黃柳向,何凡應(yīng),李 玲

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007;2. 郴州市中醫(yī)醫(yī)院,湖南 郴州 423000;3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,是在多種復(fù)合因素共同作用下產(chǎn)生的結(jié)果,幽門螺桿菌感染是其最主要的危險因素[1]。該病的發(fā)病機制尚未明確,無法進行準(zhǔn)確的一級預(yù)防,但從正常的胃黏膜向胃癌轉(zhuǎn)變,一般要經(jīng)歷一段長時間的胃癌前病變過程,是慢性胃炎轉(zhuǎn)變?yōu)槲赴┑囊粋€重要中間階段,其病理表現(xiàn)主要包括腸上皮化生和異型增生[2]。 目前逆轉(zhuǎn)癌前病變的治療手段主要有根除幽門螺桿菌、修復(fù)胃黏膜以及對消化不良的對癥治療、內(nèi)鏡下切除胃癌前病變組織等,但效果有限。隨著對中醫(yī)藥研究的深入,發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥可改善胃癌前病變臨床癥狀及逆轉(zhuǎn)胃鏡下組織病理學(xué)變化[3]。黃柳向教授認(rèn)為胃癌前病變的主要病機為脾胃氣虛弱,痰瘀互結(jié),總結(jié)出了益氣活血、健脾化痰的基本治法,臨床上常用莪蠶健胃方(主要由黃芪、莪術(shù)、炒僵蠶、穿山甲、百合、當(dāng)歸、炒枳殼、太子參、雞內(nèi)金等組成)治療胃癌前病變。前期研究發(fā)現(xiàn),莪蠶健胃方不僅可抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,還可削弱缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白和mRNA表達,抑制血管新生,從而逆轉(zhuǎn)胃癌前病變[4-6]。黃芪、莪術(shù)是莪蠶健胃方中的兩味君藥,奠定全方益氣活血的主要功效,且這兩味中藥具有多種抗腫瘤活性成分,可以通過多條通道對胃癌前病變起到治療作用,其中蛋白激酶B(Akt)/叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞族3(FoxO3a)信號通路就是關(guān)鍵的一條。劉世佳[7]研究表明,埃索美拉唑可以通過影響Akt/FoxO3a信號通路來抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖。本研究基于Akt/FoxO3a信號通路探討了黃芪-莪術(shù)藥對逆轉(zhuǎn)胃癌前病變的作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 48只雄性Wistar大鼠,體重100～120 g左右,購于上海市計劃生育科學(xué)研究所實驗動物經(jīng)營部,許可證號:SCXK(滬)2018-0006,飼養(yǎng)于溫度20～26 ℃、濕度40%～70%環(huán)境中,保持晝夜節(jié)律,白晝黑夜各12 h,自由進食飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2實驗藥物 甲基硝基亞硝胍 (MNNG)溶液(貨號:K21171191,阿拉丁);黃芪-莪術(shù)藥對(黃芪飲片30 g、莪術(shù)飲片10 g,批號:200839,湖南省中醫(yī)院研究院),加水浸沒中藥上方2 cm,大火熬制40 min,去渣,將藥液濃縮至0.36 g/mL低溫保存?zhèn)溆?葉酸(批號:210307,福州海王福藥制藥有限公司);鹽酸雷尼替丁(批號:306210801,蘇州弘森藥業(yè)股份有限公司)。

1.3實驗試劑及器材 蘇木素染液(ZLI-9610,中衫金橋);伊紅染色液(G1100,Solarbio);超凈高級封片膠(YZB,BASO);Scott藍化液(G1865,Solarbio);TRIzol Reagent (CW0580S,CWBIO 康為世紀(jì));HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(R223-01,Vazyme 諾唯贊);2×SYBR Green PCR Master Mix(A4004M,Lifeint 生命互聯(lián));Akt1 (10176-2-AP,Proteintech,1/500);FoxO3a(af5128,affinify,1/500);LC3-I/II(af5402,affinify,1/500)。掃描顯微鏡(VS200,OLYMPUS);切片機(2235,Leica);電熱鼓風(fēng)干燥箱(HGZF-101-1,上海躍進醫(yī)療器械有限公司);微型離心機(D1008E,SCJLOGEX);旋渦混合器(XH-C,常州越新儀器制造有限公司);干式電加熱器(GL-150,海門市其林貝爾儀器制造有限公司);低溫高速離心機(5424R,Eppendorf);熒光PCR儀[CFX ConnectTM實時,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司];低溫高速離心機(5424R,Eppendorf);全自動樣品快速研磨儀(Tiss-12,上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)。

1.4實驗方法 隨機選擇12只大鼠作為正常組,正常飼養(yǎng);其余大鼠采用MNNG聯(lián)合饑飽失常情緒激惹飼養(yǎng)[8]建立胃癌前病變模型:用避光的MNNG(100 μg/mL)作為大鼠的飲用水,從造模第4周末開始,對大鼠采用單日禁食、雙日足量進食方法飼養(yǎng),并每天給予雷尼替丁溶液灌胃,在造模期間每周二、周五灌喂2次40%乙醇水溶液,每次1 mL,持續(xù)16周,在16周末、20周末隨機從抽選3只大鼠,麻醉后剖腹取胃,從胃體、胃竇處取材進行HE染色,鏡下觀察胃黏膜是否出現(xiàn)腸上皮化生、異型增生,確認(rèn)造模是否成功。將造模成功的大鼠隨機分為模型組、黃芪-莪術(shù)組、葉酸組,每組10只,均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。正常組和模型組給予蒸餾水灌胃,黃芪-莪術(shù)組給予黃芪-莪術(shù)水煎濃縮液3.6 g/kg灌胃,葉酸組給予葉酸1.8 mg/kg灌胃, 均1次/d,連續(xù)灌胃10周。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1大鼠一般狀況 詳細(xì)記錄觀察前期造模和后期干預(yù)過程中各組的體重、毛發(fā)、活動度、精神狀態(tài)、飲食狀況等。

1.5.2胃組織病理形態(tài) 灌胃結(jié)束后,每組取6只大鼠麻醉處死,取一半胃組織,先將組織在流水下沖洗數(shù)小時,然后再以70%,80%,90%濃度的乙醇溶液對組織依次脫水,再將組織放入純酒精、二甲苯各半混合液15 min,二甲苯Ⅰ溶液15 min、二甲苯Ⅱ溶液15 min(直到透明為止)。放入二甲苯和石蠟等量的混合液15min,石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ進行透蠟各50～60 min。然后將石蠟包埋,切片。石蠟切片完成后進行烤片、脫蠟、水化,用蘇木精水溶液染色3 min,鹽酸乙醇分化液分化15 s,稍加水洗,返藍15 s,流水沖洗,伊紅染色3 min,水洗,脫水,透明,封片,送鏡檢。

1.5.3胃組織中Akt1、FoxO3a、Beclin1、LC3-Ⅱ、p62 mRNA表達情況 取胃組織,加入TRIzol裂解液制備勻漿液,提取總RNA,加入38 μL RNase Free H2O(4 ℃預(yù)冷),冰盒上靜置3～5 min,充分溶解RNA,于4 ℃下12 000 r/min離心1 min;將流出液再吸出,懸空打在吸附柱膜上,冰盒上靜置3～5 min,于4 ℃下12 000 r/min離心1 min,將得到的RNA液保存在-80 ℃冰箱中,防止降解;利用紫外可見分光光度計測定RNA的濃度和純度(OD260/OD280)。將mRNA通過mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,利用熒光PCR儀進行熒光定量PCR。反應(yīng)體系:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、RNase Free ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)步驟:預(yù)變性95 ℃,10 min;變性95 ℃,10 s;退火58 ℃,30 s;延伸72 ℃,30 s;40個循環(huán)。引物序列見表1,GAPDH作為內(nèi)參,根據(jù)2-△△CT法計算相對表達量。

表1 Akt1、FoxO3a、Beclin1、LC3-Ⅱ、p62引物序列

1.5.4胃組織中Akt1、FoxO3a、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表達情況 采用Western blot法檢測:用液氮研磨儀對組織樣本進行研磨,收集組織懸液,根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性,上樣,進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)2 h,用300 mA恒流轉(zhuǎn)膜80 min。一抗溶液4 ℃孵育過夜,二抗溶液中室溫孵育2 h。在膜上滴加ECL發(fā)光液,在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況 正常組大鼠精神可,動作活動迅速,皮毛光澤,食量可,顆粒狀大便,肛門比較干凈,體重隨著喂養(yǎng)時間的延長逐漸增加,未出現(xiàn)死亡。造模期間,模型組大鼠精神變差,動作行動遲鈍,容易激惹,形體較瘦小,皮毛光澤度下降,容易脫毛,食量減少,大便呈糊狀,肛門污穢,體重增加緩慢,有的甚至下降。葉酸組、黃芪-莪術(shù)組藥物干預(yù)后,大鼠大便、精神、活力、食量相比模型組均有改善。實驗結(jié)束前,模型組死亡2只,黃芪-莪術(shù)組、葉酸組各死亡1只。

2.2各組大鼠胃組織病理形態(tài) 正常組大鼠胃黏膜各層結(jié)構(gòu)正常,固有層胃腺細(xì)胞排列整齊緊密、形態(tài)正常,未見出血、炎癥細(xì)胞浸潤等病變。模型組大鼠胃黏膜可見空腔融合,胃腺空泡化不規(guī)則,可見腺體增大,腺體間細(xì)胞增生,組織有少量炎癥細(xì)胞浸潤。黃芪-莪術(shù)組和葉酸組大鼠胃黏膜各層結(jié)構(gòu)較為正常,偶見胃黏膜空腔融合,腺體細(xì)胞排列較為整齊緊密,組織未見出血、炎癥細(xì)胞浸潤等明顯病變。見圖1。

圖1 正常組和胃癌前病變各組大鼠胃組織HE染色病理形態(tài)(×300)

2.3各組大鼠胃組織中Akt1、FoxO3a、Beclin1、LC3-Ⅱ、p62 mRNA表達情況 與正常組比較,模型組Akt1、p62 mRNA相對表達量均明顯升高(P均<0.05),FoxO3a、Beclin1、LC3-ⅡmRNA相對表達量均明顯降低(P均<0.05);與模型組比較,黃芪-莪術(shù)組和葉酸組Akt1、p62 mRNA相對表達量均明顯降低(P均<0.05),FoxO3a、Beclin1、LC3-ⅡmRNA相對表達量均明顯升高(P均<0.05)。見表2。

表2 正常組和胃癌前病變各組大鼠胃組織中Akt1、FoxO3a、Beclin1、LC3-Ⅱ、p62 mRNA相對表達量比較

2.4各組大鼠胃組織中Akt1、FoxO3a、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表達情況 與正常組比較,模型組Akt1、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05),FoxO3a蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,黃芪-莪術(shù)組和葉酸組Akt1、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),FoxO3a蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05)。見圖2及表3。

圖2 正常組和胃癌前病變各組大鼠胃組織中Akt1、FoxO3a、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表達灰度圖

表3 正常組和胃癌前病變各組大鼠胃組織中Akt1、FoxO3a、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白相對表達量比較

3 討 論

胃癌前病變是一個現(xiàn)代病理學(xué)概念,我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)并無胃癌前病變病名,而是根據(jù)其癥狀將其歸于“胃痞”“胃痛”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為其病因主要有外邪犯胃、飲食饑飽失常、情志不暢、素體脾胃虛弱、藥物損傷脾胃等因素,在臨床常以本虛標(biāo)實、虛實夾雜之證呈現(xiàn)。脾虛、氣滯是該病基本病機,血瘀是該病的重要病機,在胃黏膜萎縮的發(fā)生發(fā)展甚至惡變中起關(guān)鍵作用[9]?？傊?脾胃虛弱、胃絡(luò)瘀血幾乎貫穿胃癌前病變的始終。胃癌的發(fā)生遵循著正常胃黏膜→慢性淺表性胃炎→慢性萎縮性胃炎→腸上皮化生→非典型增生→原位癌→浸潤癌的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。

黃芪-莪術(shù)是一個經(jīng)典的藥對,黃芪味甘性微溫,長于補氣升陽,善補脾、肺之氣,為補中益氣之要藥;莪術(shù)性辛苦溫,具有破血行氣、消積止痛之功。黃芪-莪術(shù)相配伍,一方面補脾胃之氣以養(yǎng)后天之本,脾胃之氣充則血行自暢,氣旺則助莪術(shù)破血散瘀;另一方面黃芪甘緩之性可防莪術(shù)峻烈之性破血傷正。二者相互配合,補瀉同施,動靜結(jié)合。黃芪的主要藥理成分包括多糖類、黃酮類和皂苷類,黃芪中的黃芪多糖和黃酮類具有抗腫瘤作用[10]。黃芪提取的活性成分可通過介導(dǎo)VEGF/MMP信號通路來抵抗血管的生成而起到抗腫瘤作用,還可以通過PI3K/Akt/mTOR信號通路起到抗腫瘤作用[11]。莪術(shù)根莖成分包括姜黃素類、揮發(fā)油以及酚酸類等物質(zhì)[12],這些有效成分可以影響調(diào)節(jié)多條信號通路,起到抗炎、抑制細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫、促凋亡等作用[13]。

Akt/FoxO3a信號通路是PI3K/Akt信號通路的一條下游信號通路,參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、自噬等過程。Akt有3種亞型,分別是Akt 1、Akt 2、和Akt 3,Akt 1的Ser473位點被Mtorc2磷酸化后,Akt酶活性也被完全激活,從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用,Akt可抑制促凋亡信號來調(diào)節(jié)存活周期,如Bad和FoxO轉(zhuǎn)錄因子。FoxO蛋白通過其獨特的DNA結(jié)合域影響靶基因的轉(zhuǎn)錄,并受到了幾種翻譯后修飾調(diào)節(jié),比如磷酸化、乙?；头核鼗?34)[14]。FoxO激活靶基因的轉(zhuǎn)錄,促進細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞死亡和細(xì)胞氧化應(yīng)激,以維持代謝穩(wěn)定。Akt可使FoxO轉(zhuǎn)錄因子磷酸化并失活,導(dǎo)致它們在細(xì)胞質(zhì)中的核排斥和降解,從而觸發(fā)細(xì)胞的異常存活,Akt還可下調(diào) UVRAG 基因的表達起到抑制細(xì)胞自噬的目的[15]。

FoxO轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程,影響發(fā)育、新陳代謝、干細(xì)胞維持和壽命,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡、血管的生成、細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等,故被認(rèn)為是腫瘤抑制因子。FoxO表達和功能的不足可能會促進遺傳疾病、代謝性疾病、放松調(diào)控的衰老和癌癥的發(fā)生[16]。FoxO3a是FoxO叉頭轉(zhuǎn)錄因子亞家族的成員,參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等多種細(xì)胞過程,影響細(xì)胞的周期,與DNA損傷和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。在紫外線照射和氧化應(yīng)激下,它可能會產(chǎn)生幾種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[17]。FoxO3a與乳腺癌、肝癌、膀胱癌、鼻咽癌等多種癌癥相關(guān),其在癌癥中起著腫瘤抑制因子的作用,其高表達能夠抑制癌細(xì)胞的增殖、致瘤潛能和侵襲力[18]。

細(xì)胞自噬是維持體內(nèi)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種生物過程,Beclin1是一種重要的自噬調(diào)節(jié)因子,是酵母菌中 Atg6/VPS30 的同源物,能夠參與自噬體膜的早期形成[18],此外還能參與自噬體的成熟。Beclin1與許多生物學(xué)過程如細(xì)胞分裂、腫瘤發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞衰老死亡等有關(guān)[18],其高表達可作為體內(nèi)自噬活躍的標(biāo)志。相關(guān)研究表明,腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移的一個重要原因就是體內(nèi)自噬系統(tǒng)的失常,Beclin1能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡,從而產(chǎn)生一定的抑瘤效應(yīng)[19]。LC3也是哺乳動物中一種常見的自噬標(biāo)志物,在細(xì)胞中常以LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ 兩種形式存在,當(dāng)體內(nèi)自噬尚未發(fā)生時,LC3-Ⅰ在細(xì)胞內(nèi)合成,自噬發(fā)生以后,LC3-Ⅰ經(jīng)泛素化加工修飾后,與磷脂質(zhì)PE形成LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ的表達越高,表明體內(nèi)自噬越活躍[20]。楊勇明等[21]研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中LC3陽性表達量明顯低于癌旁組織。p62是一種中介蛋白,在多種細(xì)胞和組織中都有表達,能夠參與多種信號的傳導(dǎo)。p62可連接LC3和泛素化的底物,之后被整合到自噬體,隨之被自噬溶酶體降解[22]。當(dāng)自噬被激活時,自噬體與溶酶體融合,自噬體中的p62等蛋白或細(xì)胞器能夠被溶酶體酶所降解,p62表達減少;當(dāng)自噬被抑制時,自噬體積累,p62表達增加。

葉酸是生物合成體內(nèi)核酸的必要物質(zhì),體內(nèi)葉酸不足可以引起DNA甲基化異常和染色體斷裂,從而增加癌變的風(fēng)險。朱舜時等[23]發(fā)現(xiàn)補充葉酸后能增強體內(nèi)基因的穩(wěn)定性,抑制異常增殖,讓萎縮的胃黏膜、腸上皮化生和異型增生不繼續(xù)向胃癌轉(zhuǎn)變,是臨床中一種常用的胃癌二級預(yù)防藥物。本研究以該藥為對照,觀察了黃芪-莪術(shù)藥對逆轉(zhuǎn)胃癌前病變的作用及機制,結(jié)果顯示黃芪-莪術(shù)藥對可以改善胃癌前病變大鼠的一般情況和胃黏膜病理改變,可明顯下調(diào)Akt1、p62 mRNA表達和Akt1、LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白表達,上調(diào)FoxO3a、Beclin1、LC3-ⅡmRNA表達和FoxO3a蛋白表達。提示黃芪-莪術(shù)藥對可能通過影響Akt/FoxO3a信號通路、激活增強體內(nèi)自噬而對胃癌前病變起到一定程度的逆轉(zhuǎn)作用。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。