圖6 不同狀態(tài)下微乳的外觀

3 討 論

筆者查閱文獻(xiàn)[19]發(fā)現(xiàn)可使用滲濾電導(dǎo)模型理論解釋微乳的電導(dǎo)率-含水量曲線變化規(guī)律。以圖1為例，微乳原液階段，由于含水量為0，油的導(dǎo)電性又極低，此時(shí)電導(dǎo)率接近0。隨著含水量的增加，體系間連續(xù)相依舊為油相，故電導(dǎo)率的增加較為緩慢。當(dāng)含水量到達(dá)滲濾閾值[20]（滲濾閾值：導(dǎo)電微粒占整個(gè)體系的體積分?jǐn)?shù)）后，帶電液滴增加明顯，故電導(dǎo)率增加迅速，此時(shí)體系為W/O型；隨著含水量的進(jìn)一步增加，微乳液滴與液滴之間發(fā)生碰撞，形成了導(dǎo)電鏈，微乳的電導(dǎo)率又進(jìn)一步增加，直至電導(dǎo)率的頂點(diǎn)，此范圍的微乳為W/O型和O/W型雙連續(xù)型。當(dāng)微乳的電導(dǎo)率到達(dá)頂點(diǎn)后，含水量的增加又稀釋了帶電的微乳液滴，從而電導(dǎo)率開始下降，此時(shí)體系轉(zhuǎn)變?yōu)閱我坏腛/W型。該理論可以有效解釋微乳電導(dǎo)率的變化與微乳的相間關(guān)系，但是之前的報(bào)道沒有采用直觀的方式來證實(shí)該理論的可靠性，而本研究則通過拍攝微觀狀態(tài)下微乳的形態(tài)驗(yàn)證了該理論的可靠性。此外，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)攪拌速率對(duì)微乳的成乳有一定的影響，但是實(shí)際篩選結(jié)果卻并不顯著，因此，微乳的攪拌速率適中即可，太快可減少乳化時(shí)間，但容易帶入空氣，太慢則成乳時(shí)間過長(zhǎng)，或難于配制成乳。再者，適當(dāng)增加微乳的載藥量可減少服藥量，但是載藥量不宜一味增大，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)微乳載藥過大容易造成平均粒徑增大破壞其穩(wěn)定性，甚至出現(xiàn)分層、變混濁的現(xiàn)象，因此，要擴(kuò)大中藥微乳制劑，還須提高中藥精制、提純技術(shù)方可實(shí)現(xiàn)。本研究通過測(cè)定平均粒徑、PDI及生物透射電鏡觀察的手段驗(yàn)證了電導(dǎo)率-含水量曲線法中電導(dǎo)率最大值作為O/W型微乳成型臨界點(diǎn)的精確性，可以為中藥微乳制劑的制備提供一定的參考。