馬騰飛,喻肖瑤,趙天濤,吳 進(jìn),封 麗

(1.重慶市生態(tài)環(huán)境科學(xué)研究院 水環(huán)境工程技術(shù)創(chuàng)新中心, 重慶 401147;2.重慶工商大學(xué) 國家智能制造服務(wù)國際科技合作基地, 重慶 400067;3.重慶理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 重慶 400054)

0 引言

自1982年Liedeberg等證明了表面等離體共振(surface plasmon resonance,SPR)作為一種光學(xué)生物傳感器的效用以來[1],SPR技術(shù)在生物傳感器領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展和應(yīng)用。SPR傳感器在生物分子相互作用研究方面具有用樣量少、無損免標(biāo)記和實(shí)時(shí)監(jiān)測的優(yōu)勢。因此,SPR生物傳感器在基礎(chǔ)生物學(xué)研究[2-5]、藥物發(fā)現(xiàn)和臨床診斷[6-8]、環(huán)境和農(nóng)業(yè)監(jiān)測[9-11]中的應(yīng)用越來越廣泛。

SPR成像技術(shù)(surface plasmon resonance imaging,SPRI),也被稱為“SPR顯微鏡”[12],由Rothenh?usler等[13]在1988年首次提出,隨后相關(guān)領(lǐng)域研究獲得了快速增長[14-15]。與傳統(tǒng)的SPR生物傳感器相比,SPRI提供的是傳感器芯片表面區(qū)域的平均共振信號隨時(shí)間的變化情況。利用SPRI技術(shù)可以研究芯片表面的特定區(qū)域(regions of interest,ROI),通過成像設(shè)備(通常是CCD或CMOS相機(jī))記錄芯片表面的SPR圖像。因此,當(dāng)芯片表面設(shè)計(jì)有大量的ROI(如微陣列)時(shí),可以實(shí)現(xiàn)高通量的分析。此外,在SPRI系統(tǒng)中引入透鏡[16-18](通常在棱鏡和相機(jī)之間),或者用高數(shù)值孔徑物鏡代替棱鏡[19-21]時(shí),可以獲得芯片表面的高空間分辨率圖像。

SPRI的優(yōu)點(diǎn)使其不僅可以用于生物分子研究,如蛋白質(zhì)[22-23]、DNA[24-25]、RNA[26-27],而且可以用于人體細(xì)胞研究,如細(xì)胞生理變化與表面的相互作用,以及細(xì)胞感應(yīng)等[28]。然而,相比生物分子和人體細(xì)胞研究領(lǐng)域,在與人類生產(chǎn)生活和生命健康關(guān)聯(lián)緊密的細(xì)菌研究領(lǐng)域,SPRI的應(yīng)用進(jìn)展相對緩慢和有限。其主要原因可能是樣品復(fù)雜的處理要求和潛在的儀器污損問題[28]。隨著近些年來SPRI技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步,SPRI技術(shù)用于細(xì)菌領(lǐng)域的研究也不斷增多。

為了引起更多相關(guān)領(lǐng)域研究人員的興趣和關(guān)注,展示SPRI技術(shù)在細(xì)菌分析與檢測領(lǐng)域的良好應(yīng)用前景,總結(jié)了過去十年中涉及細(xì)菌領(lǐng)域的相關(guān)SPRI研究,主要包括SPRI的基本原理介紹,SPRI用于單細(xì)菌行為和生物膜分析方面的研究,以及SPRI在細(xì)菌檢測與鑒定方面的應(yīng)用情況。同時(shí)對SPRI技術(shù)未來在細(xì)菌分析與檢測領(lǐng)域的應(yīng)用提出了展望,以期為SPRI技術(shù)進(jìn)一步應(yīng)用于細(xì)菌研究相關(guān)領(lǐng)域提供參考。

1 SPRI原理簡介

當(dāng)外部光以一定條件入射在金屬表面,并在金屬/電介質(zhì)界面上誘導(dǎo)金屬的自由電子振蕩產(chǎn)生共振時(shí),就會(huì)發(fā)生SPR現(xiàn)象。因此,在一定的入射角度下,金屬吸收了輻射能量并顯示出反射率的最小值。這個(gè)共振角對與金屬表面(通常在垂直方向300 nm內(nèi))接觸的電介質(zhì)(即實(shí)驗(yàn)中的樣品)的折射率極為敏感。當(dāng)共振角固定時(shí),樣品的折射率變化導(dǎo)致反射率的變化,這可以在SPR圖像中得到體現(xiàn)。SPRI工作原理見圖1[29]。與傳感表面的折射率分布相對應(yīng)的反射光被CCD相機(jī)捕捉,并轉(zhuǎn)化為2D強(qiáng)度對比圖像[29]。

圖1 SPRI工作原理示意圖

2 SPRI用于單個(gè)細(xì)菌研究

2.1 蛋白質(zhì)與單個(gè)細(xì)菌相互作用

當(dāng)與外部配體相互作用時(shí),由于固有的細(xì)胞間的異質(zhì)性,單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的反應(yīng)可能不同。然而,這種異質(zhì)性會(huì)在細(xì)菌群體研究中被忽略了,因?yàn)閷?xì)菌群體研究中獲得的數(shù)據(jù)通常是許多細(xì)菌的平均值。SPRI技術(shù)的出現(xiàn)為從單菌水平上測量配體與細(xì)菌相互作用的結(jié)合動(dòng)力學(xué)提供了新的思路[30]。通過將個(gè)體細(xì)菌修飾于SPRI芯片表面,隨后用SPRI系統(tǒng)對抗體與細(xì)菌的結(jié)合過程和解離過程進(jìn)行監(jiān)測,最后可以從圖像序列提取的反射光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線中獲得詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)信息。結(jié)果表明,盡管所獲得的動(dòng)力學(xué)常數(shù)的平均值與體外實(shí)驗(yàn)研究的數(shù)據(jù)水平一致,但在結(jié)合動(dòng)力學(xué)方面存在著較大的細(xì)菌個(gè)體間差異,不同細(xì)菌個(gè)體間的動(dòng)力學(xué)常數(shù)甚至存在著若干個(gè)數(shù)量級水平的差異,這些差異可能與細(xì)菌表面抗原表達(dá)和分布的不同有關(guān)。這項(xiàng)研究顯示了細(xì)菌與外部配體結(jié)合能力的異質(zhì)性,進(jìn)而表明了SPRI技術(shù)在單個(gè)細(xì)菌水平上探索細(xì)菌生理特性的潛力。

2.2 單個(gè)細(xì)菌活性研究

細(xì)菌由于其自身代謝等生理活動(dòng),附著于物體表面時(shí)會(huì)表現(xiàn)出納米級別的“抖動(dòng)”行為,常規(guī)的光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡無法觀察到細(xì)菌的這種行為,而利用SPRI技術(shù)則可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌的這種“抖動(dòng)”行為的監(jiān)測[31-32]。Syal等[31]通過觀察營養(yǎng)物質(zhì)和不同抗生素作用下細(xì)菌在SPRI芯片表面的“抖動(dòng)”情況,證明細(xì)菌在芯片表面垂直方向上的振幅變化可以用來表征細(xì)菌活性變化,從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌活性的實(shí)時(shí)快速判定。基于此,SPRI技術(shù)可以作為一種快速的抗生素敏感性測試方法[31],較傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法節(jié)省大量時(shí)間。類似地,Liu等[32]采用SPRI方法來監(jiān)測水中存在不同化學(xué)物質(zhì)時(shí)單個(gè)細(xì)菌的活性,從而快速評估化學(xué)物質(zhì)的急性毒理作用。因此,SPRI技術(shù)可以作為一種實(shí)時(shí)快速檢測細(xì)菌活性的技術(shù)手段,從而用于抗菌藥物研發(fā)和物質(zhì)毒性毒理方面的研究。

3 SPRI用于細(xì)菌生物膜研究

生物膜是細(xì)菌存在的一種常見形式,在細(xì)菌感染、細(xì)菌抗藥性和廢水處理等領(lǐng)域都有大量研究。傳統(tǒng)的生物膜研究方式主要集中于生物膜生物量、表面形貌結(jié)構(gòu),由于技術(shù)手段要求,在取樣備樣過程中可能對生物膜結(jié)構(gòu)或細(xì)菌活性構(gòu)成損傷,且難以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)觀測。SPRI技術(shù)的出現(xiàn)為生物膜研究提供了一個(gè)新的視角。

通過對芯片表面進(jìn)行修飾模擬生物膜附著生長的基底表面,根據(jù)細(xì)菌在芯片表面附著生長時(shí)產(chǎn)生的光強(qiáng)信號變化,SPRI技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對芯片表面細(xì)菌附著情況和生物膜形成過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測。Abadian等首次使用SPRI對大腸桿菌和銅綠假單胞的生物膜形成和清除過程進(jìn)行觀察[33],并用SPRI檢驗(yàn)了牛血清蛋白和酪蛋白作為表面涂層對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌生物膜形成的預(yù)防效果[34]。類似地,Aninwene等[35]利用SPRI分別觀察了金黃色葡萄球菌在修飾有糖蛋白潤滑素(LUB)涂層的芯片和修飾有牛頜下腺粘蛋白(BSM)涂層的芯片表面的附著和成膜能力,結(jié)果表明金黃色葡萄球菌在LUB涂層表面的附著和成膜能力下降90%以上,在BSM表面僅下降7%左右。這些研究充分展現(xiàn)了SPRI技術(shù)在生物膜研究和抗生物膜材料研發(fā)方向的良好應(yīng)用前景。

4 SPRI用于細(xì)菌定性/定量檢測

對環(huán)境樣品或指定樣品中的細(xì)菌進(jìn)行定性鑒定和/或定量檢測,在污染防治、食品安全和醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域均具有重要意義。SPRI技術(shù)由于其用樣量少、可以實(shí)時(shí)快速檢測的優(yōu)勢,已在細(xì)菌鑒定和檢測方面顯示了巨大潛力?，F(xiàn)有研究報(bào)道中,根據(jù)檢測時(shí)是否在芯片表面對細(xì)菌進(jìn)行了一定時(shí)間的培養(yǎng),可將檢測方法分為非培養(yǎng)檢測和培養(yǎng)檢測兩類。

4.1 非培養(yǎng)檢測

非培養(yǎng)檢測主要利用細(xì)菌的表面特異性實(shí)現(xiàn)。常用的方法包括直接檢測法和強(qiáng)化檢測法。直接檢測法通過在芯片表面修飾可以捕獲細(xì)菌的抗體或其他物質(zhì),從而將樣品中的細(xì)菌固定在芯片表面,由此產(chǎn)生的SPRI檢測信號變化表明細(xì)菌的存在并用于計(jì)算細(xì)菌的數(shù)量。當(dāng)樣品中細(xì)菌含量較低時(shí),直接法檢測信號弱,檢出限高,因此其使用較為受限。強(qiáng)化檢測法是在直接檢測法的基礎(chǔ)上通過在捕獲的細(xì)菌表面流過含有特異性抗體或探針的溶液,實(shí)現(xiàn)對SPRI檢測信號的進(jìn)一步放大。強(qiáng)化法檢出信號強(qiáng),檢出限低,可以檢出樣品中較低含量的細(xì)菌,因此,得到研究人員的更多關(guān)注。

Yodmongkol等[36]采用強(qiáng)化檢測法對溶液中的白色念珠菌進(jìn)行檢測。首先在SPRI芯片表面修飾一層11-巰基十二烷酸分子層,用于固定白色念珠菌特異性抗體,當(dāng)溶液中的白色念珠菌被芯片表面的抗體捕獲后,再次在溶液中流過白色念珠菌特異性抗體,從而實(shí)現(xiàn)檢測信號的放大。由于使用了針對白色念珠菌表面特異性抗原的特異性抗體,該方法可以從白色念珠菌、大腸桿菌、變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌、β-鏈球菌和干酪乳桿菌的混合樣品中檢測出白色念珠菌的含量。類似地,Puttharugsa等[37]采用強(qiáng)化檢測法對植物樣品中致病菌Acidovoraxavenaesubsp.citrulli(Aac)進(jìn)行檢測,在使用多克隆抗體對SPR信號進(jìn)行放大后,SPRI系統(tǒng)對Aac的檢出限可達(dá)5×105CFU/ml。

除了利用細(xì)菌表面特性進(jìn)行檢測,Foudeh等[38]提出利用環(huán)境中細(xì)菌的16s rRNA進(jìn)行定性檢測。因?yàn)榄h(huán)境中RNA的存在與活細(xì)菌活動(dòng)直接相關(guān),而死亡的細(xì)菌的RNA會(huì)快速降解[39]。Foudeh等[38]采用SPRI技術(shù)對水體中引發(fā)軍團(tuán)病的Legionellapneumophila細(xì)菌進(jìn)行檢測,對L.pneumophila16s rRNA的檢測方法與細(xì)菌強(qiáng)化檢測法類似,首先在SPRI芯片表面修飾上與L.pneumophila16s rRNA互補(bǔ)的DNA探針,然后將含有目標(biāo)RNA,以及可以與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的識別探針的樣品流過芯片表面,樣品中的目標(biāo)RNA被DNA探針?biāo)东@,同時(shí)識別探針也與被捕獲的RNA結(jié)合,而識別探針上同時(shí)含有可與量子點(diǎn)結(jié)合的基團(tuán),當(dāng)最后含有量子點(diǎn)的溶液加入后,被捕獲的RNA因結(jié)合了量子點(diǎn),產(chǎn)生的SRPI信號得到進(jìn)一步放大,從而實(shí)現(xiàn)了對水環(huán)境樣品中RNA在亞飛摩爾(sub-femtomole)水平上的快速檢出。

4.2 培養(yǎng)檢測

非培養(yǎng)檢測法中的直接法由于對低濃度細(xì)菌樣品檢測信號弱而應(yīng)用受限,因此研究人員考慮對芯片表面捕獲的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng),以增強(qiáng)檢測信號。Bouguelia等[40]研究發(fā)現(xiàn),隨著細(xì)菌增殖,SPRI信號不斷增強(qiáng),可以根據(jù)細(xì)菌濃度變化、細(xì)菌世代時(shí)間、SPRI信號變化和培養(yǎng)時(shí)間之間的量化關(guān)系,反推出培養(yǎng)初期的細(xì)菌濃度,即樣品中的細(xì)菌濃度。該方法可用于對Salmonellaenterica,Streptococcuspneumoniae和EscherichiacoliO157∶H7的檢測,檢出限可低至(2.8±19.6)CFU/mL。類似地,基于培養(yǎng)檢測法,Morlay等[41]采用SPRI技術(shù)實(shí)現(xiàn)嬰兒配方粉中的食品病原體克羅諾桿菌和沙門氏菌的快速檢測,檢出限可達(dá)30 CFU/25g奶粉;Mondani等[42]實(shí)現(xiàn)對不同溫度范圍內(nèi)保存的食物樣品中E.coliO157∶H7的有效檢測;Mallevre等[43]則利用SPRI技術(shù)觀察了納米氧化銀壓力下細(xì)菌的生長情況,實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)毒性檢測研究。

非培養(yǎng)檢測方法中的強(qiáng)化檢出法可以獲得較好的檢出限,但使用的抗體普遍較昂貴,因此研究人員也嘗試通過采用較為經(jīng)濟(jì)的物質(zhì)替代抗體的方式來降低實(shí)驗(yàn)成本。Bulard等[44]采用碳水化合物修飾到芯片表面以固定細(xì)菌。當(dāng)細(xì)菌被固定到芯片表面后,實(shí)時(shí)記錄生物芯片上細(xì)菌生長的SPRI信號。通過對細(xì)菌SPRI信號和對照信號處理獲得不同菌株的“差分時(shí)間”,進(jìn)而得到碳水化合物芯片對不同菌株的指紋圖譜。該方法可以實(shí)現(xiàn)10 h內(nèi)對5種初始濃度僅為102CFU/mL的大腸桿菌菌株的有效區(qū)分和檢測,在食品安全領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景。

5 結(jié)束語

SPRI技術(shù)具有樣品用量少、實(shí)時(shí)快速和樣品無損監(jiān)測/檢測的優(yōu)點(diǎn),在環(huán)境、農(nóng)業(yè)、食品安全和醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的細(xì)菌分析與檢測方面具有良好的應(yīng)用前景。未來仍有許多需要深入研究的地方,以進(jìn)一步提高細(xì)菌檢測結(jié)果的精準(zhǔn)度和細(xì)菌生理機(jī)制等方面研究的深度,以及繼續(xù)降低實(shí)驗(yàn)成本等。相關(guān)的研究方向包括但不限于:① 實(shí)際樣品預(yù)處理方法,如對影響背景信號的高鹽度樣品進(jìn)行脫鹽處理;② SPRI芯片的修飾及再生方法,如結(jié)合目標(biāo)菌株表面特性尋找或研發(fā)吸附結(jié)合力強(qiáng)且對細(xì)菌活性影響較小的芯片修飾物質(zhì),研制廉價(jià)易再生的芯片修飾涂層等;③ SPRI與其他技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用,如與電化學(xué)技術(shù)結(jié)合,檢測小分子物質(zhì)與細(xì)菌的結(jié)合動(dòng)力學(xué)[45],或是與質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行結(jié)合,探究不同條件下細(xì)菌分泌胞外蛋白和代謝產(chǎn)物情況[46];④ 對圖像數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化,如引入計(jì)算機(jī)深度學(xué)習(xí)[47]等算法提升數(shù)據(jù)處理精準(zhǔn)度等。