王旭敏，李怡霞，鄧子雨，張楊杰，狄建兵*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.華朔（山西）綠色產(chǎn)業(yè)發(fā)展集團生物科技檢測有限公司，山西 朔州 038300；3.山西農(nóng)業(yè)大學 山西功能農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測中心，山西 太原 030031；4.泰州安井食品有限公司，江蘇 泰州 225700）

核桃，世界四大干果之一［1］，據(jù)原國家林業(yè)局、國家林草局提供的統(tǒng)計數(shù)據(jù)和《中國農(nóng)村統(tǒng)計年鑒》：2020 年我國核桃的產(chǎn)量為479.6 萬噸；2021 年我國核桃種植面積達1.2 億畝，產(chǎn)量達540.4 萬噸［2］。核桃中脂肪含量為60%~70%，蛋白質(zhì)含量為15%~20%，核桃的可食用部分為核桃仁，占總重量的40%~60%，含有豐富的營養(yǎng)素，核桃殼皮在打磨石材、生產(chǎn)活性炭、油毛氈工業(yè)以及磨碎做肥料等方面應(yīng)用廣泛［3］。核桃富含脂肪酸和天然抗氧化劑，在預防和降低心臟病及癌癥風險方面有重要作用，也具有補腎、溫肺潤喉、潤腸通便等優(yōu)點［4］。在食品的加工與貯存過程中，都伴隨有蛋白質(zhì)氧化的發(fā)生。有研究表明，氧化作用會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性，影響蛋白質(zhì)的消化性質(zhì)，降低其營養(yǎng)蛋白質(zhì)氧化是指由于蛋白質(zhì)在受到直接或間接氧化作用后，分子內(nèi)部發(fā)生變化，其原本的共價態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，被破壞，分子間的連接、肽鏈斷裂，功能特性進一步惡化，導致食品風味降低、營養(yǎng)損失等［6］。脂肪氧合酶（Lipoxygenase， LOX）在動植物體內(nèi)最常見，并且植物性原料中的LOX 活性較動物性原料中的高［7］，是氧化的一個關(guān)鍵因素。LOX 催化的脂質(zhì)氧化是由4 個基本反應(yīng)組成的，分別為奪氫過程、自由基的重排、氧插入和過氧自由基的還原［8］。脂質(zhì)氧化與蛋白質(zhì)氧化可以相互轉(zhuǎn)移，這2 種氧化反應(yīng)的產(chǎn)物如自由基、H2O2等可作為中間物質(zhì)參與到另一種氧化反應(yīng)中，前者常常先于后者發(fā)生，并且會迅速生成醛類、酮類和低級脂肪酸等一系列化合物，所以二者之間常?？梢员徽f成是前者的產(chǎn)物可以促進后者的發(fā)生［9］。

本文以核桃為試驗原料，利用脂肪氧合酶對不同添加量的亞油酸進行催化，對核桃氧化蛋白的溶解度、粒徑、電位、巰基含量、表面疏水性、二級結(jié)構(gòu)以及內(nèi)源熒光進行檢測分析，本文對核桃蛋白質(zhì)的氧化機理進行研究，有助于了解脂質(zhì)氧化對核桃蛋白結(jié)構(gòu)的影響，為抑制核桃蛋白的氧化，增加核桃產(chǎn)品的貨架期提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

核桃：山西農(nóng)業(yè)大學果樹研究所（經(jīng)度112°29′49″E；緯度37°20′29″N）；2021 年9 月摘；品種為秋香。

脫脂核桃粉：實驗室制備粉。

1.2 主要試劑

本試驗所需試劑如表1 所示。

1.3 主要設(shè)備

表2為試驗所需主要儀器設(shè)備。

表2 試驗儀器與設(shè)備Table 2 Test instruments and equipments

1.4 試驗方法

1.4.1 核桃分離蛋白的制備

參照劉巖等［10］方法略加修改，脫脂核桃粉與水按1∶26 的比例混合，調(diào)節(jié)pH 至11，磁力攪拌1.5 h，離心（5000×g，20 min），取上清液，調(diào)節(jié)pH 至4.5，磁力攪拌1 h，離心（9000×g，20 min），得沉淀，將沉淀pH 調(diào)節(jié)至7.0，倒入液氮快速冷凍，-80 ℃冰箱中放置24 h 后放入真空凍干機，得到核桃分離蛋白，4 ℃冰箱保存。

1.4.2 脂肪氧合酶（LOX）的制備

底物的制備：取燒杯，加入0.27 mL 亞油酸、5 mL NaOH 溶液，混合均勻，加入0.25 mL Tween 20，用HCl 溶液調(diào)節(jié)混合液的pH 至9.0，加入硼酸緩沖液定容至500 mL。

粗酶液的制備［11］：稱0.5 g 核桃，冰浴研磨，分別加入20 mL 聚乙烯吡咯烷酮溶液與PBS 緩沖液，離心（4 ℃，12 000×g，30 min），取澄清液，過0.22 μm 濾膜，制得所需粗酶液。

1.4.3 核桃氧化蛋白的制備

將1.4.1 制得的核桃分離蛋白溶于其重量的20 倍的去離子水中，將pH 調(diào)節(jié)至9.0，取5 個錐形瓶，各加入1.4.2 制得的酶液10 mL，再分別加入0、3、4.5、7.5、9 mL 亞油酸，混勻，放入4 ℃冰箱中反應(yīng)6 h，調(diào)節(jié)pH 至4.5，離心（5000×g，30 min），取沉淀，水洗沉淀，將沉淀pH 調(diào)節(jié)至中性，倒入液氮快速冷凍，-80 ℃冰箱中放置24 h 后放入真空凍干機，得到核桃氧化蛋白，4 ℃冰箱保存［12］。

1.4.4 溶解度的測定

配制5 mg·mL-1蛋白溶液，離心（10 000×g，20 min），取上清液，用雙縮脲法［13］測定蛋白質(zhì)含量，計算其溶解度。

1.4.5 粒徑及電位的測定

將核桃氧化蛋白用10 mmol·L-1、pH 7.0 的PBS 緩沖液進行稀釋，過0.45 μm 濾膜，用納米粒度及Zeta電位分析儀進行測定。

1.4.6 游離巰基含量的測定

采用DTNB 比色法［14］。稱取15 mg 核桃氧化蛋白加入5 mL Tris-Gly-8 mol·L-1Urea 緩沖液中，使用漩渦振蕩儀，在高速模式下振蕩分散，加入50 μL DTNB 溶液（4 mg·mL-1），迅速混勻，室溫靜置1 h，以緩沖液為空白對照，測定其吸光度A412。

1.4.7 表面疏水性的測定

采用ANS 熒光探針法［15］。用10 mmol·L-1、pH 7.0 的PBS 緩沖液將核桃氧化蛋白進行溶解，再加入5 mL 8 mmol·L-1的ANS 溶液，測定熒光強度（激發(fā)波長395 nm、吸收波長470 nm），以熒光強度對蛋白質(zhì)濃度作圖，曲線斜率即為蛋白質(zhì)表面疏水指數(shù)。

1.4.8 二級結(jié)構(gòu)的測定

采用傅里葉紅外光譜儀對核桃氧化蛋白進行全波段掃描，對蛋白進行結(jié)構(gòu)分析。

1.4.9 內(nèi)源熒光光譜的測定

用10 mmol·L-1、pH 7.0 的PBS 緩沖液將核桃氧化蛋白進行溶解，配制成1% 的蛋白溶液，離心（25 ℃，10 000×g，20 min），以PBS 緩沖液為空白對照，設(shè)定熒光光譜為295 nm，發(fā)射光譜為300~400 nm［16］，測定其光譜。

1.4.10 數(shù)據(jù)處理分析

核桃氧化蛋白所測指標進行3 次取平均值，使用SPSS26.0、Origin21.0進行分析繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白溶解度的影響

溶解度是指某種物質(zhì)在溶劑中的溶解程度，常常被用來表示蛋白的聚集程度。溶解度好的蛋白在加工中應(yīng)用較廣，能有效促進生產(chǎn)［17］，而核桃蛋白含有大量脂肪，溶解性較差。

測定不同氧化程度時核桃氧化蛋白的溶解度，由圖1 可見，亞油酸添加量為0 mL 時，溶解度為27.97%，當亞油酸添加量從0 mL 增加到3 mL，從4.5 mL 增加到9 mL 時，溶解度呈現(xiàn)下降趨勢，當亞油酸添加量為4.5 mL 時，溶解度上升，達到最大值，為45.81%，此時核桃氧化蛋白溶解性最好。在低亞油酸濃度氧化時，核桃氧化蛋白內(nèi)部形成可溶性聚集物，溶解度有所提高，隨著氧化程度的加深，可溶性聚集物通過共價互聯(lián)轉(zhuǎn)為不可溶聚集物，溶解度明顯下降［18］。

2.2 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白粒徑的影響

蛋白質(zhì)粒徑大小是反映聚集程度的一個關(guān)鍵指標［19］，與其在體系中的穩(wěn)定性緊密聯(lián)系［20］。如圖2 所示，亞油酸添加量為0 mL 時，粒徑最大，亞油酸添加量為3 mL 時，粒度分布向小的方向發(fā)生偏移，亞油酸添加量為4.5、7.5 mL 時，粒度分布均向大的方向偏移，亞油酸添加量為9 mL 時，粒度分布又向小的方向發(fā)生偏移。這種情況的出現(xiàn)，是因為核桃蛋白質(zhì)在氧化反應(yīng)后，內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)被破壞、展開，粒徑變小；隨著反應(yīng)的進一步進行，氧化加深，暴露的疏水基團開始聚集，生成可溶性聚集體，大于原來的疏水基團，粒徑變大；在氧化進行到最后階段時，又生成不可溶性聚集體，基團之間互相分開，相應(yīng)的可溶性部分的粒徑減?。?1］。

圖2 不同亞油酸添加量對核桃氧化蛋白粒徑的影響Fig.2 Effects of various added amounts of linoleic acid on particle sizes of walnut oxidized protein

2.3 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白電位的影響

Zeta 電位是指剪切面的電位，是粒子間的相互作用造成的。Zeta電位可以反映蛋白表面所帶正負電荷的情況，與蛋白中氨基酸殘基的離子化有關(guān)［22］。帶電性的大小是表達蛋白分子穩(wěn)定性的重要基礎(chǔ)，Zeta 電位的絕對值越高，說明此時體系不易受外界影響，越穩(wěn)定［5］。

如圖3 所示，在亞油酸添加量不同的樣品中，電位值均為負值，表明在核桃氧化蛋白中，存在較多的帶負電荷的氨基酸。亞油酸添加量為0 mL 時，Zeta電位絕對值為6.71 mV，添加亞油酸后，核桃氧化蛋白電位絕對值先增大，在亞油酸添加量為3 mL時為最大值16.73 mV，說明此時體系最穩(wěn)定，隨著氧化的進一步加深，核桃氧化蛋白電位絕對值逐漸變小，吸引力的作用力明顯超過了排斥力的作用力，核桃蛋白體系的分散被破壞，發(fā)生凝聚現(xiàn)象。

圖3 不同亞油酸添加量對核桃氧化蛋白Zeta 電位的影響Fig.3 Effects of various added amounts of linoleic acid on Zeta potential of walnut oxidized protein

2.4 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白巰基含量的影響

常見的蛋白質(zhì)中通常都含有豐富的半胱氨酸，且以巰基的形式存在，巰基極易被氧化，氧化后其共價鍵會被破壞，生成新的二硫鍵，導致巰基含量下降，對蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響［23］，通?？梢杂脕碛^察蛋白質(zhì)的氧化程度。

如圖4 所示，巰基含量隨著亞油酸添加量的增加呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，從75.58 μmol·g-1下降到41.90 μmol·g-1。這種情況的出現(xiàn)，可能是因為氧化作用造成蛋白質(zhì)的變性以及二硫鍵的生成，并且隨著氧化的加深，多肽分子會繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)，進一步形成其他物質(zhì)如磺酸類或者其他產(chǎn)物，使得巰基含量進一步降低［24］。

圖4 不同亞油酸添加量對核桃氧化蛋白巰基含量的影響Fig.4 Effects of various added amounts of linoleic acid on sulfhydryl content of walnut oxidized protein

2.5 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白表面疏水性的影響

蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性大多依賴于分子內(nèi)部的疏水基團，表面疏水性可以反映其氧化程度，同時在評價蛋白質(zhì)理化性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)變化方面也有著至關(guān)重要的作用［25］。

核桃氧化蛋白表面疏水性受亞油酸不同添加量的影響如圖5 所示，隨著亞油酸添加量的增加，表面疏水指數(shù)呈現(xiàn)先增加而后降低的趨勢，亞油酸添加量為0 mL 時，疏水指數(shù)為19.29，亞油酸添加量為3 mL 時，疏水指數(shù)達到最大，為52.33。這主要是由于在脂肪氧合酶催化亞油酸的體系中，氧化作用改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，隨著亞油酸的增多，即氧化程度的加深，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團開始暴露于空氣中，并且開始相互作用產(chǎn)生反應(yīng)，形成聚集體，疏水指數(shù)降低；或者是由于氧化使得蛋白結(jié)構(gòu)展開，又發(fā)生了重新聚集，在此過程中疏水基團嵌入，有新的親水基團形成，疏水指數(shù)下降［26］。

圖5 不同亞油酸添加量對核桃氧化蛋白表面疏水性的影響Fig.5 Effects of various added amounts of linoleic acid on surface hydrophobicity of walnut oxidized protein

2.6 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

紅外光譜是一項具有測定所需樣品少、無損、分辨率高、操作簡單等優(yōu)點的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于定性定量分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)［27］。酰胺Ⅰ帶（1600~1700 cm-1）是主要表達C=O 的伸縮振動，以及它與NH 彎曲振動（酰胺II 帶）、C-N 伸縮振動（酰胺III帶）的偶合關(guān)系，然而伸縮振動的頻率大小如何，主要還是依賴于C=O 和NH 之間的氫鍵特性，因此常常通過觀察酰胺Ⅰ帶的圖譜趨勢，來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化［28］。

由圖6 中可以看出，不同亞油酸添加量下核桃氧化蛋白的紅外光譜圖變化趨勢并無太大差異，對酰胺Ⅰ帶進行二階求導，可以得到各個特征峰［29］，其中1614~1643 cm-1、1678~1685 cm-1處為β-折疊；1643~1651 cm-1處為無規(guī)則卷曲；1651~1664 cm-1處為α-螺旋；1664~1678 cm-1、1685~1700 cm-1處為β-轉(zhuǎn)角。

圖6 不同亞油酸添加量在酰胺Ⅰ帶處圖譜Fig.6 The spectra of different linoleic acid additions at the amide I band

由圖7 可見，加入3 mL 亞油酸時，酰胺Ⅰ帶最高峰位在波長1654.8 cm-1處，當亞油酸添加量大于4.5 mL 時，酰胺Ⅰ帶最高峰位向低波長處發(fā)生移動，均到了1652.9 cm-1處，這說明核桃蛋白在脂肪氧合酶的影響下，結(jié)構(gòu)開始不穩(wěn)定，原來的結(jié)構(gòu)受到破壞，被解離，氫鍵的作用逐漸加強，電子云密度降低，使得酰胺Ⅰ帶的峰位開始向低波數(shù)的方向移動［30］。

圖7 不同亞油酸添加量在全波段處圖譜Fig.7 The spectra of different linoleic acid additions at the full band

2.7 蛋白質(zhì)氧化對核桃氧化蛋白內(nèi)源熒光的影響

蛋白質(zhì)本身就具有內(nèi)源熒光，根據(jù)熒光光譜可以對蛋白質(zhì)的組成以及分子構(gòu)象等進行詳細分析［31］。內(nèi)源熒光吸收波長的最大值可以用來反映蛋白質(zhì)中色氨酸殘基的相對位置和變化，也可以反映蛋白質(zhì)微環(huán)境的變化［32］，由此反應(yīng)結(jié)構(gòu)的變化。

不同亞油酸添加量對核桃氧化蛋白內(nèi)源熒光的影響如表3 所示，最大吸收波長并無明顯變化，變化范圍在323~325 nm 之間。熒光強度呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢，從155.35 降低到115.10。最大吸收波長向323 nm 處的轉(zhuǎn)移說明氧化的加深會使得蛋白之間重新聚集在一起，發(fā)生凝聚，色氨酸殘基的暴露量減小、暴露程度降低，內(nèi)部物質(zhì)轉(zhuǎn)移到了更加疏水的環(huán)境中去［33］。而內(nèi)源熒光強度的持續(xù)下降，可能是蛋白質(zhì)中的更多側(cè)鏈暴露出來，轉(zhuǎn)移到更加親水的環(huán)境中，從而引發(fā)結(jié)構(gòu)的變化［34］。

表3 不同亞油酸添加量對核桃氧化蛋白內(nèi)源熒光的影響Table3 Effects of various added amounts of linoleic acid on intrinsic fluorescence of walnut oxidized protein

3 討論

本文利用脂肪氧合酶催化亞油酸的氧化系統(tǒng)，對核桃氧化蛋白進行檢測分析，結(jié)果表明：添加亞油酸后核桃氧化蛋白溶解度與粒徑變化趨勢一致，當亞油酸添加量為0~3 mL 時，溶解度下降，粒度分布向粒徑小的方向發(fā)生偏移；當亞油酸添加量為3~7.5 mL 時，溶解度上升，粒徑變大；亞油酸添加量為9 mL 時，溶解度下降，粒度大小向粒徑小的方向偏移。隨著氧化程度加深，Zeta 電位的絕對值先增大后減小，當亞油酸添加量為3 mL 時達到最大值，此時核桃氧化蛋白最穩(wěn)定。表面疏水性呈現(xiàn)先增加而后持續(xù)降低的趨勢，當亞油酸添加量為3 mL時，疏水指數(shù)達到最大為52.33。孫領(lǐng)鴿等［35］等在蛋白質(zhì)氧化對核桃蛋白界面性質(zhì)的影響研究中，發(fā)現(xiàn)隨著氧化程度的加深，核桃蛋白粒徑分布發(fā)生轉(zhuǎn)移，低濃度的氧化使蛋白質(zhì)分子解離，粒徑變小，而過度的氧化使核桃蛋白分子結(jié)構(gòu)重新展開，暴露出的內(nèi)部分子與核桃蛋白結(jié)合形成新的聚集體，粒徑增加，表面疏水性及Zeta 電位絕對值都先增大后減小。游離巰基含量呈下降趨勢，從75.58 μmol·g-1下降到41.90 μmol·g-1，王丹丹等［36］采用不同濃度的AAPH 熱降解形成烷過氧自由基代表脂質(zhì)過氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)自由基，對核桃分離蛋白進行不同程度的氧化修飾，隨著氧化的加深，半胱氨酸的氧化還原狀態(tài)被改變，蛋白質(zhì)中巰基和二硫鍵的數(shù)量和分布被改變，巰基含量持續(xù)降低。廖鈺等［21］研究了脂肪氧合酶催化亞油酸氧化對花生蛋白結(jié)構(gòu)的影響，花生分離蛋白的熒光峰位隨著亞油酸含量的增加先增加后減小，這與我們得出的結(jié)果一致，峰位紅移表明氧化使蛋白結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部的色氨酸殘基逐漸暴露，而峰位藍移則表明進一步的氧化使蛋白重新發(fā)生聚集，色氨酸殘基暴露程度降低。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果說明核桃蛋白在經(jīng)過不同程度的氧化后，蛋白結(jié)構(gòu)均會發(fā)生變化，當亞油酸添加量為3 mL 時，抗氧化效果比較好。較低程度的氧化可以改善核桃的蛋白結(jié)構(gòu)，提高了核桃蛋白的利用率，也為如何提高核桃產(chǎn)品的貨架期奠定優(yōu)良基礎(chǔ)。近年來，核桃蛋白深受大眾喜愛，市場潛力大，對核桃蛋白進行更深入的研究，能更好的促進核桃產(chǎn)品的加工產(chǎn)業(yè)化。