吉爽秋 王力榮 李勇 朱更瑞 曹珂 方偉超 陳昌文 王新衛(wèi) 張琦 吳金龍

摘要：【目的】進(jìn)一步完善桃花型基因型分類(lèi)，開(kāi)發(fā)桃花型相關(guān)分子標(biāo)記，為觀(guān)賞桃花的分子輔助育種提供理論支持。【方法】利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）、IGV可視化軟件分析，以及競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（Kompetitive allele-specific PCR，KASP）技術(shù)，在定位到的候選位點(diǎn)進(jìn)行鑒定分析?！窘Y(jié)果】GWAS定位分析在Pp08：14 518 604～14 521 291 bp 存在一個(gè)ms179810 轉(zhuǎn)座子的缺失，x2驗(yàn)證結(jié)果表明，轉(zhuǎn)座子的插入與缺失與花型性狀無(wú)顯著性關(guān)系。在轉(zhuǎn)座子上游33 980 bp 處鑒定到一個(gè)單堿基核苷酸（SNP）變異，變異類(lèi)型分為CC型、AC型、AA型3 種，比對(duì)結(jié)果顯示基因型為CC型、AC型，其表型為鈴形，基因型為AA型，其表型為薔薇形，在145 份桃自然群體中鑒定準(zhǔn)確率為98.62%。但是通過(guò)表型比對(duì)發(fā)現(xiàn)，基因型為CC時(shí)，鈴形花冠直徑為（1.54 ± 0.46）cm，同時(shí)，基因型雜合的中蟠17 號(hào)自交群體后代192 株中基因型與表型準(zhǔn)確率在98.44%?！窘Y(jié)論】根據(jù)桃基因組中Pp08：14 484 624 bp處的變異類(lèi)型以及桃花型的調(diào)查結(jié)果，首次將鈴形花基因型細(xì)分為純合鈴形和雜合鈴形，且開(kāi)發(fā)了同時(shí)鑒定純合鈴形、雜合鈴形及薔薇形的分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：桃；花型；全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）；IGV；競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）

中圖分類(lèi)號(hào)：S662.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）03-0422-10

桃（Prunus. persica L.），薔薇科，李屬，多年生自花授粉落葉果樹(shù)。因其染色體數(shù)目少（2n=16），基因組?。?27 Mb），童期短，被認(rèn)為是薔薇科果樹(shù)研究的模式植物[1]。中國(guó)是桃的起源中心，種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富。觀(guān)賞桃是桃種質(zhì)資源的重要類(lèi)型。其花型主要分為鈴形、薔薇形和菊花形（圖1），在三大花型的基礎(chǔ)上，通過(guò)育種技術(shù)的不斷更新，花型、花色、樹(shù)形、枝形和葉色的交叉組合，賦予桃花更多的表現(xiàn)形式[2-3]。

鈴形和薔薇形是一對(duì)等位基因控制的質(zhì)量性狀。鈴形花冠直徑小，花瓣細(xì)長(zhǎng)，完全開(kāi)放時(shí)形似鈴鐺；薔薇形花冠直徑大，花瓣肥碩，開(kāi)放時(shí)花瓣展開(kāi)，在外觀(guān)上容易區(qū)分表型，且該性狀屬于質(zhì)量性狀，定位分析相對(duì)簡(jiǎn)單，因此前人對(duì)此做了大量的研究，例如，在2009 年Ogundiwin 等[4]利用罐桃品種Dr. Davis和鮮食桃品種Georgia Belle 的F1群體，構(gòu)建了一個(gè)包含211 個(gè)標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜Pop-DG，將鈴形/薔薇形關(guān)聯(lián)位點(diǎn)定位于8 號(hào)染色體34.4 cM處；2010年Fan 等[5]利用QTL定位將桃花鈴形/薔薇形定位在8 號(hào)染色體上的CPPT006 與PacC13 兩個(gè)標(biāo)記之間。之后隨著GWAS 定位技術(shù)在果樹(shù)分子育種上的發(fā)展，2015 年Micheletti 等[6]基于9K SNP 芯片對(duì)1580 份桃種質(zhì)資源進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)8 號(hào)染色體18 個(gè)SNP 標(biāo)記與鈴形/薔薇形關(guān)聯(lián)緊密，范圍大小為4.3 Mb；2016 年Cao 等[7]利用129 份桃種質(zhì)材料，在8 號(hào)染色體13 740 117 bp處發(fā)現(xiàn)的1個(gè)SNP位點(diǎn)與鈴形/薔薇形關(guān)聯(lián)度較高；2021 年孟歌等[8]利用199 份桃種質(zhì)，將鈴形/薔薇形定位在8 號(hào)染色體14 484 624 bp處，并開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的分子標(biāo)記；2022 年Lian 等[9]利用黃水蜜×中油桃14 雜交后代81 株，在8號(hào)染色體PpB3-1 基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了1 個(gè)與表型關(guān)聯(lián)度極高的SNP。目前開(kāi)展的花型定位分析絕大多數(shù)利用的數(shù)據(jù)是SNP基因型，將控制桃花型的候選基因范圍鎖定在8 號(hào)染色體14 Mb～16 Mb之間，但是基于SNP的GWAS結(jié)果定位區(qū)間往往較大，區(qū)間內(nèi)的變異位點(diǎn)較多，開(kāi)展關(guān)鍵基因挖掘工作仍具挑戰(zhàn)性。而變異的SV（Structure Variantions）較SNP而言，更能影響基因的功能[10]。因此筆者利用本課題組前期發(fā)表的327 份桃種質(zhì)材料的重測(cè)序結(jié)果，利用鑒定到的SV 位點(diǎn)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），將候選基因的范圍鎖定在14.4 Mb～14.6 Mb之間，并挖掘到1 個(gè)與表型相關(guān)性極高的SNP 位點(diǎn)Pp08：14 484 624 bp，利用KASP 基因分型技術(shù)驗(yàn)證了該位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，同時(shí)在與表型的驗(yàn)證過(guò)程中首次提出純合鈴形/雜合鈴形之分，為進(jìn)一步克隆關(guān)鍵基因提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

用于本試驗(yàn)GWAS分析的材料主要源于327 份桃種質(zhì)材料，具體品種參考Guo等[11]，用于轉(zhuǎn)座子驗(yàn)證的材料主要來(lái)源于1 個(gè)192 株的自交群體，2 個(gè)96株的雜交群體，自交群體為中蟠17 號(hào)，雜交群體為瑞光39 號(hào)×08-9-106 和晴朗× 中油蟠7 號(hào)，用于IGV可視化分析的145 份桃種質(zhì)材料（表1），其中有59份為GWAS 已有重測(cè)序數(shù)據(jù)，86 份新增重測(cè)序數(shù)據(jù)。以上種質(zhì)資源及自交和雜交群體后代均來(lái)自國(guó)家園藝種質(zhì)資源庫(kù)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所桃種質(zhì)資源圃。

1.2 表型數(shù)據(jù)的調(diào)查

2022 年3、4 月對(duì)自然群體及雜交群體的表型進(jìn)行調(diào)查。具體調(diào)查結(jié)果如表2 所示。

1.3 DNA提取與測(cè)序

樣品DNA的提取采用改良的CTAB法，具體方法參考張南南等[12]的方法，DNA 質(zhì)量用NanoDrop1000 spectrophotometer（Themo Scientific）紫外分光光度儀檢測(cè)。用于KASP 基因分型的樣品DNA質(zhì)量濃度調(diào)整至50～100 ng·μL。用于GWAS定位分析的DNA純化后構(gòu)建文庫(kù)和測(cè)序，文庫(kù)大小為350 bp，測(cè)序平臺(tái)選用Hiseq X Ten（Illumina），測(cè)序任務(wù)由安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司（北京）完成。經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)控后（FastQC），每個(gè)樣本產(chǎn)生至少5 Gb的數(shù)據(jù)[11]。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用SV數(shù)據(jù)開(kāi)展GWAS分析，最終產(chǎn)生181 381個(gè)變異位點(diǎn)，定位出鈴形/薔薇形相關(guān)的變異位點(diǎn)，并曼哈頓（Manhattan）圖顯示關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

1.5 IGV可視化分析

利用IGV可視化查看基因組重測(cè)序結(jié)果，比對(duì)文件為下機(jī)的bam文件，導(dǎo)入IGV的bam文件附加samtools 文件，生成3 個(gè)相關(guān)的tracks，AlignmentTrack，Coverage Track，Splice Junction Track，對(duì)145份桃品種基因組序列進(jìn)行比對(duì)。

1.6 KASP標(biāo)記分型

競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）擴(kuò)增體系：5 μL 2× KASP master mix（廣州固德生物技術(shù)有限公司，廣州，中國(guó)），1 μL DNA 樣品，0.5 μL混合引物以及3.5 μL水，添加混合試劑前加入等體積石蠟油封體系。KASP 擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性20 s，61～55 ℃復(fù)性延伸60 s，10 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)復(fù)性延伸溫度降低0.6 ℃；95 ℃變性20 s，55 ℃復(fù)性延伸60 s，32 個(gè)循環(huán)。熒光數(shù)據(jù)讀取和分析儀器為Roche LC96 Ⅱ（Roche Diagnostics，USA），讀取溫度為37 ℃，讀取時(shí)間為60 s，所用熒光為羧基熒光素（FAM，carboxy fluorescein）和六氯熒光素（HEX，hexachlorouorescein）。KASP 引物序列信息見(jiàn)表3。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈴形/薔薇形性狀關(guān)鍵位點(diǎn)全基因組關(guān)聯(lián)分析

筆者在本研究中通過(guò)對(duì)327 份桃材料進(jìn)行重測(cè)序分析，利用SV變異定位鈴形/薔薇形候選區(qū)間，在桃全基因組中共獲得181 381 個(gè)高質(zhì)量SV 位點(diǎn)。GWAS 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Pp08：14 518 604～14 521 291 處有一個(gè)2866 bp 轉(zhuǎn)座子（TE）與花型顯著相關(guān)（圖2），縮短了前人的定位區(qū)間。PCR擴(kuò)增該轉(zhuǎn)座子后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳在23 份種質(zhì)資源（圖3）和384份雜交群體后代中進(jìn)行驗(yàn)證（表4）。發(fā)現(xiàn)在23 份桃種質(zhì)中沒(méi)有差異，在384 份雜交群體后代中雖然存在分離，但x2檢驗(yàn)結(jié)果卻表明轉(zhuǎn)座子的插入與缺失與花型無(wú)顯著的相關(guān)性。

2.2 IGV可視化分析挖掘變異關(guān)鍵位點(diǎn)

由于轉(zhuǎn)座子的插入與花型之間沒(méi)有顯著性關(guān)系，且該定位區(qū)間附近基因數(shù)量較少，從而在原有的定位基礎(chǔ)上，擴(kuò)大定位區(qū)間，在定位區(qū)間前后100 kb 的范圍內(nèi)，利用IGV軟件，以Prunuspersica-genome.v2.0.a1作為參考基因組，在145份桃種質(zhì)材料重測(cè)序數(shù)據(jù)中比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)座子上游33 980 bp 處存在一個(gè)變異的SNP（C→A），該位點(diǎn)為Pp08：14 484 624 bp，經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)存在3種變異類(lèi)型，如圖4-a～c所示，圖4-a位點(diǎn)為CC時(shí)，表現(xiàn)為鈴形花，圖4-b位點(diǎn)為AC時(shí)，表現(xiàn)依然為鈴形花，圖4-c位點(diǎn)為AA時(shí)，表現(xiàn)為薔薇形花。但是通過(guò)與表型比對(duì)發(fā)現(xiàn)，位點(diǎn)為CC時(shí)的鈴形花冠直徑比位點(diǎn)為AC的更小，位點(diǎn)為CC時(shí)花冠直徑為（1.54±0.46）cm，位點(diǎn)為AC時(shí)花冠直徑為（2.61±0.4）cm。因此筆者認(rèn)為，在花型的分類(lèi)中，鈴形花又可以分為純合鈴形和雜合鈴形。

2.3 KASP基因分型技術(shù)鑒定純合鈴形種質(zhì)

由于鈴形/薔薇形是由一對(duì)等位基因控制的質(zhì)量性狀，根據(jù)孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，變異位點(diǎn)為AC的鈴形花自交后代應(yīng)該出現(xiàn)以上3種花型的分型。因此采用該位點(diǎn)基因型為AC的中蟠17號(hào)，利用其自交群體后代192株，對(duì)Pp08：14 484 624 bp進(jìn)行KASP基因分型驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)中蟠17號(hào)自交群體有3種基因型（圖5），分離比為41∶94∶54，接近1∶2∶1。對(duì)中蟠17號(hào)自交群體的花冠直徑進(jìn)行了調(diào)查統(tǒng)計(jì)（圖6），花冠直徑被分為（1.54±0.46）cm、（2.61±0.4）cm、大于3.7 cm 3種類(lèi)型，分別為純合鈴形、雜合鈴形、薔薇形，與基因型比對(duì)正確率在98.44%（表5）。對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖7），發(fā)現(xiàn)純合鈴形和雜合鈴形關(guān)系更近，較薔薇形關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論

在花型分類(lèi)中，育種家更傾向于培育花冠直徑大且重瓣的薔薇形花，比如：灑紅龍柱、報(bào)春、迎春、滿(mǎn)天紅等[13-16]?；ü谥睆酱笮∫惨恢北徽J(rèn)為是區(qū)分鈴形/薔薇形的標(biāo)準(zhǔn)之一，因此開(kāi)發(fā)控制花型的分子標(biāo)記，對(duì)觀(guān)賞桃花分子育種具有重要指導(dǎo)意義。有研究推斷花的大小進(jìn)化軌跡是從小花到大花，此過(guò)程要經(jīng)過(guò)多年的遺傳變異和自然選擇[17-18]。

Landis 等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，黃花菜種群的花從種質(zhì)的起源到現(xiàn)在變大了2.5 倍；Mojica 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，在自然變異中，大的菊花需要花費(fèi)2000 年的時(shí)間才能從小的菊花突變而來(lái)。花型是影響交配系統(tǒng)進(jìn)化和繁殖成功的一個(gè)關(guān)鍵生態(tài)性狀，傳粉者、天敵和非生物環(huán)境是花型變異的驅(qū)動(dòng)力，花型差異通常與不同的傳粉者有關(guān)，形成傳粉綜合征[21]，花型一直被認(rèn)為是操控傳粉者的一種適應(yīng)方式[22-23]，促進(jìn)花型向著大花型的方向進(jìn)化，更有利于傳粉者授粉。但是一些物種花形態(tài)的差異往往不符合這一推斷，有研究發(fā)現(xiàn)，自交群體的起源是和他們祖先非常接近的雜交群體，從異花授粉到自花授粉伴隨著花的形態(tài)學(xué)向“自交綜合征”的顯著變化，其特征就是花的大小縮小，花的性狀大多數(shù)變異是由群體遺傳變異而來(lái)，但是花形態(tài)上的某些差異可能歸因于一個(gè)單獨(dú)的進(jìn)化史[24]。桃就是典型的自花授粉植物，雖然鈴形對(duì)薔薇形為顯性，但是上海水蜜作為栽培桃的祖先[25-26]，其花型為薔薇形，并且有研究報(bào)道GF677（薔薇形）與紅根甘肅桃1 號(hào)（薔薇形）雜交，后代出現(xiàn)了廣泛的分離，F(xiàn)1代出現(xiàn)了鈴形花，因此鈴形花可能是桃、扁桃與甘肅桃種間雜交而來(lái)的[27]。綜合桃花的發(fā)展和進(jìn)化史，從而推斷鈴形花可能從薔薇形花中突變而來(lái)。研究桃花型的進(jìn)化史，首先需明確控制花型的關(guān)鍵基因，盡管此前對(duì)于鈴形/薔薇形的定位做了大量研究，將關(guān)鍵基因定位在8 號(hào)染色體14 Mb～16 Mb之間，但具體位置一直存在差異。筆者在本研究中利用基于SV 的GWAS 分析，最顯著的信號(hào)位于8 號(hào)染色體ms179810 轉(zhuǎn)座子，x2檢驗(yàn)結(jié)果卻表明轉(zhuǎn)座子的插入與缺失與花型沒(méi)有顯著的相關(guān)性，但在該定位區(qū)間挖掘到一個(gè)與表型相關(guān)度極高的SNP（Pp08：14 484 624 bp），經(jīng)查閱文獻(xiàn)資料，孟歌等[8]利用199 份桃資源，篩選到1 042 687 個(gè)SNP標(biāo)記，利用GWAS 分析找到同樣的位點(diǎn)，經(jīng)鑒定與表型的準(zhǔn)確率在93.46%。筆者通過(guò)改進(jìn)引物、增加驗(yàn)證群體，提出并驗(yàn)證了純合鈴形的存在，因此該標(biāo)記在桃自然群體中表型符合率在98.62%，在雜交群體中表型準(zhǔn)確率在98.44%，證明該位點(diǎn)不僅可作為區(qū)分鈴形/薔薇形的分子標(biāo)記，還可以作為區(qū)分純合鈴形/雜合鈴形的分子標(biāo)記。

4 結(jié)論

筆者根據(jù)桃基因組Pp08：14 484 624 bp 處的變異類(lèi)型以及桃花型的調(diào)查結(jié)果，首次將鈴形花細(xì)分為純合鈴形和雜合鈴形，且開(kāi)發(fā)了同時(shí)鑒定純合鈴形、雜合鈴形及薔薇形的分子標(biāo)記。純合鈴形種質(zhì)資源的鑒定，為鑒定與挖掘提供新的實(shí)驗(yàn)材料，推動(dòng)了桃花型的研究進(jìn)展。

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