■ 文｜廣東粵海飼料集團股份有限公司 鄭麗明

中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所 孔德偉 姜松

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，魚類精子的短期儲存是一種簡單而廣泛使用的技術手段，廣泛應用于各種經(jīng)濟和瀕危物種的人工繁殖。精子的短期儲存是指精子在低溫下保存數(shù)小時到數(shù)天的時間，同時精子保持其運動和受精能力的潛力。然而，精子在貯藏期間會發(fā)生表型、生理和遺傳或表觀遺傳的變化，從而影響其受精能力和后代的性能。本文綜述了鯉魚精子短期儲存的研究進展，并對影響鯉魚精子活力和受精能力的因素進行了探討。

一、鯉魚的人工孵化

1.精子和卵子的產(chǎn)生

鯉魚雄性每年每千克體重產(chǎn)生（1.9±0.2）×1012個精子，其中95%以上可以在激素誘導后獲得受精活性，精子濃度在15×109-32×109個精子/mL的范圍內(nèi)。研究表明，精子濃度值根據(jù)品種的不同而變化更大，平均值在7.9×109-19.6×109個精子/mL之間。雌性具有高繁殖力，每千克體重產(chǎn)10萬至30萬個卵。人工產(chǎn)卵期間，鯉魚的生殖力通常較低，雌性生殖力每千克體重產(chǎn)卵數(shù)量范圍從4.1萬到8.6萬個不等，卵的直徑和重量分別為1.24～1.42毫米和0.86～1.41毫克。產(chǎn)卵數(shù)量主要取決于季節(jié)、品種、年齡和魚自身條件等因素。在20～24℃溫度范圍內(nèi)，鯉魚一年可多次排精及產(chǎn)卵。

2.產(chǎn)卵刺激

在繁殖過程中，卵母細胞和精子的最終成熟是由內(nèi)源或合成激素誘導和同步的。鯉魚人工孵化的一般方法為：利用鯉魚垂體誘導精子和排卵，然后采集精子和卵子，卵子和精子的比例是1∶20萬；用孵化水活化，20℃攪拌2分鐘；去除粘性后，將受精卵轉移到適當容器中，20～22℃孵育；孵育72-96h后，將孵化出的幼蟲轉移到孵化槽中。為了短期儲存，將收集的精子用補充劑（110mMNaC l+40mMKCl+2mMCaCl2+1mMMgSO4+10mMTris,pH=8，滲透性310mOsm/kg）稀釋后，在有氧條件下保存在冰上（0～2℃），直到進一步使用。

鯉魚腦垂體（CP）是最常用的刺激最終配子成熟的因子。每毫克片劑含有5～60μg促黃體生成素（LHRH）。將CP溶解在生理鹽水（0.9%NaCl）中，并在背鰭基部和側線之間肌內(nèi)注射。雌魚的有效劑量約為3mg/kg。注射過程分兩步：首先注射約0.3～0.5mg/kg。首次給藥后12h，再次注射約2.5～2.7mg/kg。雄魚注射量約為0.5～2.0mg/kg。除CP外，鯉魚孵化場還使用GnRH類似物，包括哺乳動物LHRH-A（D-Ala6-Pro9-NET-mGnRH）和鮭魚GnRH-A（D-Arg6，Pro9-NET-sGnRH），劑量約為10μg/kg。

3.人工產(chǎn)卵授精

配子成熟后，將親魚麻醉，通過朝向尾部的溫和腹部按摩將雌性的卵母細胞收集在盤或碗中，然后可以類似地將雄性精液收集并混入卵母細胞。向精子和卵母細胞的混合物中加入適當體積的激活溶液，如孵化水或鹽溶液（45mMNaCl、5mMKCl、Tris20mM，pH=8），并用羽毛或廚房刮刀混合1-2分鐘，以激活精子活力并確保卵受精。在實驗室條件下，通常使用Bürker細胞血細胞計數(shù)器計算精子濃度，并使用顯微鏡通過目視觀察控制精子活力。授精的最佳精子稀釋度確定為10-2～10-3。研究表明，使用脫氯自來水時，每個卵母細胞的最低精子數(shù)可確保良好受精，孵化率范圍為8500至25000。受精后，卵子迅速水合和膨脹。因此，應使用含有堿性蛋白酶、全脂奶粉、白色粘土或單寧酸的溶液，在5-60分鐘內(nèi)消除受精卵的粘性。最后將卵在孵化罐（大規(guī)模生產(chǎn)）或培養(yǎng)皿、塑料碗或孵化器（實驗室）中孵育，直到幼蟲孵化。

二、鯉魚精子的短期儲存

精子短期儲存一般是將精子稀釋到一種叫做“緩沖劑”的溶液或精漿中，使精子在低溫（0～2℃）下保持數(shù)小時至數(shù)天的靜止狀態(tài)。精子短期儲存在實際生產(chǎn)和科學研究中具有廣泛應用和重要意義。例如，當雄性親魚對激素刺激的反應比雌性更快，或者雄性數(shù)量有限，或者需要在養(yǎng)魚場之間運輸精子時，精子短期儲存就會發(fā)揮作用。研究表明，精子在體外儲存過程中會發(fā)生ATP的成熟和再生，因此短期儲存有助于誘導睪丸精子、不良精子或性別逆轉精子的成熟。

當使用緩沖劑時，必須將精子以靜止狀態(tài)儲存，直到它們用于受精。由于精子在精漿中是不動的，因此精漿中的滲透壓是恒定的。在使用緩沖劑的條件下，精子受到保護，免受滲透損傷，并保持鞭毛跳動和受精能力所需的ATP來源。精子儲存期間的低溫使精子代謝保持在最低水平。然而，如果儲存時間延長，微生物污染可能會降低精子的活力和存活率。

三、影響精子短期保存的因素

1.溫度

精子與緩沖劑混合物的溫度會影響短期儲存的成功率。Ravinder等人報道了未稀釋的鯉魚精子在室溫（22℃）和低溫（2℃）下分別儲存20和84小時后完全失去了運動潛能，而在5℃的溫度條件下存儲84h后，33%的精子仍可被激活，因此，在5℃和2℃之間的溫度條件對鯉魚精子的具體作用機制值得關注。在2℃、5℃和22℃保存后，50%精子失去運動潛能的致死溫度（LT50）分別為40h、55h和2.5h。研究表明，低溫對于在孵化場短時間儲存精子是必要的，就像短期儲存在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要經(jīng)濟價值的各種物種一樣，這是因為低溫下精子代謝受到抑制，短期儲存的精子軸突跳動所需的ATP無法獲得。

2.緩沖劑

緩沖劑的化學成分、滲透性和pH值是短期儲存成功的重要因素，這些因素在精子運動信號傳導中起到重要的生理作用。緩沖劑可保護精子免受質膜、基因組（DNA和表觀基因組）、線粒體和軸突的損傷。因此，精子活力的持續(xù)時間比未稀釋保存在緩沖劑中的精子延長。

精漿成分的測定有助于優(yōu)化稀釋劑的成分。精漿含有分別負責能量代謝和精子運動信號傳導的有機物和離子成分。Na+、K+和Cl-是精漿的主要離子成分，Na+：K+的比例接近1∶1。當NaCl、KCl、葡萄糖或甘露醇的滲透壓濃度＜300mOsmol/kg時，鯉魚精子活力可以被激活，這表明精子活力啟動不需要Na+或K+離子。當精子以310mOsmol/kg滲透壓濃度儲存時，在150mMNaCl中儲存24-72h后，精子活力、速度〔曲線速度（VCL）和直線速度（VSL）〕和搏動頻率高于150mMKCl。研究顯示，在110mMNaCl、40mMKCl、2mMCaCl2、1mMMgSO4、20mMTris的稀釋液中，精子儲存效果最佳。

鯉魚精漿的pH值在7.5～8.5之間。研究表明，當環(huán)境滲透壓觸發(fā)精子運動啟動時，細胞內(nèi)的堿性pH值是激活動力蛋白 ATP酶所必需的，其值與細胞外介質（精漿、精漿擴展器或激活介質）的pH值平行變化。用110mMNaCl、40mMKCl、2mMCaCl2、1mMMgSO4、20mMTris以1:9的比例稀釋鯉魚精子，在pH值為7～9的條件下儲存72h，精子的游動百分率、游動速度（VCl或VSL）和跳動頻率均無顯著差異。研究表明，鯉魚儲存的精子在45mMNaCl、5mMKCl、20mMTris、pH7、pH8和pH9條件下被激活時顯示出相似的運動百分比，這表明，中性和堿性pH的緩沖劑均可為精子提供適當?shù)沫h(huán)境，以保護其運動潛能。

四、精子形態(tài)、生理生化的短期改變

1.短期儲存對精子形態(tài)和數(shù)量的影響

Saad等人報道了鯉魚在儲存期間異常精子的增加，并利用掃描和透射電鏡描述了短期儲存精子的幾種形態(tài)改變，這些變化包括核膜脫離、線粒體受損、鞭毛卷曲、軸突中央二重微管缺失等。在精子短期儲存期間，精子運動和速度的降低是由于質膜和線粒體的破壞，而這些質膜和線粒體調控著精子滲透壓依賴性的運動啟動和ATP依賴性的鞭毛跳動。

研究發(fā)現(xiàn)，精子在儲存過程中會出現(xiàn)精子數(shù)量下降的現(xiàn)象，其下降幅度隨稀釋比和添加量的不同而不同。體外保存8天后，1∶1稀釋的精子數(shù)量減少了22.9%，而未稀釋的精子數(shù)量減少了50.3%。稀釋成1∶1的緩沖劑大大延緩了精子濃度的降低。

2.短期儲存對精子生理生化的影響

精子質量（魚齡、產(chǎn)卵季節(jié)、光周期條件和精液收集方法）和儲存條件（溫度、氧氣可用性、稀釋劑成分、儲存時間）是精子短期儲存成功的關鍵。這些因素可以改變精子的結構和功能，導致ROS的產(chǎn)生和DNA碎片的增加。氧氣對所有活細胞都至關重要，但其代謝物ROS對精子的運動、速度、新陳代謝、活力喪失和受精潛力等功能有負面影響。在精子儲存期間，氧化應激產(chǎn)生ROS，可以損害質膜、線粒體結構和呼吸功能。細胞膜中多不飽和脂肪酸的存在使精子的精漿和核膜成為ROS的極好靶點，同時破壞DNA和蛋白質ROS誘導脂質過氧化，導致細胞膜完整性喪失，增加細胞滲透性、酶失活和抗?jié)B透性休克能力。

線粒體是魚類精子的主要能量來源，對精子的運動、完整性和受精潛力具有重要作用。魚類精子運動的激活需要線粒體分泌大量ATP，細胞內(nèi)ATP含量控制著精子運動期的持續(xù)時間。然而，沒有足夠的證據(jù)表明魚類精子在短期儲存過程中，細胞間ATP在線粒體中減少，盡管線粒體的低氧化能力、線粒體膜完整性和線粒體損傷可通過降低細胞間ATP含量來限制精子的運動周期。

五、結論及未來展望

魚類精子的短期儲存是同步人工受精配子可用性、保存高質量精子和改善低質量精子或提高水產(chǎn)養(yǎng)殖中經(jīng)濟重要或瀕危魚類人工繁殖效率的有效手段。在鯉魚中，精子可以在體外低溫下短時間儲存。儲存時間過長時，精子失去其運動潛力，其活力和ATP降低，并且精子會發(fā)生膜或基因組和表觀遺傳的改變，導致受精能力降低。當短期儲存的精子用于受精時，增加精子與卵母細胞的比例可以補償受精率的下降。