黃元昊， 彭英杰， 舒志恒， 張俊豪， 周慶雯， 王 剛 ， 蘭時(shí)樂

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.湖南華君農(nóng)業(yè)科技有限公司，湖南桃江 413000）

竹筍是我國南方地區(qū)很常見的一種天然的蔬菜食品，由于其蛋白質(zhì)、鉀、碳水化合物、膳食纖維、 維生素和活性物質(zhì)含量高 （Debangana 等，2012）以及低脂肪與糖類（Duarte 等，2019）而深受人們喜愛。 然而由于新鮮的竹筍易于腐敗， 保鮮極其困難，每年有將近60%的新鮮竹筍被加工制作成筍干和罐頭食品（賈燕芳，2011）。竹筍加工廢棄物（BSPW）是竹筍加工過程中的副產(chǎn)品，主要包括竹筍殼、筍頭和筍渣三部分（Luo 等，2017），目前對于竹筍加工廢棄物的開發(fā)應(yīng)用較少， 處理方法主要是直接丟棄于山間路旁， 造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)（王音，2014）。 事實(shí)上，竹筍加工廢棄物跟竹筍本身一樣， 含有大量的膳食纖維和優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)（Chongtham 等，2011）。 研究表明， 竹筍加工廢棄物的蛋白質(zhì)含量為131.4 g/kg、糖115.3 g/kg、纖維素235.4 g/kg（齊永玲，2013），是制作動(dòng)物飼料的優(yōu)良原料， 相較于其他粗纖維的動(dòng)物飼料如稻草和麥稈，粗蛋白質(zhì)含量更高（王音，2014）。然而由于含有大量的筍殼和筍兜，纖維素含量過高而導(dǎo)致消化率降低。 纖維素是飼料中的一種主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子， 其質(zhì)地堅(jiān)硬、 適口性差，動(dòng)物食用后不易消化，且廣泛分布于植物的莖葉中 （畢于運(yùn)，2010）。 飼料中若纖維素含量過高，不但會(huì)使飼料的消化率大幅下降，還會(huì)導(dǎo)致牲畜出現(xiàn)消化道疾病、便秘等癥狀（Li 等，2017）。 纖維素雖然消化率低， 但適量的粗纖維在牲畜的日糧中也起到了不可忽視的作用， 能夠在一定程度上擴(kuò)充牲畜的胃腸容量， 使其食用飼料后具有飽腹感，有利于牲畜的育肥（葛德軍，2009）。 適量的纖維素在腸道中還能促進(jìn)腸道蠕動(dòng)， 幫助家畜的消化和排便（Johnston 等，2003）。 微生物發(fā)酵是一種纖維素生物轉(zhuǎn)化的有效方法， 可以通過纖維素分解菌的發(fā)酵來降低纖維素含量， 增加營養(yǎng)成分（Ng 等，2011）。本試驗(yàn)以纖維素降解率為指標(biāo)，利用從腐敗稻草中篩選出具有高效纖維素降解能力且適合竹筍加工廢棄物發(fā)酵的細(xì)菌； 通過形態(tài)學(xué)觀察、 生理生化試驗(yàn)并結(jié)合基于16S rDNA 序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹對菌株進(jìn)行鑒定； 采用固態(tài)生料發(fā)酵法， 以及單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)法對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化， 為竹筍加工廢棄物的飼料化開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 竹筍加工廢棄物由桃江縣億陽侖生態(tài)食品有限公司提供，烘干粉碎之后過80目篩， 保存?zhèn)溆谩?葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CMC-Na、NaCl、 剛果紅、H2SO4、NaOH 均為分析純，采購自國藥集團(tuán)。菌種分離所用樣品于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地水稻田中自然腐爛的稻草采集。

1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基 （孫苗苗等，2021）：CMC-Na 5 g/L，蛋白胨5 g/L，CaCO32 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L， 瓊脂粉20 g/L。 121 ℃，滅菌25 min。

CMC-Na 選擇培養(yǎng)基 （黃玉蘭等，2010）：CMC-Na 5 g/L， （NH4）2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，K2HPO40.5 g/L，NaCl 0.25 g/L， 剛果紅0.2 g/L，瓊脂粉20 g/L。 121 ℃，滅菌25 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉20 g/L。 121 ℃，滅菌25 min。 121 ℃，滅菌25 min。

濾紙條分解培養(yǎng)基（孫苗苗等，2021）：（NH4）2SO44 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，蛋白胨1 g/L，酵母膏10 g/L，濾紙條0.25 g/L。121 ℃，滅菌25 min。

液體種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，NaCl 3 g/L，葡萄糖20 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41.5 g/L，115 ℃，滅菌30 min。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基（劉娣，2008）：CMC-Na 10 g/L，（NH4）2SO41 g/L， 蛋白胨10 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，葡萄糖2 g/L，CaCl22 g/L，115 ℃，滅菌30 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基： 竹筍加工廢棄物100%，NaCl 3%， 葡萄糖3%，K2HPO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，固水比1:1。

1.3 菌種篩選

1.3.1 菌種的富集與初篩 準(zhǔn)確稱取10.00 g 菌種分離樣品置于加有適量玻璃珠的90 mL 無菌水中，充分振蕩打散后制成樣品懸液并吸取5 mL置于液體富集培養(yǎng)基中。 37 ℃、170 r/min 振蕩培養(yǎng)120 h 后， 將富集培養(yǎng)液按照稀釋涂布法一直稀釋至10-7。 分別取10-4、10-5、10-6、10-7四個(gè)不同稀釋梯度的稀釋液0.1 mL 涂布于CMC-Na 選擇培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)72 h 后，挑取透明圈與菌落直徑之比較大的菌落于CMC-Na 選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行多次劃線分離純化， 直至鏡檢菌體形態(tài)一致。 將劃線純化的菌種保存于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，編號并保存。

1.3.2 菌種的復(fù)篩 將初篩菌種活化24 h 后，按照5%（V/V）的接種量接種至液體種子培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床中37 ℃、170 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)48 h 后，按照5%（V/V）的接種量接種于濾紙條崩解培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床中37 ℃、170 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)6 d 后，觀察濾紙條的分解程度。選擇濾紙條分解程度高的菌種接種于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，置于37 ℃、170 r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6 d，測定CMCase 活力。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基表面上接種HYH-1 菌株后，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)特征，并對其進(jìn)行革蘭氏染色后觀察其菌體顯微特征。

1.4.2 生理生化試驗(yàn) 參照周龍霞等（2013）提供的方法對HYH-1 菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

1.4.3 16 S rDNA 序列分析 采用肖思遠(yuǎn)等（2021） 提供的方法對HYH-1 進(jìn)行DNA 提取與擴(kuò)增。 將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海（生工）生物工程有限公司進(jìn)行16S rDNA 測序， 將得到的基因序列在NCBI 上進(jìn)行Blast 比對， 并選取相似度高的已知基因序列使用NJ 法通過MEGA 7.0 進(jìn)行菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.5 單因素試驗(yàn) 分別改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡 萄 糖 添 加 量 （1%、2%、3%、4%、5%、6%）、KH2PO4添加量 （0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、MgSO4·7H2O 添加量 （0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）、固水比（0.6:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.4:1、1.6:1）以及發(fā)酵條件如接種量（4%、6%、8%、10%、12%、14%）、發(fā)酵溫度（28、31、34、37 、40 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（4、5、6、7、8、9 d），測定發(fā)酵前后纖維素含量并計(jì)算纖維素降解率。

1.6 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上， 選擇4 個(gè)對纖維素降解率影響較大的因素，以纖維素降解率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 12 軟件進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析。 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì) %

1.7 指標(biāo)測定

1.7.1 粗纖維降解率的測定 將發(fā)酵后的發(fā)酵料烘干，過80 目篩后測定粗纖維含量并計(jì)算其降解率。 計(jì)算公式為：

1.7.2 CMC 酶活測定 將發(fā)酵液于4 ℃、10000 r/min 條件下離心12 min，獲得粗酶液。 采用羅艷青等（2015）提供的DNS 法測定上清液中CMCase活力。 CMC 酶活定義為：50 ℃條件下，1 mL 粗酶液1 min 水解CMC-Na 產(chǎn)生1 μg 葡萄糖定義為1 個(gè)酶活單位（U）。

1.8 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SEM）”表示。 使用GraphPad Prism 8 繪圖軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選結(jié)果

2.1.1 菌種初篩結(jié)果 從腐爛的稻草中共分離到10 株不同菌落形態(tài)特征且能在CMC-Na 選擇培養(yǎng)基上形成脫色圈的菌株， 分別命名為HYH-1、HYH-2、HYH-3、HYH-6、HYH-7、HYH-8、HYH-10、HYH-11、HYH-12、HYH-20。

2.1.2 濾紙條分解試驗(yàn)結(jié)果 由表2 可知， 菌株HYH-1、HYH-2、HYH-7、HYH-8、HYH-10、HYH-11 分解濾紙條效果較好，而其他菌株效果較差。 因此 選 擇 菌 株HYH-1、HYH- 2、HYH-7、HYH-8、HYH-10、HYH-11 進(jìn)行CMCase 活力測定。

表2 濾紙條分解試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 CMCase 活力測定結(jié)果 由表3 可知，菌株HYH-1 的CMCase 活力達(dá)到2463.33 U/mL，顯著高于其他菌株的CMCase 活力。 因此， 選擇菌株HYH-1 進(jìn)行后續(xù)研究。

表3 菌株CMC 酶活力 U/mL

2.2 菌種鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株HYH-1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 從圖1 可以看出，菌體為桿狀，兩端鈍圓，芽孢呈現(xiàn)為橢圓形，革蘭氏染色陽性；菌落顏色為白色，圓形，表面凸起，光滑且有光澤，不透明。

圖1 菌株HYH-1 的細(xì)胞和菌落形態(tài)

2.2.2 菌株HYH-1 生理生化試驗(yàn)結(jié)果 生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表4。 菌株HYH-1 能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘油和乳糖，不能利用甘露醇和山梨醇。 M.R、V-P 試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原陽性，亞硝酸鹽還原陰性，吲哚反應(yīng)陰性，產(chǎn)氨試驗(yàn)陽性。

表4 菌株HYH-1 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 菌株16S rDNA 分析結(jié)果和菌株發(fā)育樹的構(gòu)建 菌株HYH-1 16S rDNA 擴(kuò)增序列電泳圖見圖2， 對比Marker 可知， 菌種HYH-1 的16S rDNA 片段大小為1495 bp。 基于16S rDNA 序列分析構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖3。 對比發(fā)現(xiàn)，HYH-1 菌種與菌種Bacillus halodurans NR 115063.1 的同源性最高。通過菌體和菌落形態(tài)、生理生化試驗(yàn)結(jié)果和構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹， 將菌株HYH-1 鑒定為耐鹽芽孢桿菌HYH-1（Bacillus halodurans）。

圖2 16S rDNA 電泳圖

圖3 基于16S rDNA 序列同源性構(gòu)建HYH-1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 葡萄糖添加量對纖維素降解率的影響 改變培養(yǎng)基中葡萄糖添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%），其他條件不變，測定發(fā)酵料中纖維素含量，并計(jì)算纖維素降解率，結(jié)果見圖4，當(dāng)葡萄糖添加量為3%時(shí)，發(fā)酵料中纖維素降解率達(dá)到34.01%。葡萄糖添加量低于或高于3%， 纖維素降解率均下降。 故選擇3%的葡萄糖添加量進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 葡萄糖添加量對纖維素降解率的影響

2.3.2 KH2PO4添加量對纖維素降解率的影響在上述試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上， 改變發(fā)酵培養(yǎng)基中KH2PO4添加量，其他條件不變，測定發(fā)酵料中纖維素含量，并計(jì)算纖維素降解率，結(jié)果見圖5。 當(dāng)KH2PO4添加量為0.3%時(shí)，纖維素降解率最大，達(dá)36.08%，顯著高于其他處理。 因此，選擇KH2PO4添加量為0.3%進(jìn)行后續(xù)研究。

圖5 KH2PO4 添加量對纖維素降解率的影響

2.3.3 MgSO4·7H2O 添加量對纖維素降解率的影響 基于上述試驗(yàn)結(jié)果， 改變發(fā)酵培養(yǎng)基中Mg-SO4·7H2O 添加量，其他條件不變，測定發(fā)酵料中纖維素含量，并計(jì)算纖維素降解率，結(jié)果見圖6。在一定的添加量范圍內(nèi)， 纖維素降解率隨著Mg-SO4·7H2O 添加量的增加而增加。 當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為0.15%時(shí)， 纖維素降解率最大，為39.05%，但MgSO4·7H2O 添加量超過0.15%，纖維素降解率下降。 故選擇MgSO4·7H2O 添加量為0.15%進(jìn)行后續(xù)研究。

圖6 MgSO4·7H2O 對纖維素降解率的影響

2.3.4 固水比對纖維素降解率的影響 微生物的生長代謝能力與培養(yǎng)基中的水分含量關(guān)系密切。含水量過低會(huì)降低培養(yǎng)基離子化程度， 從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，導(dǎo)致代謝能力下降（柯芙容等，2015）； 含水量過高則會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中氣體交換不暢， 影響好氧微生物的生長 （畢于運(yùn)，2010）。 從圖7 可以看出，當(dāng)固水比為1:1 時(shí)，纖維素降解率達(dá)42.75%。 故選擇固水比為1:1 進(jìn)行后續(xù)研究。

圖7 固水比對纖維素降解率的影響

2.3.5 接種量對纖維素降解率的影響 基于上述試驗(yàn)結(jié)果， 在培養(yǎng)基中分別接入4%、6%、8%、10%、12%、14%的液體種子，其他條件不變，測定發(fā)酵料中纖維素含量，并計(jì)算纖維素降解率，結(jié)果見圖8。 接種量是影響發(fā)酵效果的重要指標(biāo)之一。接種量過小會(huì)使菌種生長緩慢， 造成發(fā)酵時(shí)間延長； 接種量過大， 導(dǎo)致發(fā)酵前期營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快， 后期營養(yǎng)不足而影響代謝產(chǎn)物的形成和分泌以及菌體提前衰老等（劉興，2020）。 圖8 結(jié)果表明，當(dāng)接種量為12%時(shí)，纖維素降解率達(dá)46.87%。因此，選擇接種量為12%進(jìn)行后續(xù)研究。

圖8 接種量對纖維素降解率的影響

2.3.6 培養(yǎng)溫度對纖維素降解率的影響 基于上述試驗(yàn)結(jié)果， 將培養(yǎng)基分別置于28、31、34、37、40 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其他條件不變，測定發(fā)酵料中纖維素含量，并計(jì)算纖維素降解率。溫度主要通過影響微生物細(xì)胞中代謝酶的活性、 細(xì)胞膜通透性以及營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度等。 培養(yǎng)溫度過高或過低，均會(huì)影響微生物的生長和代謝。 圖9 結(jié)果表明， 當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)， 纖維素降解率達(dá)50.15%。 故選擇發(fā)酵溫度為37 ℃進(jìn)行后續(xù)研究。

圖9 溫度對纖維素降解率的影響

2.3.7 發(fā)酵時(shí)間對纖維素降解率的影響 基于上述試驗(yàn)結(jié)果， 分別從培養(yǎng)第4、5、6、7、8、9 天進(jìn)行取樣，其他條件不變，測定發(fā)酵料中纖維素含量，并計(jì)算纖維素降解率，結(jié)果如圖10。 當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為8 d 時(shí)，纖維素降解率達(dá)到55.82%。 因此，適宜的發(fā)酵時(shí)間為8 d。

圖10 發(fā)酵時(shí)間對纖維素降解率的影響

2.4 發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 使用Design-Expert 12.0 軟件進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果見表5 和表6。

表5 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 回歸模型的方差分析結(jié)果

2.4.2 回歸模型方差分析 運(yùn)用Design-Expert 12.0 軟件對表5 結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)擬合分析， 得到回歸方程為：Y=54.99-2.77A+0.0525B+1.78C-1.78D-0.0225AB+0.32AC+1.1AD-0.1375BC +2.64BD -0.1775CD -8.81A2-8.69B2-9.66C2-5.12D2。

由表6 結(jié)果可知， 本試驗(yàn)建立的回歸模型中F=14.75，P ＜0.0001，說明該模型差異極顯著。 失擬項(xiàng)中F=18.76，P ＞0.05， 說明該模型中沒有異常數(shù)據(jù)，方程可靠。模型的決定系數(shù)R2=0.9451，較正系數(shù)R2adj=0.8810，說明該模型可以解釋94.51%的響應(yīng)值變化， 也表明可以用此模型對纖維素降解率進(jìn)行分析和預(yù)測，4 個(gè)因素對纖維素降解率的影響大小依次為：A>C>D>B。

2.4.3 響應(yīng)面分析 利用Design-Expert 12 軟件創(chuàng)建的葡萄糖添加量、KH2PO4添加量、固水比、接種量4 個(gè)因子之間的交互作用曲面圖及等高線圖如圖11 所示。響應(yīng)面曲面圖可以直觀的表現(xiàn)出兩個(gè)因素對因變量的影響情況， 曲面坡度越陡峭則說明其對因變量影響越大（王瑞璇等，2021）。等高線圖越接近于橢圓，表明兩者的交互作用越大，等高線越密集則說明了該因素對因變量的影響越大（惠靖茹等，2022）。本試驗(yàn)中所有響應(yīng)面曲面圖坡面均陡峭，圖形的開口均朝下，除KH2PO4添加量與接種量之間的交互作用顯著外， 其他各因素之間的交互作用均不顯著。

2.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證試驗(yàn) 通過回歸方程得到的最佳發(fā)酵條件為：葡萄糖添加量2.88%，KH2PO4添加量0.29%， 固水比1.03:1， 接種量11.50%， 在此條件下預(yù)測的纖維素降解率為55.41%。 根據(jù)試驗(yàn)以及實(shí)際操作的可行性，將發(fā)酵條件修正為葡萄糖添加量2.9%，KH2PO4添加量2.9%，固水比1:1，接種量11.50%。 在此條件之下進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)， 得到纖維素平均降解率為54.85%，與理論值無顯著差異。 表明響應(yīng)面法對發(fā)酵竹筍加工廢棄物的發(fā)酵條件優(yōu)化效果良好，結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從腐爛的稻草中分離到1 株產(chǎn)纖維素酶活力較高的菌株HYH-1， 并對菌株HYH-1 進(jìn)行了鑒定， 利用單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面Box-Behnken 試驗(yàn)對菌株HYH-1 發(fā)酵竹筍加工廢棄物的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，菌株HYH-1 鑒定為耐鹽芽孢桿菌（Bacillus halodurans）。 適宜的發(fā)酵條件為：葡萄糖添加量2.9%，KH2PO4添加量2.9%，7H2O·MgSO4添加量0.15%，固水比1:1，接種量11.50%，發(fā)酵時(shí)間8 d，發(fā)酵溫度37 ℃。在此條件下， 發(fā)酵竹筍加工廢棄物纖維素含量降低到了16.12%，較發(fā)酵前的35.70%，降解率達(dá)到了54.85%。試驗(yàn)結(jié)果為竹筍加工廢棄物的飼料化奠定了良好的基礎(chǔ)。 本文僅對耐鹽芽孢桿菌發(fā)酵竹筍加工廢棄物的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，對于大規(guī)模生產(chǎn)利用竹筍加工廢棄物的發(fā)酵條件有待進(jìn)一步深入研究。