陳 旺，王 元，劉英玉*，劉俊飛，王雅雯，田亞琴，宋超慧

（ 1. 新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆 烏魯木齊 830052 ； 2. 昌吉天康畜牧有限公司，新疆 昌吉 831100 ）

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌（Streptococcus suis）引起的一種細菌性傳染病，通常引發(fā)豬的肺炎和敗血癥等疾病，是由C、D、E 及L 群鏈球菌引起的一種多型性豬傳染病的總稱，臨床表現(xiàn)分為關節(jié)腫大、淋巴結腫脹、腦膜腦炎及敗血癥等多種類型[1-3]。豬鏈球菌是一種革蘭氏陽性菌，在自然界分布非常廣泛，不僅可以感染豬，還可以引起人、馬、牛、羊等多種動物的感染。豬鏈球菌可分為35 個血清型（1～34 型和1/2 型），其中1、2、7、9 型在中國比較常見，2 型毒力最強而且流行最廣[4]。常見的豬鏈球菌診斷方法主要有臨床診斷、動物尸體剖檢、病原分離培養(yǎng)及生化鑒定、血清學鑒定、分子水平鑒定等[5]。

2型豬鏈球菌可通過黏膜或傷口等傳播途徑感染人并引發(fā)疾病，是一種重要的人畜共患病原菌[6]。2型鏈球菌病通常呈地方性流行，一年四季均可發(fā)病，但常見于4～11周齡的豬群[7-8]。1998—1999 年中國江蘇省部分地區(qū)和2005年四川省暴發(fā)2型鏈球菌病，對豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。2022年7月，新疆昌吉市某規(guī)?；i場的保育仔豬出現(xiàn)發(fā)熱、關節(jié)腫脹、站立不穩(wěn)、腹部背部皮膚有紫色斑塊等臨床癥狀。本試驗采集了部分病死豬的組織樣品，并進行細菌分離鑒定試驗，分離純化菌株通過進行形態(tài)學觀察、生化反應鑒定、PCR鑒定及血清型分型、藥敏試驗進一步確定病因，以期為盡快確診并指導豬場合理使用藥物進行預防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

樣品采集地點為新疆昌吉市某規(guī)模化豬場，無菌采集病死豬的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結等組織器官作為試驗樣品。

1.1.2 主要儀器與試劑

細菌生化管購自杭州微生物試劑有限公司；PCR 儀、凝膠成像儀購自Bio Rad 公司；生物安全柜購自濟南鑫貝西生物技術有限公司；全自動核酸提取儀購自上海之江生物醫(yī)藥科技有限公司。

革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；核酸提取試劑盒購自上海之江生物醫(yī)藥科技有限公司胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自美國BD 公司；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）購自美國BD公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原的分離培養(yǎng)與純化

嚴格按照無菌要求操作，將病死保育豬的心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結等樣品劃線接種在TSA 平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，察看菌落培養(yǎng)生長情況。挑取2～3株疑似目標菌落進行革蘭氏染色鏡檢觀察，同時劃線接種于TSA瓊脂平板進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 生化試驗

將菌液分別接種于七葉苷、棉籽糖、甘露糖、尿素、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖等生化鑒定管中以及甘油、6.5% NaCl液體和麥康凱平板上，培養(yǎng)10～12 h觀察生化鑒定結果。

1.2.3 PCR檢測和16S rRNA測序

用核酸提取試劑盒提取DNA，-20 ℃保存。根據(jù)參考文獻[9]合成豬鏈球菌管家基因谷氨酸脫氫酶（gdh）引物，預擴增目的片段大小為689 bp；按照參考文獻[10]合成豬鏈球菌16S rRNA引物，預擴增目的片段大小為328 bp，引物序列見表1。將陽性PCR 擴增產(chǎn)物送至上海生工測序，將測序結果放在美國生物技術信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫上進行BLAST堿基序列比對，構建系統(tǒng)進化樹。

表1 PCR引物序列信息Tab.1 Primer sequences information for PCR

1.2.4 血清型分型（見表1）

參照文獻[9]合成2型豬鏈球菌莢膜多糖（CPS2J）特異性分型用引物，預擴增片段大小為675 bp。

1.2.5 藥敏試驗

采用紙片擴散法，檢測該分離菌對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素、磺胺嘧啶鈉、青霉素、阿莫西林、頭孢噻呋、氟苯尼考等8 種臨床常用藥物的敏感性。將培養(yǎng)10～12 h生長良好的100 μL 分離菌液涂布于TSA 平板表面，取藥敏紙片貼于TSA平板表面，待完全吸收后，將平板37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，測定抑菌圈直徑大小，依據(jù)抑菌環(huán)直徑解釋標準[5,11]判定菌株對藥物的敏感性。

2 結果與分析

2.1 細菌分離純化及染色鏡檢

無菌取病死豬的心、肺、淋巴結等組織器官涂抹在TSA 平板上，37 ℃培養(yǎng)10～12 h后觀察菌落形態(tài)并挑取目標菌落進行革蘭氏染色鏡檢觀察，結果見圖1。

圖1 分離株菌落形態(tài)及鏡檢結果Fig.1 Colony morphology and microscopic examination results of isolated strains

由圖1（a）可知，分離株菌落針尖大小、灰白色、圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊。

由圖1（b）可知，菌株革蘭氏陽性，有長鏈狀、短鏈狀、單鏈或雙鏈等多種形態(tài)。

2.2 分離株生化反應試驗結果

將純化后的分離株接種于細菌生化反應管內，培養(yǎng)12 h后觀察。結果顯示，分離株可發(fā)酵葡萄糖、棉籽糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、乳糖、甘露糖、果糖；能夠分解七葉苷，但不能分解尿素；在甘油、6.5% NaCl溶液和麥康凱平板中無法生長。生化鑒定結果與豬鏈球菌的生化特性相符。

2.3 分離株PCR鑒定及測序結果（見圖2、圖3）

圖2 分離株PCR鑒定結果Fig.2 PCR identification results for isolated strains

圖3 系統(tǒng)進化樹構建結果Fig.3 Construction results of phylogenetic tree

由圖2可知，采用細菌16S rRNA基因通用引物和豬鏈球菌管家基因gdh引物對分離株進行PCR擴增，電泳結果顯示擴增出約328 bp和689 bp的目的條帶，與預期目的條帶大小一致。

由圖3 可知，將16S rRNA 擴增產(chǎn)物的測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫上進行BLAST堿基序列比對，結果顯示分離株與豬鏈球菌同源性高達100%，在系統(tǒng)進化樹上與2型豬鏈球菌處于同一分支，確定所分離株為2型豬鏈球菌。

2.4 分離株血清型分型結果（見圖4）

由圖4 可知，使用CPS2J特異性基因引物經(jīng)PCR 擴增和電泳后，擴增出約675 bp的目的條帶，該菌株為2型豬鏈球菌。

注 ： M為DL2000 Marker；1為2型豬鏈球菌；2為陰性對照。

2.5 分離株藥敏試驗結果（見表2）

表2 分離株藥敏試驗結果Tab.2 Drug sensitivity test results of isolated strain

由表2可知，分離株對恩諾沙星、環(huán)丙沙星、林可霉素、阿莫西林、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考均敏感，對青霉素中介，對磺胺嘧啶鈉耐藥。

3 討論

豬鏈球菌病是一類非常重要的人畜共患急性傳染病，除了能夠感染人和豬以外，還能夠感染馬、羊、貓、狗、野豬等其他動物[5]。豬鏈球菌的致病性差異非常大，與其不同的血清型有關，只有強毒力的菌株才能夠引起豬肺炎、敗血癥和突然死亡等癥狀，低毒力的菌株多見于豬的呼吸道[12-14]。近些年，隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)蓬勃發(fā)展，豬鏈球菌發(fā)病率也呈升高的趨勢發(fā)展，極大地影響了我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[15]。尤其是在中國湖南、廣東、廣西、江蘇、四川、新疆、上海等地均有2 型豬鏈球菌感染的報道[6,15]。此外，豬鏈球菌作為革蘭氏陽性菌，對各種抗生素藥物的抵抗力不是很強[16-17]。但隨著近年來日常生產(chǎn)過程中抗生素的大量使用，導致豬鏈球菌出現(xiàn)不同程度的耐藥現(xiàn)象，進而產(chǎn)生了大量的耐藥菌株，引起臨床用藥效果不明顯、疾病控制難度越來越大等現(xiàn)象。而且，豬鏈球菌的耐藥基因可通過食物鏈傳遞給人類，因此豬場管理者在臨床用藥時應按照交替輪換用藥、聯(lián)合用藥的準則，避免產(chǎn)生大量耐藥菌株[18]。

本研究中，經(jīng)藥敏試驗表明分離株對8 種臨床常見藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中對環(huán)丙沙星、林可霉素、恩諾沙星、阿莫西林、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考敏感，對青霉素中介，對磺胺嘧啶鈉耐藥，推測可能與臨床長期使用磺胺類藥物存在較大關系。此藥敏試驗結果與彭凌等[19]、劉澤文等[20]、徐引弟等[21]研究結果不完全相同，說明抗生素在生產(chǎn)過程中的普遍使用造成臨床上菌株的耐藥性差異很大。因此，為了解在豬鏈球菌的防治過程中抗生素的耐藥情況，開展藥敏試驗非常有必要。

4 結論

本研究結果表明，新疆昌吉市某規(guī)?；i養(yǎng)殖場保育仔豬死亡的原因是2型豬鏈球菌感染，建議該豬場可選擇環(huán)丙沙星、林可霉素、恩諾沙星等藥物進行治療與防控。