靳鳳玉 趙一慕 高云 陰紫鈺 馬家樂 王凌瀟 趙云芳 鄭姣

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)病因復(fù)雜,是導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生和發(fā)展的重要病因。動脈粥樣硬化的形成是一個慢性炎癥過程,其特征是膽固醇在動脈內(nèi)膜過度沉積,從而引起不同程度的血管腔狹窄和堵塞[1, 2]。泡沫細胞的形成被認為是動脈粥樣硬化過程中最重要的細胞學(xué)改變,而巨噬細胞是泡沫細胞主要來源,因此抑制巨噬細胞泡沫化是防治動脈粥樣硬化的手段之一。白細胞分化抗原36(cluster of differentiation, CD36)是巨噬細胞攝取氧化脂蛋白的主要受體,促使巨噬細胞轉(zhuǎn)化為富含脂質(zhì)的泡沫細胞,是動脈粥樣硬化治療的重要潛在靶點。

人參為五加科人參屬植物,其味甘,微苦,具有補氣,固脫,安神,益智等功效。課題組前期對人參中分離得到的單體化學(xué)成分進行活性篩選,發(fā)現(xiàn)人參炔三醇(panaxytriol,PXT)對泡沫細胞形成具有明顯的抑制活性。目前,尚未見PXT抑制泡沫細胞形成作用及機制報道,因此本論文以抑制泡沫細胞形成為切入點,探討PXT抑制單核巨噬細胞脂質(zhì)沉積的作用機制,為其治療動脈粥樣硬化誘發(fā)的心腦血管疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

本研究所使用藥物為課題組自制。課題組前期從人參中分離得到活性化合物,經(jīng)MS、1H-NMR和13C-NMR鑒定與文獻報道人參炔三醇結(jié)構(gòu)一致,課題組鑒定其為人參炔三醇,純度>98%。用二甲基亞砜溶解后,置于-20℃冰箱儲存,實驗時用1640培養(yǎng)基溶解為所需濃度。

1.2 細胞

急性單核細胞白血病細胞(THP-1)購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心(資源編號:1101HUM-PUMC000057)。

1.3 試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基(Corning公司);0.25%胰蛋白酶(Corning公司);100×青霉素—鏈霉素混合溶液(Corning公司);胎牛血清(Corning公司);氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, oxLDL)(廣州奕源生物科技有限公司);DiI-oxLDL(廣州奕源生物科技有限公司);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)(Sigma公司);佛波酯(PMA)(Sigma公司);甲醇(天津市致遠化學(xué)試劑有限公司);脫脂奶粉(BD公司);PVDF膜(Millipore公司);ECL化學(xué)發(fā)光液(Thermo Fisher Scientific公司)。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)(NB400-105,Novus Biologicals);CD36(#14347,Cell Signaling Technology);GAPDH(60004-1-Ig,Proteintech);SRA1(ab183725,Abcam);SRB1(ab52629,Abcam);抗兔IgG-HRP二抗(#7074,Cell Signaling Technology);抗鼠IgG-HRP二抗(sc-2005,SantaCruz)。

1.4 細胞培養(yǎng)

THP-1細胞用含有10%胎牛血清,1%青霉素和鏈霉素的1640完全培養(yǎng)基,于37°C,含5% CO2體積分數(shù)的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),細胞密度達到80%～90%時需要進行傳代,傳代比例為1∶6,每3～4天傳代一次。

1.5 PMA誘導(dǎo)THP-1細胞分化及細胞毒性試驗

處于對數(shù)生長期的THP-1細胞以5×104個/mL的密度接種到96孔板,以100 nmol/L的PMA刺激48小時使其分化為巨噬細胞,設(shè)空白組(只含培養(yǎng)基)、正常組(含有細胞和培養(yǎng)基),給藥組分別給予1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L PXT,每組設(shè)6個復(fù)孔,邊緣用PBS填充,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。棄去培養(yǎng)基后,以PBS清洗一次,加入MTT溶液繼續(xù)于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4小時,之后加入150 μL DMSO,振蕩10分鐘,于490 nm波長下檢測各孔的吸光度值,并計算各組細胞存活率。

細胞存活率(%)=(實驗孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(正常組孔吸光度值-空白孔吸光度值)×100%

1.6 流式細胞術(shù)、熒光顯微成像檢測脂質(zhì)攝取

處于對數(shù)生長期的THP-1細胞以5×105個/mL的密度接種到96孔板,以100 nmol/L的PMA刺激48小時使其分化為巨噬細胞,每組設(shè)3個復(fù)孔,除正常組外,均加入50 μg/mL DiI熒光標(biāo)記氧化低密度脂蛋白(DiI-oxLDL)誘導(dǎo)泡沫細胞形成,加入不同濃度PXT(0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)共同孵育24小時,之后經(jīng)過PBS洗滌3次,利用倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞內(nèi)的DiI-oxLDL熒光,利用Image J軟件對各組細胞內(nèi)熒光強度進行定量分析。

或各孔經(jīng)清洗后胰酶消化,吹打成單細胞懸液,利用流式細胞儀分析細胞中的熒光強度。

1.7 油紅O染色測定細胞脂質(zhì)沉積

按照1.6所述方法鋪板,PMA刺激細胞分化,每組設(shè)置3個復(fù)孔,除正常組外,加入50 μg/mL oxLDL誘導(dǎo)泡沫細胞形成,不同濃度的PXT(0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)共同孵育24小時。棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基,用PBS清洗三次后,多聚甲醛固定10分鐘,再用PBS清洗3次,加入60%異丙醇進行分化,最后用油紅O染色30分鐘,對細胞內(nèi)脂質(zhì)進行染色,洗去浮色后,在光學(xué)顯微鏡下觀察各組細胞內(nèi)的紅色脂滴,確認細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況,利用Image J軟件對各組細胞內(nèi)脂滴面積進行定量分析。

1.8 Western blot檢測蛋白表達水平

處于對數(shù)生長期的THP-1細胞以1×106個/mL的密度接種到6孔板,以100 nmol/L的PMA刺激48小時使其分化為巨噬細胞,除正常組外,加入50 μg/mL oxLDL誘導(dǎo)泡沫細胞形成,同時采用不同濃度的PXT(0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)共同孵育24小時。加入細胞裂解液,使細胞完全裂解,99℃加熱變性10分鐘。采用恒壓100 V進行電泳,電轉(zhuǎn)條件為恒流400 mA,90分鐘。電轉(zhuǎn)結(jié)束后,用含5%脫脂奶粉的TBST低溫封閉90分鐘。經(jīng)TBST清洗后,進行抗體孵育,一抗4℃孵育過夜,TBST洗滌條帶,二抗孵育4小時,進行化學(xué)發(fā)光顯影,實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 PXT對THP-1單核巨噬細胞的毒性作用

與正常組相比,PXT低、中、高劑量組細胞活性均無明顯的差異,而PXT最高劑量組細胞活性明顯降低(P<0.05)(表1),因此后續(xù)實驗的給藥濃度均低于10 μmol/L。

表1 人參炔三醇對THP-1巨噬細胞存活率影響

2.2 流式細胞儀檢測細胞對DiI-oxLDL的攝取

利用DiI-oxLDL孵育PMA誘導(dǎo)后的THP-1細胞,通過檢測細胞內(nèi)DiI熒光強度,確定細胞內(nèi)脂質(zhì)含量。流式細胞熒光檢測發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組細胞中DiI-oxLDL含量顯著增加(P<0.05),與模型組比較,PXT中、高劑量組細胞內(nèi)的熒光強度顯著降低(P<0.05)(圖1,表2),表明PXT可以劑量依賴地降低細胞中脂質(zhì)含量,通過抑制巨噬細胞對脂質(zhì)的吞噬,從而抑制泡沫細胞的形成。

注:A 正常組;B 模型組;C PXT低劑量組;D PXT中劑量組;E PXT高劑量組。圖1 人參炔三醇對巨噬細胞DiI-oxLDL沉積的影響

表2 人參炔三醇對巨噬細胞DiI-oxLDL沉積的影響

2.3 熒光顯微鏡觀察細胞對DiI-oxLDL的攝取

利用倒置熒光顯微鏡觀測細胞內(nèi)DiI熒光強度,確定細胞內(nèi)脂質(zhì)含量,之后利用Image J軟件進行定量分析。細胞熒光成像結(jié)果與流式細胞檢測結(jié)果一致,與正常組比較,模型組細胞中DiI-oxLDL含量顯著增加(P<0.05),與模型組比較,PXT中、高劑量組細胞中熒光減少且具有顯著性差異(P<0.05)(圖2,表3),證實PXT可以抑制泡沫細胞的形成。

圖2 PXT對DiI-oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞脂質(zhì)攝取的影響

表3 PXT對DiI-oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞脂質(zhì)攝取的影響

2.4 油紅O染色測定泡沫細胞脂質(zhì)含量

油紅O可將細胞內(nèi)的脂質(zhì)染成紅色,利用Image J軟件對紅色脂滴進行定量分析,與正常組比較,模型組巨噬細胞內(nèi)脂滴數(shù)量明顯增加(P<0.05),而PXT能夠劑量依賴性地降低oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積(見圖3,表4)。

圖3 油紅O染色檢測PXT對THP-1脂質(zhì)沉積的影響

表4 油紅O染色檢測PXT對THP-1脂質(zhì)沉積的影響

2.5 PXT對THP-1單核巨噬細胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白表達的影響

在泡沫細胞發(fā)生的過程中,巨噬細胞通過清道夫受體CD36、SR-A1和LOX1吞噬oxLDL[3-5],通過膽固醇逆向轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白ABCA1、ABCG1、SR-B1促進脂質(zhì)的外排[6-8]。因此我們利用Western blot對脂質(zhì)吞噬和外排兩方面蛋白的表達進行研究,發(fā)現(xiàn)PXT抑制泡沫細胞形成過程中的作用靶標(biāo)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組相比,oxLDL可顯著上調(diào)清道夫受體蛋白CD36的表達水平(P<0.05),與模型組比較,PXT高劑量顯著抑制了CD36的蛋白表達水平(P<0.05)(見圖4,表5),而PXT對ABCA1、SRA1、SRB1等蛋白的表達無明顯影響。

圖4 PXT對巨噬細胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響

表5 PXT對巨噬細胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響

3 討論

近年來,動脈粥樣硬化的發(fā)病率明顯上升,由此引發(fā)的冠心病、腦卒中等心腦血管疾病成為死亡的首要原因。中醫(yī)認為,動脈粥樣硬化的發(fā)病機制與“脈痹”相吻合[9,10],故臨床中多采取益氣活血、化痰祛瘀為主要治法[11,12]。人參皂苷Rb1[13]、Rd[14]、Rg1[15]以及化合物K[16]均表現(xiàn)出良好的抗動脈粥樣硬化活性,尤其在改善動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展、抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成、延緩心血管疾病的發(fā)病等方面具有重要作用,但是人參炔醇類成分對于動脈粥樣硬化的治療活性尚未見報道。

泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的重要標(biāo)志,在動脈粥樣硬化病變中靶向干預(yù)泡沫細胞形成可能是預(yù)防和治療動脈粥樣硬化的一種有前景的方法[17]。當(dāng)巨噬細胞膽固醇流入和酯化增加而流出減少時,會導(dǎo)致泡沫細胞的形成[18,19],膽固醇穩(wěn)態(tài)的破壞可能導(dǎo)致斑塊壞死核心內(nèi)的晶體積聚,導(dǎo)致機械損傷和斑塊破裂。油紅O染色、流式細胞術(shù)均顯示oxLDL能夠誘導(dǎo)巨噬細胞分化成為泡沫細胞,致使脂質(zhì)在泡沫細胞中大量蓄積,而PXT顯示出抑制泡沫細胞中的脂質(zhì)蓄積的藥理活性。

泡沫細胞中脂質(zhì)含量的減少可能原因有兩個方面,一是膽固醇攝取減少,二是通過膽固醇逆向轉(zhuǎn)運,使細胞中膽固醇流出到細胞外[20]。為探討PXT如何影響泡沫細胞脂質(zhì)轉(zhuǎn)運過程,于是對參與膽固醇轉(zhuǎn)運的受體進行研究,研究發(fā)現(xiàn)PXT能夠抑制CD36的表達水平,而對其他脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白無顯著影響。CD36在巨噬細胞泡沫化過程中的發(fā)揮重要作用[21],其能介導(dǎo)過量的oxLDL攝取、內(nèi)化,從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。上述結(jié)果表明PXT是通過減少脂質(zhì)攝取,而不是通過促進膽固醇逆向轉(zhuǎn)運,抑制泡沫細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。

以上結(jié)果提示PXT具有抑制巨噬細胞脂質(zhì)蓄積的藥理活性,其機制可能與通過抑制CD36的表達,抑制巨噬細胞泡沫化有關(guān),具體的調(diào)控機制還需進一步研究。