詹明峰 張文娟 孫士芳 尚佩生 沈曉峰

[摘要]目的：探討長鏈非編碼RNA 8975-1（Long non-coding RNA 8975-1，LNCRNA8975-1）通過微小RNA-203（microRNA-203，miR-203）/血管內皮生長因子-A（Vascular endothelial growth factor-A， VEGF-A）信號軸對人瘢痕疙瘩成纖維細胞（Human keloid fibroblast， HKF）的細胞增殖周期和遷移的影響及其機制。方法：培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞（Human skin fibroblasts，HSF）和HKF，采用定量PCR（quantitative polymerase chain reaction， qPCR）及western blot法檢測LNCRNA8975-1、miR-203和I型膠原蛋白（Type I collagen， Col-I）的表達量。將HKF細胞分為Control組、小干擾RNA載體的陰性對照（the negative control for small interfering RNA vector， siNC）組、沉默LNCRNA8975-1的小干擾RNA載體（the small interfering RNA vector for silence of LNCRNA8975-1， siLNCRNA8975-1）組、pcDNA3.1空載體（the empty pcDNA3.1 vector， pcDNA）組、過表達LNCRNA8975-1的pcDNA3.1載體（overexpression of LNCRNA8975-1 in the pcDNA3.1 vector， pcDNA-LNCRNA8975-1）組、miR-203擬似物的陰性對照（the negative control of miR-203 mimic，NC mimic）組、miR-203的擬似物（miR-203 mimic）組、miR-203抑制劑的陰性對照（negative control of miR-203 inhibitor，NC inhibitor）組、miR-203的抑制劑（miR-203 inhibitor）組、siLNCRNA8975-1+miR-203 inhibitor組、VEGF-A+miR-203 mimic組。CCK-8法檢測細胞增殖活性，免疫熒光檢測細胞周期標志物細胞周期蛋白D1（cyclin D1），傷口愈合實驗和Transwell實驗檢測細胞遷移功能。熒光素酶基因報告實驗檢測HKF細胞中LNCRNA8975-1和miR-203、miR-203和VEGF-A的直接作用。結果：與HSF相比，HKF中LNCRNA8975-1和Col-I表達量上調（P＜0.05），而miR-203降低（P＜0.05）。與siNC相比，siLNCRNA8975-1抑制了HKF細胞周期蛋白cyclin D1表達和細胞的遷移（P＜0.05）。與NC mimic相比，miR-203 mimic抑制了HKF中cyclin D1蛋白表達和細胞的遷移（P＜0.05）。LNCRNA8975-1充當miR-203的“分子海綿”靶向抑制miR-203，且VEGF-A是miR-203的靶基因。VEGF-A表達被miR-203 mimic抑制（P＜0.05）。miR-203 inhibitor充分逆轉了siLNCRNA8975-1對HKF中cyclin D1表達和遷移的抑制作用（P＜0.05），而且VEGF-A則逆轉了miR-203 mimic對HKF中cyclin D1表達和遷移的抑制功能（P＜0.05）。結論：LNCRNA8975-1通過抑制miR-203上調VEGF-A調控HKF的周期和遷移。

[關鍵詞]長鏈非編碼RNA 8975-1；微小RNA-203；血管內皮生長因子-A；瘢痕疙瘩；成纖維細胞；細胞周期；遷移

[中圖分類號]R619+.6? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）08-0035-06

Effect of LNCRNA8975-1 on Proliferation Cycle and Migration of Keloid Fibroblasts and Its Mechanism

ZHAN Mingfeng，ZHANG Wenjuan，SUN Shifang，SHANG Peisheng，SHEN Xiaofeng

（Department of Dermatology，the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，Xinjiang，China）

Abstract： Objective? To study the effect of long non-coding RNA 8975-1 （LNRNA8975-1） on cell proliferation cycle and migration of keloid fibroblasts and to explore the mechanism. Methods? Human skin fibroblasts （HSF） and keloid fibroblasts （HKF） were cultured. The expression levels of LNCRNA8975-1， miR-203 and Col-I were detected by qPCR and western blot. HKF cells were divided into Control group， siNC group， siLNCRNA8975-1 group， pcDNA group， pcDNA-LNCRNA8975-1 group， NC mimic group， miR-203 mimic group， NC inhibitor group， miR-203 inhibitor group， siLNCRNA8975-1+miR-203 inhibitor group， VEGF-A+miR-203 mimic group. Cell proliferation activity was detected by CCK-8 assay， cell cycle marker cyclin D1 was detected by immunofluorescence， and cell migration function was detected by wound healing assay and Transwell assay. Luciferase gene reporter assay detected the direct effects of LNCRNA8975-1 and miR-203， miR-203 and VEGF-A in HKF cells. Results? Compared with HSF， the expressions of LNCRNA8975-1 and Col-I in HKF were up-regulated （both P＜0.05）， while miR-203 was down-regulated （P＜0.05）. Compared with siNC， siLNCRNA8975-1 inhibited the expression of HKF cyclin D1 and cell migration （all P＜0.05）. Compared with NC mimic， miR-203 mimic inhibited cyclin D1 protein expression and cell migration in HKF （P＜0.05）. LNRNA8975-1 acts as a "molecular sponge" for miR-203 to target inhibition of miR-203， and VEGF-A is a target gene of miR-203. VEGF-A expression was inhibited by miR-203 mimic （P＜0.05）. miR-203 inhibitor fully reversed the inhibitory effect of siLNCRNA8975-1 on the expression and migration of cyclin D1 in HKF （P＜0.05）， and VEGF-A reversed the inhibitory effect of miR-203 mimic on the expression and migration of cyclin D1 in HKF （P＜0.05）. Conclusion? LNRNA8975-1 regulates the cycle and migration of keloid fibroblasts by inhibiting miR-203 and up-regulating VEGF-A.

Key words： long non-coding RNA 8975-1; microRNA-203; vascular endothelial growth factor-A; keloid fibroblasts; cell cycle; migration

過度瘢痕形成可進展為瘢痕疙瘩[1-2]，這與人瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長、細胞周期進程和細胞遷移的調控密切相關，但其內在機制并不清楚[3]。lncRNA可通過“分子海綿”作用吸附微小RNA，進一步通過調控靶mRNA的表達從而調控細胞的增殖、周期進程、細胞的遷移和侵襲等[4-7]。最近研究表明LNCRNA8975-1在瘢痕疙瘩中明顯高表達[8]，但其在瘢痕疙瘩中的作用不清楚。經預測發(fā)現(xiàn)miR-203[9]是LNCRNA8975-1潛在靶基因，而VEGF-A則是miR-203在腫瘤細胞中的靶基因[10]。然而，LNCRNA8975-1調控的miR-203/VEGF-A網絡是否介導HKF的細胞周期蛋白D1（cyclin D1）表達和細胞遷移等并不清楚。本研究旨在探討長鏈非編碼RNA8975-1通過微小RNA-203/血管內皮生長因子-A信號軸對人瘢痕疙瘩成纖維細胞的細胞增殖周期和遷移的影響及其機制，現(xiàn)報道如下。

1? 材料和方法

1.1 試劑和耗材：HSF和HKF購自購于武漢普諾賽生命科技有限公司。人重組VEGF-A蛋白（VEGF-A）購于英國Abcam公司。沉默LNCRNA8975-1的陰性對照（si-NC）、沉默LNCRNA8975-1的小干擾RNA載體（siLNCRNA8975-1）、pcDNA3.1空載體（pcDNA）、pcDNA3.1-LNCRNA8975-1過表達載體（pcDNA-LNCRNA8975-1）、miR-203擬似物（mimic）的陰性對照（NC）（NC mimic）、miR-203 mimic、miR-203抑制劑（inhibitor）的陰性對照（NC）（NC inhibitor）、miR-203 inhibitor、pGL3-LNCRNA8975-1-WT載體以及pGL3-LNCRNA8975-1-Mut載體都構建于上海吉瑪公司。I型膠原蛋白（Type I collagen， Col-I）的一抗（ab6308）購于英國Abcam公司，VEGF-A（12534）、磷酸化（p-）VEGF-A（9516）、cyclin D1、磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（5174）購于美國Cell Signaling Technology公司。AlexaFluor594偶聯(lián)的山羊抗兔二抗購于美國ThermoFisher公司。二脒基苯基吲哚（Diaminidine phenyl indole，DAPI）購于美國VectorLaboratory公司。

1.2 細胞培養(yǎng)：HSF和HKF在補充有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的杜氏改良培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）中培養(yǎng)。在37℃下，細胞在含有95%空氣和5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 d換液1次。將匯合率達到70%的對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 HKF細胞的瞬時轉染和分組處理：siNC組、siLNCRNA8975-1組、pcDNA組、pcDNA-LNCRNA8975-1組、0 NC mimic組、miR-203 mimic組、NC inhibitor組、miR-203 inhibitor組的細胞的處理方法如下，當HKF細胞生長到70%匯合率時，聯(lián)合Lipofectamine 2 000分別加入10 nmol/L siNC、siLNCRNA8975-1、pcDNA、pcDNA-LNCRNA8975-1，0.8μmol/L的NC mimic、miR-203 mimic、NC inhibitor、miR-203 inhibitor，并在37℃下孵育24 h。而siLNCRNA8975-1+miR-203 inhibitor組為聯(lián)合Lipofectamine 2 000共同加入10 nmol/L siLNCRNA8975-1和0.8μmol/L miR-203 inhibitor，并在37℃下孵育24 h。而VEGF-A+miR-203 inhibitor組為聯(lián)合Lipofectamine 2 000共同加入10 nmol/L人重組VEGF-A蛋白和0.8 μmol/L miR-203 inhibitor，并在37℃下孵育24 h。Control組細胞不進行任何處理。收集細胞用于后續(xù)檢測。

1.4 qPCR：收集各組細胞超聲裂解后，根據(jù)制造商的方案，將細胞轉移到含有Trizol的試管中，分離總RNA。用DNase I處理1μg總RNA，根據(jù)生產上說明進行逆轉錄。并根據(jù)制造商的說明，使用SYBR? Green PCR進行qPCR分析。在96孔光學反應板中進行40個循環(huán)進行PCR擴增，1個循環(huán)中94°C 30 s、58～63°C 30 s、72°C 60 s。對于mRNA用GAPDH作內參基因。獲得相對于Control組數(shù)值的倍數(shù)變化。使用以下引物：GAPDH（內參）正向引物5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，反向引物5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'；LNCRNA8975-1正向引物5'-CGGCTAACAAGGAGATTTGG-3'，反向引物5'-AGGCTCAGGGATGGTAGTCC-3'；miR-203正向引物5'-TAAGGCACGCGGTGAATGCC-3'，反向引物5'-GATTGAATCGAGCACCAGTTAC-3'；VEGF-A正向引物5'-TTTCGCTAGCCAACTTTT-3'，反向引物5'-TATCTGTTTTCAATGTAAGCTC-3'。使用2-ΔΔCT方法分別計算lncRNA和miRNA的靶基因對GAPDH（內參蛋白）和U6（內參蛋白）的相對表達。

1.5 蛋白免疫印跡（Western blot）：在SDS-PAGE凝膠上分離來自不同樣品的等量總蛋白，并用針對Col-I（1∶500）、VEGF-A（1∶1 000）、p-VEGF-A（1∶1 000）或GAPDH（1∶5 000）在4°C孵育過夜，然后用HRP偶聯(lián)的抗小鼠二抗（1∶5 000）在室溫下孵育2 h。用增強的化學發(fā)光試劑顯色，并使用Image J軟件進行分析。

1.6 CCK-8：根據(jù)生產商提供的說明，于96孔板內處理各組細胞持續(xù)24 h、48 h、72 h，隨后去除96孔培養(yǎng)板內培養(yǎng)液，每孔避光加入100μl含10% CCK-8溶液的DMEM完全培養(yǎng)液，37 ℃孵育4 h后終止培養(yǎng)，搖床室溫振蕩5 min。在酶標儀上測定450 nm處吸光度值。實驗重復3次，取3次實驗的均值作為實驗結果。

1.7 cyclin D1的免疫熒光染色：將細胞固定在4%多聚甲醛中，用0.3% TritonX-100滲透，并用PBS中的1% BSA封閉。與抗cyclin D1抗體（1∶500）在4°C孵育過夜后，細胞用AlexaFluor594綴合的山羊抗兔二抗（1∶250）染色，并用DAPI染色液染細胞核15 min。使用熒光顯微鏡（Olympus，Tokyo，Japan）捕獲圖像。

1.8 傷口愈合實驗：將細胞（5×104）接種在96孔板中并孵育過夜，以使細胞黏附并生長至匯合層。然后用無菌移液器尖端在細胞單層上劃一個1 mm寬的劃痕。0 h、24 h和48 h分別對劃痕的相同位置進行拍照。使用ImagePro-Plus軟件（Media Cybernetics，Rockville，MD）計算0 h、24 h和48 h時間間隔的劃痕/傷口寬度。

1.9 Transwell遷移實驗：細胞以1 × 105個細胞/孔接種在24孔板中的未包被基質膠Transwell過濾器上。當細胞遷移通過未涂覆的過濾器時，應用三步法（Richard-Allan Scientific）對細胞進行染色。將遷移細胞的數(shù)量量化為相對于對照的倍數(shù)變化。

1.10 熒光素酶報告基因檢測：在24孔板上培養(yǎng)細胞，然后用pGL3-LNCRNA8975-1載體或pGL3-LNCRNA8975-1-Mut載體以及miR-203-mimic或NC-mimic轉染。此外，建立了含有miR-203結合位點的野生型VEGF-A（WT）和突變型VEGF-A（Mut），并將這些載體與miR-203-mimic或NC-mimic共轉染。48 h后，收獲細胞。根據(jù)制造商的說明，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System（美國普洛麥格）進行熒光素酶報告基因測定以檢測熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 22.0軟件進行分析，并以3個獨立實驗的均數(shù)±標準差（x?±s）表示，每個實驗的每個條件設置3個復孔。組間比較采用t檢驗，三組及三組以上比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

2.1 人瘢痕成纖維細胞中LNCRNA8975-1、miR-203、Col-I的表達：觀察LNCRNA8975-1、miR-203和Col-I的表達模式。qRT-PCR和蛋白免疫印跡分析顯示與HSF相比，LNCRNA8975-1和Col-I在HKF中顯著上調，但miR-203反而下調，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 敲低LNCRNA8975-1抑制了HKF細胞的cyclin D1表達和遷移：用siLNCRNA8975-1轉染HKF以沉默LNCRNA8975-1的表達，數(shù)據(jù)顯示，在用siLNCRNA8975-1轉染的細胞中LNCRNA8975-1的表達被顯著抑制（見圖2A）。此外，轉染后48 h還觀察了HKF的形態(tài)。穩(wěn)定沉默LNCRNA8975-1的HKF顯示出細胞形態(tài)的顯著變化，從排列良好的簇狀細胞轉變?yōu)椴灰?guī)則的非極化細胞（見圖2B）。此外，CCK-8和cyclin D1的免疫熒光染色確定LNCRNA8975-1的敲低顯著降低了細胞增殖能力和細胞周期蛋白表達（見圖2C～D）。傷口愈合和Transwell測定還表明敲低LNCRNA8975-1導致細胞遷移受到抑制（見圖2E～F）。

2.3 miR-203是LNCRNA8975-1的靶標：細胞中LNCRNA8975-1和miR-203的表達呈負相關。為進一步證明LNCRNA8975-1和miR-203在瘢痕疙瘩形成中的關系，本研究檢測了過表達LNCRNA8975-1的HKF或沉默LNCRNA8975-1的HKF中miR-203表達的改變。結果證實了LNCRNA8975-1對miR-203表達的負調節(jié)（見圖3A）。此外，通過生物信息學分析還確定了LNCRNA8975-1和miR-203之間的互補結合位點（見圖3B）。熒光素酶報告基因結果發(fā)現(xiàn)miR-203-mimic可特異性抑制由WT-LNCRNA8975-1序列驅動的熒光素酶報告基因活性，而不是由Mut-LNCRNA8975-1序列（見圖3C）。

2.4 miR-203逆轉LNCRNA8975-1在HKF中的調節(jié)功能：LNCRNA8975-1敲低顯著上調了miR-203，而miR-203-inhibitor顯著逆轉了這種作用。功能實驗表明，LNCRNA8975-1的敲低導致細胞cyclin D1蛋白表達和遷移率的抑制。然而，這些調節(jié)功能明顯被miR-203-inhibitor所阻斷。見圖4。

2.5 VEGF-A是miR-203的生物學功能性靶基因：生物信息學分析發(fā)現(xiàn)VEGF-A的3'-非翻譯區(qū)（UTR）含有潛在的miR-203結合位點（見圖5A）。為了分析VEGF-A是否是miR-203的直接靶標，本研究在VEGF-A基因的3'-UTR內構建突變，將WT或MUT-VEGF-A序列克隆到熒光素酶報告基因的構建載體中，并將??熒光素酶構建的載體與miR-203-mimic或NC-mimic轉染進入HKF細胞。miR-203-mimic特異性抑制由WT驅動的熒光素酶活性，但不抑制MUT-VEGF-A 3'-UTR的熒光素酶活性（見圖5B）。qRT-PCR和蛋白免疫印跡分析進一步確認發(fā)現(xiàn)，抑制miR-203會增加VEGF-A的表達，而過表達miR-203會降低VEGF-A的水平（見圖5C～D）。功能研究發(fā)現(xiàn)miR-203-mimic+VEGF-A組HKF細胞的細胞增殖、cyclin D1表達和遷移率顯著高于miR-203-mimic組（見圖5E～G）。

3? 討論

盡管LNCRNA8975-1在瘢痕疙瘩中被發(fā)現(xiàn)表達上調[8]，但對其在瘢痕疙瘩形成的機制知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)沉默HKF中LNCRNA8975-1抑制HKF細胞Col-I、周期蛋白cyclin D1、VEGF-A的表達，并抑制細胞的遷移；而miR-203 mimic抑制了HKF中Col-I、cyclin D1、VEGF-A蛋白表達和細胞的遷移。抑制miR-203能逆轉LNCRNA8975-1沉默對HKF中cyclin D1表達和遷移的抑制作用，而用重組VEGF-A蛋白刺激HKF后逆轉了miR-203 mimic對HKF細胞Col-I和cyclin D1表達、細胞遷移的抑制功能。表明LNCRNA8975-1可通過吸附miR-203從而增加VEGF-A表達促進HKF的周期進展和遷移。

細胞外基質成分Col-I在瘢痕疙瘩形成中發(fā)揮關鍵作用[11，13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)LNCRNA8975-1是刺激HKF中Col-I合成的新信號。與HSF細胞相比，HKF細胞中LNCRNA8975-1和Col-I都上調。而且沉默HKF中的LNCRNA8975-1可以顯著抑制Col-I的表達。表明LNCRNA8975-1調控HKF中Col-I的合成。

研究顯示LNCRNA8975-1在瘢痕疙瘩中表達上調[8]，并通過抑制靶基因Smad3促進皮膚成纖維細胞膠原合成[15]。與之類似，本研究發(fā)現(xiàn)，在HKF中LNCRNA8975-1表達上調，與此同時Col-I的表達上調。另外，LNCRNA8975-1對于維持HKF的活力、增殖、細胞周期、遷移至關重要，因為在HKF中下調LNCRNA8975-1會顯著降低上述功能和表型。以往的研究還表明LNCRNA8975-1對瘢痕成纖維細胞發(fā)揮作用的多種機制。最常見的是，LNCRNA8975-1通過海綿miRNA發(fā)揮作用，例如LNCRNA8975-1可以通過吸附miR-21從而抑制瘢痕成纖維細胞的增殖[16]。本研究同樣觀察到LNCRNA8975-1通過“分子海綿”吸附miR-203從而上調VEGF-A促進HKF的遷移和細胞周期蛋白表達。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-203是HKF中LNCRNA8975-1的直接靶標，其證據(jù)是miR-203與LNCRNA8975-1的表達在HKF與HSF中的趨勢相反，且熒光素酶報告基因測定證實miR-203 mimic可以抑制LNCRNA8975-1野生型報告載體結合的熒光素酶活性，進一步分析發(fā)現(xiàn)，敲低HKF中的LNCRNA8975-1提高了內源性miR-203水平。功能回復證實siLNCRNA8975-1在HKF中誘導的表型，包括細胞增殖周期和遷移功能和VEGF-A及Col-I等表型的表達降低，均被miR-203-inhibitor顯著恢復。類似的是，VEGF-A也可以顯著恢復miR-203 mimic對增殖周期和遷移功能和表型的抑制作用，熒光素酶基因報告試驗還證實VEGF-A是miR-203的靶基因。在頜面部傷口愈合的研究中已發(fā)現(xiàn)VEGF-A是miR-203的靶基因[17]，另外，miR-203抑制VEGF-A從而抑制肝癌的遷移和血管生成[10]，這與本研究結果類似。因此，miR-203/VEGF-A軸是LNCRNA8975-1誘導的瘢痕疙瘩表型的下游靶點。

本研究存在如下不足，如LNCRNA8975-1在瘢痕疙瘩組織中的表達以及與miR-203和VEGF-A的相關性。后續(xù)研究需尋找LNCRNA8975-1在HKF中吸附的其他潛在miRNA，并描述這些靶標是否以及如何有助于HKF細胞中的LNCRNA8975-1功能。同樣，還應對瘢痕疙瘩形成過程中miR-203的其他潛在靶點的特征和功能進行綜合分析。

總之，LNCRNA8975-1/miR-203/VEGF-A軸是調節(jié)HKF細胞周期、細胞遷移、Col-I合成的新機制，表明抑制LNCRNA8975-1或增強miR-203表達可能為預防和治療瘢痕疙瘩提供新的選擇。

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[收稿日期]2022-09-07

本文引用格式：詹明峰，張文娟，孫士芳，等.LNCRNA8975-1對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖周期和遷移的影響及其機制[J].中國美容醫(yī)學，2023，32（8）：35-40.