段凱文，黃小紅，李 莉，鄧海英，江俊勇

（江西生物科技職業(yè)學(xué)院，江西南昌 330200）

熱應(yīng)激是環(huán)境溫度超過(guò)等熱區(qū)中舒適區(qū)的上限溫度所致的應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體必須通過(guò)化學(xué)調(diào)節(jié)方式來(lái)減少產(chǎn)熱，因而引起一系列的內(nèi)分泌變化，嚴(yán)重影響動(dòng)物的機(jī)能代謝和生產(chǎn)性能。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是機(jī)體受到應(yīng)激原刺激后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，是生物熱休克反應(yīng)的主要標(biāo)志；在其家族中，熱休克蛋白70（HSP70）是最重要的一種蛋白質(zhì)，具有分子伴侶作用，能幫助其他蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)，介導(dǎo)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行降解（Eschmid，2012 ；Haslbeck，2002），同時(shí)還能提高細(xì)胞抗應(yīng)激能力，增加細(xì)胞熱耐受能力（Parcellier，2005）。因此，研究HSP 在熱應(yīng)激畜禽體內(nèi)發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化以及如何利用HSP 保護(hù)動(dòng)物機(jī)體抵抗熱應(yīng)激成為研究重點(diǎn)。本研究通過(guò)比較中藥復(fù)方一、復(fù)二、復(fù)方三、紫錐菊與王老吉對(duì)急性熱應(yīng)激小鼠肺、腎臟組織HSP70 及HSF1 表達(dá)量的影響，探索中藥復(fù)方防治熱應(yīng)激的作用機(jī)制，并探討中藥對(duì)HSP70表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為抗急性熱應(yīng)激中藥的研究與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)中藥 復(fù)方一由藿香、香薷、生石膏、車前草等6 味中藥組方；復(fù)方二由紫蘇、薄荷、地膽草等6 味中藥組方；復(fù)方三由生石膏、紫錐菊、藿香、紫蘇等6 味中藥組方，單方為紫錐菊。各種中草藥各取30 g，加水300 mL 煎煮，沸后文火煮2 h，紗布過(guò)濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮到20 mL，使中藥濃度為1.5g/mL。藥液均經(jīng)流通蒸汽滅菌30 min，4℃冰箱保存?zhèn)溆?，共獲得3 種復(fù)方中草藥濃縮液和紫錐菊濃縮液。

1.2 主要試劑和儀器 熱休克蛋白70 定量測(cè)定試劑盒與熱休克因子1 定量測(cè)定試劑盒均購(gòu)自美國(guó)RB 公司。王老吉購(gòu)自奇康超市。主要儀器有Multiskan Mk3 酶標(biāo)儀，DY89 Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)，TGL-16B 型臺(tái)式離心機(jī)，SP-01 型生化培養(yǎng)箱，分光光度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 試驗(yàn)將90 只6 ～7周齡健康SPF 級(jí)昆明小白鼠隨機(jī)分為復(fù)方一組、復(fù)方二組和復(fù)方三組、紫錐菊組、王老吉組、陽(yáng)性空白對(duì)照組，陰性空白對(duì)照組，每組10 只。試驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)，經(jīng)1 周預(yù)試期后進(jìn)入正式試驗(yàn)。試驗(yàn)1 ～5 組分別灌胃中藥復(fù)方一、中藥復(fù)方二、中藥復(fù)方三、紫錐菊、王老吉，試驗(yàn)5 組只飼喂基礎(chǔ)日糧。其中藥物組和陽(yáng)性對(duì)照組試驗(yàn)期間溫度為40℃，相對(duì)濕度為60% ～80%、試驗(yàn)時(shí)間分為1 h、3 h。

1.4 樣品采集與處理 在試驗(yàn)的第1、3 小時(shí)，每組取5 只小白鼠，剖殺取肺臟和腎臟，液氮速凍后于-20℃保存待測(cè)。稱取肺臟和腎臟各0.2 g，剪碎（冰水浴中操作），加入組織塊重量9 倍的勻漿介質(zhì)（0.9% 冷生理鹽水），用勻漿機(jī)3000 r/min 處理30 s，使細(xì)胞破碎后，3500 r/min 離心5 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。

1.5 樣品檢測(cè)方法 HSP70ELISA 檢測(cè)試劑盒測(cè)定肺臟和腎臟組織HSP70 表達(dá)量，HSF1ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定肺臟和腎臟組織HSF1 表達(dá)量，測(cè)試步聚按照試劑盒說(shuō)明書完成。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS

13.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)肺、腎臟HSP70 含量的影響

2.1.1 對(duì)肺臟HSP70 的含量影響 由表1 可知，在應(yīng)激1 h 時(shí)，復(fù)方三HSP70 表達(dá)量極顯著高于陰性對(duì)照組，略高于陽(yáng)性對(duì)照組。復(fù)方一、復(fù)方二及王老吉組均略高于陰性對(duì)照組，但略低于陽(yáng)性對(duì)照組。在應(yīng)激3 h 時(shí)，復(fù)方一、復(fù)方二雞和紫錐菊組HSP70 表達(dá)量較1 h 有所增加，而復(fù)方三，王老吉及陽(yáng)性對(duì)照組均有所下降。其中復(fù)方一和復(fù)方二HSP70 表達(dá)量均極顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，復(fù)方三極顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組，紫錐菊和王老吉組均顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組。其中復(fù)方二的作用最顯著，可能是因?yàn)閺?fù)方二中紫蘇宣肺利氣，發(fā)汗解表作用得到發(fā)揮。陽(yáng)性對(duì)照組HSP70 表達(dá)量下降幅度最大。

表1 中藥對(duì)急性熱應(yīng)激小鼠肺臟HSP70 含量的影響 ng/L

2.1.2 對(duì)腎臟HSP70 含量的影響 由表2 可知，熱應(yīng)激1 h 時(shí)，HSP70 的表達(dá)量比陰性對(duì)照組有所降低，而到3 h 時(shí)有所增加，普遍超過(guò)了陰性對(duì)照組。在應(yīng)激3 h 時(shí)，復(fù)方一、復(fù)方二和復(fù)方三HSP70 的表達(dá)量均極顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，紫錐菊組極顯著高于陰性對(duì)照組，王老吉?jiǎng)t顯著高于陰性對(duì)照組。其中復(fù)方一的提升作用顯著，這可能與車前草利水通淋，清熱解毒作用關(guān)系密切。

表2 中藥對(duì)急性熱應(yīng)激小鼠腎臟HSP70 含量的影響 ng/L

2.2 對(duì)肺、腎臟HSF1 含量的影響

2.2.1 對(duì)肺臟HSF1 含量的影響 由表3 可知，用藥組在應(yīng)激3 h 時(shí)HSF1 表達(dá)量均高于1 h 的。在應(yīng)激1 h 時(shí)，各組HSF1 表達(dá)量的差異不顯著（P＞0.05）。應(yīng)激3 h 時(shí)，復(fù)方二極顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。

表3 中藥對(duì)急性熱應(yīng)激小鼠肺臟HSF1 含量的影響 ng/L

2.2.2 對(duì)腎臟HSF1 的含量影響 由表4 可知，各組在3 h 時(shí)HSF1 表達(dá)量均低于應(yīng)激1 h 時(shí)。在1 h 時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組HSF1 的表達(dá)量最高，其次是王老吉組和復(fù)方三組。其中復(fù)方一、復(fù)方二和紫錐菊組極顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組。在3 h 時(shí)，各組HSF1 表達(dá)量均有下降，但陽(yáng)性對(duì)照組仍然高于其他各組。其中復(fù)方一和復(fù)方二極顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組。

表4 中藥對(duì)急性熱應(yīng)激小鼠腎臟HSF1 含量的影響 ng/L

3 討論

3.1 對(duì)肺臟和腎臟Hsp70 含量的影響 肺腎之間存在相互滋生的關(guān)系，肺屬金，腎屬水，金能生水，肺陰下達(dá)于腎可滋養(yǎng)腎陰；腎陰為一身陰液之根本，故腎陰亦可上濟(jì)于肺以滋養(yǎng)肺陰，這又叫“金水相生”。根據(jù)五行理論，肺金和腎水是母子關(guān)系。在生理功能中，肺和腎互相配合、互相影響，這就叫“肺腎相生”。在病理方面，肺氣虛損可以導(dǎo)致腎氣衰弱，即“母病及子”。相反，腎氣衰弱也可以導(dǎo)致肺虛，則為“子病累母”。此病初起，由口鼻而入，肺先受之。濕熱之邪由體表外感而入，由表入里，侵犯中焦，蘊(yùn)脾生熱，脾胃積熱與濕交困，浸淫肌膚，或濕熱久蘊(yùn)于下，損傷腎氣。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在3 h 時(shí)，肺臟和腎臟的HSP70 表達(dá)量上升，且腎臟上升明顯，Emami（1991）等研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腎臟42℃ 15 min 熱應(yīng)激后HSP70 逐漸增加，4 ～6 h 達(dá)到高峰，與本試驗(yàn)結(jié)果相同。HSP70 可作為熱應(yīng)激的生物標(biāo)志物（Kumar，2003），隨熱應(yīng)激時(shí)間的增加，熱應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響由表及里，由上焦傳至下焦。HSP70 表達(dá)的增強(qiáng)是細(xì)胞保護(hù)作用的體現(xiàn)，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，復(fù)方三和王老吉組HSP70 表達(dá)量不升反降，可知復(fù)方一和復(fù)方二的抗應(yīng)激效果較復(fù)方三的效果好。

3.2 對(duì)肺、腎臟HSF1 含量的影響 HSF1 是基本結(jié)構(gòu)蛋白，應(yīng)激時(shí)通過(guò)可逆過(guò)程形成三聚體，與HSE 結(jié)合并激活HSP70 基因的轉(zhuǎn)錄。在非應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中HSP70 蛋白和HSF 結(jié)合形成HSF-HSP70 復(fù)合物，此時(shí)HSF 沒(méi)有活性。當(dāng)受到應(yīng)激時(shí)，由于變性蛋白增多，與HSF 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HSP70，大量HSP70 與變性蛋白結(jié)合，導(dǎo)致HSF 從HSF-HSP70 復(fù)合物中釋放出來(lái)，此時(shí)游離的HSF 在蛋白激酶或其他激酶的作用下發(fā)生磷酸化，形成有活性的三聚體，并轉(zhuǎn)入核內(nèi)（Pratt等，1997），在核內(nèi)與熱休克基因上游啟動(dòng)子區(qū)的HSE 序列結(jié)合，進(jìn)一步被激酶磷酸化（Price，1992），然后啟動(dòng)熱休克基因的表達(dá)。這一反應(yīng)非常迅速，在受熱后數(shù)分鐘可達(dá)最高水平，約為應(yīng)激前的10 ～20 倍。當(dāng)HSP70 累積到一定程度時(shí)又與HSF 結(jié)合，HSF 和HSE 分離，抑制此轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)反饋抑制熱休克反應(yīng)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，中藥能有效提高肺臟HSF1的表達(dá)量，但腎臟的HSF 表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，可能在應(yīng)激3 h 時(shí)，腎臟HSP70 的含量升高到一定程度，與HSF 結(jié)合，反而抑制HSF1 的表達(dá)。

3.3 中藥對(duì)熱應(yīng)激的治療作用 夏季高溫高濕產(chǎn)生的熱應(yīng)激在中醫(yī)理論上屬溫?zé)嶙C范疇。暑濕是其中重要致病因素，《素問(wèn)·至真要大論》中指出：“夫百病之生也，皆生于風(fēng)寒暑濕燥火，以之化之變也。”暑性同火烈為陽(yáng)邪，濕性重濁黏滯為陰邪。暑本熾盛，有得濕助，其熱更熾；濕得暑蒸，其勢(shì)更橫。正如《濕熱條辨》所說(shuō)“夫熱為天之氣，濕為地之氣，熱得濕愈熾，濕得熱愈橫。濕熱兩分，其病輕而緩；濕熱兩合，其病重而速”。因此，用藥上以清輕涼潤(rùn)、甘寒、咸寒為主，分別采用解表、清熱、涼血、滋陰等方法（劉忠杰，2006）。武果桃等（2019）研究表明，復(fù)方中藥可提高肉仔雞機(jī)體細(xì)胞熱耐受水平，提高生產(chǎn)性能。本試驗(yàn)3 個(gè)中藥復(fù)方均以清熱利濕為基本擬方原則，注重肺金養(yǎng)腎水這一治則，并有所側(cè)重地篩選各種藥物以組成方劑，如復(fù)方一中香薷行水消暑，藿香清理水道，車前草利水通淋。復(fù)方二中紫蘇宣肺利氣，發(fā)汗解表；薄荷性涼，疏散風(fēng)熱；陳皮行氣導(dǎo)水；淡竹葉配伍諸藥則清熱利尿，復(fù)方三生石膏清實(shí)熱，蒼術(shù)燥濕，并加紫錐菊以增強(qiáng)機(jī)體免疫力。三組復(fù)方中，復(fù)方二能顯著提高肺臟的HSP70 和HSF1 的含量，可能與組方中紫蘇和薄荷的功效有關(guān)。費(fèi)楓和劉銳（2023）研究表明，飼料添加薄荷提取物有助于提高熱應(yīng)激條件下斷奶仔豬HSP70基因的表達(dá)量，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。