王 曼,張 政,伊麗達娜·迪力夏提,吳 斌

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所/新疆農(nóng)產(chǎn)品加工與保鮮重點實驗室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】木納格(VitisviniferaL.cv Munage)是新疆主栽葡萄品種之一,其采后極易受到病原菌的侵染。隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的運用,許多抗真菌基因已經(jīng)從多種植物中分離出來:如幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶和其它致病相關(guān)蛋白[1]。在植物與病原菌脅迫響應(yīng)的過程中,植物進化出一系列復(fù)雜的機制來應(yīng)對病原菌感染,包括病原菌感知、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和誘導(dǎo)特定抗性相關(guān)基因[2]。當(dāng)植物受到病原微生物侵染時主要是通過防御基因的表達、氧化應(yīng)激反應(yīng)和代謝系統(tǒng)獲得抗性來抵抗病菌的入侵[3]?！厩叭搜芯窟M展】谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase,GST)具有多功能性,在植物體內(nèi)發(fā)揮解毒功能[4]。GST對于底物的特異性選擇是由兩個基本的功能域決定,分別是位于N端的GSH結(jié)合位點和位于C端的化合物底物的結(jié)合位點[5]。作為GSH途徑中的關(guān)鍵酶之一,具有催化還原性GSH和其他物質(zhì)(如疏水、親電底物)產(chǎn)生共價化合物的作用[6]。GST是一個多樣化的蛋白質(zhì)家族編碼的多基因家族。GSTs可作為替代底物催化各種反應(yīng),它們可參與生物解毒、應(yīng)激響應(yīng)和次級代謝等生理過程[7]。GST還是一種可溶性蛋白由兩個亞基組成,可催化GSH與疏水性物質(zhì)發(fā)生親電取代反應(yīng),轉(zhuǎn)運蛋白可將相關(guān)代謝物轉(zhuǎn)運至液泡中,進而降解有毒有害物質(zhì),從而減少對細胞的毒害作用[8]。植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)和次級代謝產(chǎn)物的運輸?shù)冗^程需要GST家族基因的參與,其作用表現(xiàn)在抵御病原微生物侵染、排除外來化合物、抑制自身代謝產(chǎn)生的有毒物質(zhì)以及冷害等環(huán)境脅迫方面效果顯著[9]?！颈狙芯壳腥朦c】目前,已對小麥[3]、水稻[10]和煙草[11]等植物中的GST基因進行了生物學(xué)分析并發(fā)現(xiàn)GST基因在提高植物對生物和非生物脅迫的抗性中發(fā)揮著重要的作用[12]。然而,關(guān)于GST基因參與調(diào)控果實采后抗性的研究較少,尤其是葡萄中VvGST1的分子生物學(xué)的研究鮮有報道。需分析木納格葡萄谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶VvGST1基因克隆與序列分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】以木納格葡萄為試材,對其VvGST1基因克隆并進行生物信息學(xué)分析,為研究VvGST1基因在鮮食葡萄中的抗病功能奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 葡 萄

木納格葡萄采于新疆阿圖什市。挑選果梗新鮮、成熟度一致(TSS≥18%)、大小均一、無表面損傷無病蟲害的葡萄串。采收后的葡萄立即用冷鏈車運回實驗室,用液氮速凍果肉后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試 劑

瓊脂糖、2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye),生工生物工程(上海)股份有限公司;HyPure漿果RNA提取試劑盒,北京君諾德生物技術(shù)有限公司;M5 DL2000 DNA Marker,北京聚合美生物科技有限公司;5X All-In-One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit),ABM公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

臺式離心機,上海安亭科學(xué)儀器制造廠;PCR儀,美國Bio-Rad有限公司;漩渦混合器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;干式恒溫器,杭州美盛儀器有限公司;核酸定量儀,杭州奧盛有限公司;電泳儀電源、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng),上海天能有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA 提取與cDNA第一條鏈的合成

使用HyPure漿果RNA提取試劑盒,提取葡萄果實的總RNA。隨后,通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。cDNA合成采用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒。

1.2.2 葡萄果實VvGST1全長克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的釀酒葡萄VvGST1基因核苷酸序列(序列號:NM_001281248.1),利用DNA man9.0 軟件設(shè)計引物,VvGST1-F:AAGAGGCTGGCAAGAAGGAAT,VvGST1-R:CTGTAATCCACCACCAAGTCATAG,引物由上海生工合成。經(jīng)PCR擴增試驗,獲得目的條帶。將獲得的目的條帶回收和核酸電泳檢測。純化后的目的片段進行連接。12 h后在4℃條件下轉(zhuǎn)化至DH5a,37℃過夜培養(yǎng),挑取菌體正常的單克隆,將擴增的菌液進行PCR鑒定,鑒定完成后每片段挑選3例陽性單克隆菌液雙向測序,測序列與參照序列進行對比,結(jié)果一致可用于后續(xù)分析。

1.2.3VvGST1基因的生物信息學(xué)分析

將測序結(jié)果通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST工具確定完整編碼框(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov);使用蛋白質(zhì)查找開放閱讀框ORF Finder在線對比(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder);利用ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和理化特性(http://web.expasy.org/prot-param);利用Prot Scale軟件分析蛋白質(zhì)的疏水性(http://web.expasy.org/protscale/);使用SignalP軟件對蛋白質(zhì)信號肽分析(https://services.healthtech.dtu.dk/);使用TMHMM軟件對蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域分析(https://services.healthtech.dtu.dk/);通過Softberry在線軟件的ProtComp 9.0預(yù)測VvGST1的亞細胞定位;使用SWISS-MODEL軟件對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(http://swissmodel.Expasy.org/)。

2 結(jié)果與分析

2.1VvGST1保守序列的擴增及鑒定

研究表明,葡萄基因條帶特異性好,清晰度高。所獲得的VvGST1的片段長度為719 bp,目的基因長度與預(yù)測的結(jié)果一致。該條帶滿足測序反應(yīng)的要求,已擴增到目的基因片段。隨機選其中一個條帶膠回收進行后續(xù)克隆實驗。所有的測序峰圖結(jié)果是較為單一的峰圖,背景較弱無雜峰亂峰,可以用于后續(xù)的分析。圖1

圖1 葡萄VvGST1基因PCR擴增電泳圖、測序峰圖和對比

2.2VvGST1氨基酸序列比對

研究表明,木納格葡萄中的VvGST1的氨基酸序列為保守序列。該序列與釀酒葡萄GST1(NM_001281248.1)的同源性高達97%,與梅(Prunus mume,XM_008228042.2)、甜杏仁(Prunus dulcis,XM_034357965.1)、桃(Prunus persica,XM_020561748.1)相似度均超過70%,分別為71.94%、71.78%和71.29%?？寺～@得的GST是葡萄果實中GST1基因。進一步與其他物種比對氨基酸序列,各物種間的GST基因具有較高的同源性。圖2

2.3VvGST1與其它植物GST氨基酸序列系統(tǒng)進化樹

研究表明,構(gòu)建棉花(XM01260636.1)、桃(XM020561748.1)、梅(XM008228041.2)、櫻桃(XM021977290.1)、甜杏仁(XM034357965.1)和板栗(DQ673317.1)等植物的GST氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹,克隆的VvGST1基因編碼蛋白與棉花屬GST的親緣關(guān)系最近且屬于為Tua類GST基因。圖3

圖3 VvGST1與其它植物GST氨基酸序列系統(tǒng)進化樹

2.4 VvGST1蛋白質(zhì)的氨基酸理化特性

研究表明,VvGST1蛋白質(zhì)分子式為C1178H1799N293O321S11;相對分子質(zhì)量為25.55 kDa;原子總數(shù)3 602;等電點為6.32;推導(dǎo)半衰期在30 h左右。其中,不穩(wěn)定指數(shù)39.22,該蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定性。VvGST1氨基酸數(shù)量為221個,氨基酸種類為20種。相對含量較高為亮氨酸(9.5%)、賴氨酸(9.0%)和谷氨酸(8.1%);氨基酸相對含量較低的是色氨酸(2.3%)和谷氨酰胺(1.8%)。其中帶負電荷的天冬氨酸和谷氨酰胺殘基總數(shù)是30,帶正電荷的精氨酸和賴氨酸殘基總數(shù)是28。圖4

圖4 VvGST1基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成

2.5 VvGST1蛋白親疏水性

研究表明,在整個肽鏈中大多數(shù)氨基酸數(shù)值在0 ～ -2.5,分布均勻,負值越小,表示該氨基酸疏水性越強,且總親水性平均數(shù)為-0.175,脂肪指數(shù)為89.55,該葡萄果實中VvGST1為親水性蛋白。圖5

圖5 VvGST1蛋白的親疏水性

2.6 VvGST1蛋白信號肽預(yù)測

研究表明,木納格葡萄VvGST1沒有明顯的區(qū)段存在信號肽,該序列沒有預(yù)測到信號肽,意味VvGST1不會產(chǎn)生蛋白運轉(zhuǎn)。圖6

圖6 VvGST1蛋白信號肽預(yù)測

2.7 VvGST1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

研究表明,木納格葡萄VvGST1蛋白整條鏈上所有位點均沒有存在跨膜結(jié)構(gòu)的可能性,整個蛋白的所有氨基酸膜外的概率均在0.9以上,存在于細胞基質(zhì)中,說明該蛋白亞單位不含跨膜結(jié)構(gòu)域,是膜外蛋白,為典型的基質(zhì)蛋白。圖7

注:膜外(outside)、膜內(nèi)(inside)和跨膜區(qū)域(transmembrane)

2.8 VvGST1蛋白亞細胞定位預(yù)測

研究表明,由神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測在細胞外的分值為1.0,預(yù)測VvGST1蛋白整體在細胞質(zhì)的分值為8.64,該蛋白可能是多定位的。利用MultiLocDB中進行SBLAST搜索,該蛋白質(zhì)的位置可能在細胞質(zhì)和細胞核中。表1

表1 VvGST1亞細胞定位預(yù)測

2.9 VvGST1蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

研究表明,VvGST1蛋白主要由4種二級結(jié)構(gòu)組成,包括無規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-折疊等,其中α-螺旋是主要的二級結(jié)構(gòu)占51.58%,其次無規(guī)則卷曲占29.84%,延伸鏈占13.75%,β-折疊占4.98%。圖8

注:藍色:α-螺旋;綠色:β-折疊;黃色:無規(guī)則卷曲;紅色:延伸鏈

VvGST1蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型類似山峰型,蛋白三維結(jié)構(gòu)模型與模板的一致性為60.37%,全球性模型質(zhì)量評估(GMQE)值為0.81,越接近1,該蛋白三級結(jié)構(gòu)建模質(zhì)量較好。該蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要是由α-螺旋組成,該蛋白具有穩(wěn)定的結(jié)果。圖9

圖9 VvGST1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討 論

蛋白二級結(jié)構(gòu)是指沿一定方向折疊或盤旋而形成的特定多肽結(jié)構(gòu),包括α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈等[13]?；颐共∈怯苫移咸焰咭鸬囊环N真菌性采后病害,是葡萄采后貯藏期間引起腐爛的主要病原菌之一,引起葡萄漿果采后品質(zhì)的快速下降[14]。開展抗灰霉病相關(guān)基因的挖掘?qū)τ谄咸巡珊蟮钟≡秩揪哂兄匾饔谩ST基因在植物響應(yīng)生物與非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用,并具有一定的耐受能力[15]。GST家族可根據(jù)結(jié)構(gòu)特征和序列的同源性分類分別是Phi、Tua、Lambda、Theta、Zeta、DHAR和TCHQD,其中植物所特有的是Phi和Tua類基因[16]。

試驗從木納格葡萄果實中成功克隆了VvGST1全長序列。該序列為完整的開放閱讀框,保守的編碼長度是719 bp,其氨基酸蛋白編碼長度與山葡萄[17]、荔枝[18]相似。VvGST1與其他物種氨基酸序列多重對比和進化樹系統(tǒng)構(gòu)建可看出,研究克隆的VvGST1基因編碼蛋白與棉花屬GST的親緣關(guān)系最近且屬于Tua類GST基因。不同物種間GST的氨基酸序列在進化過程中是保守的。研究表明,氨基酸保守性越高,就越可能是功能位點,其突變對功能影響就越大[19]。

理化特性分析表明VvGST1共編碼氨基酸221個,包含20種氨基酸,pI 6.32;相對分子質(zhì)量為25.55 kDa。VvGST1蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為39.22,表明該蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定性。分子的親水性是指其有能力形成氫鍵的位點,并且和非極性或其他疏水性溶液對比,親水性分子更易溶解在水里面[20]。VvGST1蛋白是具有穩(wěn)定性的親水性蛋白,該蛋白不能進行膜內(nèi)外運動,不含跨膜結(jié)構(gòu)域,沒有預(yù)測到信號肽。從亞細胞定位可以發(fā)現(xiàn)該蛋白存在細胞質(zhì)中與跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果一致。三級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)通過充分旋轉(zhuǎn)折疊的、并具有生物活性的、能完成生物代謝功能的一個完整球蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)[20]。VvGST1蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)模型主要由α-螺旋組成,其中三級結(jié)構(gòu)模型中GMQE值為0.81,當(dāng)越接近1時建模質(zhì)量越好。VvGST1基因編碼蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定。這與蓖麻克隆GST蛋白三維結(jié)構(gòu)相似,該蛋白可能與蓖麻蛋白具有的功能相似[21]。葡萄VvGST1含有豐富的α-螺旋結(jié)構(gòu),其可能指導(dǎo)VvGST1生物合成能夠響應(yīng)于生物脅迫因子或非生物脅迫因子的誘導(dǎo),參與細胞對外界脅迫的抗性反應(yīng)[5]。蘋果受到輪紋病侵染時VvGST1基因表達上調(diào)表達并克隆了抗蘋果輪紋病相關(guān)的MdGSTU1[9]。在水稻和小麥中分別分離出了參與植物抗病脅迫響應(yīng)的GST相關(guān)基因[22];擬南芥與番茄中的多個GST被證明了能夠?qū)φ婢秩咀龀鲰憫?yīng)提高抗性能力[23]。植物GSTs的表達受到非生物和生物脅迫的激活。

4 結(jié) 論

在木納格葡萄中克隆了1個GST1基因,該基因片段長度為719 bp,具有完整的開放閱讀框。VvGST1基因編碼蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為25.55 kDa;理論等電點為6.32;分子式為C1178H1799N293O321S11;原子總數(shù)3 602;理論推導(dǎo)半衰期為30 h左右;不穩(wěn)定指數(shù)為39.22。VvGST1基因編碼的氨基酸種類及個數(shù)分別為20種和221個。VvGST1蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)構(gòu)建分析主要是由α-螺旋組成,該蛋白具有十分穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。