王亞 張林杰 仵楠 徐江 代海濤

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院（新疆石河子 832000）；2石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科（新疆石河子 832000）

在全球范圍內(nèi)，癌癥仍是引起死亡的主要病因。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)2020年統(tǒng)計(jì)，口腔癌每年約有37萬(wàn)新發(fā)病例和17萬(wàn)例死亡病例，較2018年統(tǒng)計(jì)呈上升趨勢(shì)［1］，口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是其中最常見的亞型。（transient receptor potential vanilloid type-2，TRPV2）是瞬時(shí)受體感受器電位香草素家族第二位成員，是鈣滲透性陽(yáng)離子通道，可被熱（> 52℃）、各種配體和機(jī)械應(yīng)力激活［2］。TRPV2 廣泛表達(dá)，已被證實(shí)在不同類型的癌癥中發(fā)揮重要作用，參與癌細(xì)胞的凋亡、增殖和轉(zhuǎn)移等［3］。另外TRPV2 可被大麻素等抗腫瘤藥物激活，進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用［4-5］。其家族成員TRPV4 已被證明在口腔牙齦瘤及OSCC 中高表達(dá)且與預(yù)后不佳相關(guān)［6-7］，但是分布最為廣泛的成員TRPV2 目前在OSCC 中的表達(dá)及所發(fā)揮的作用尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)使用免疫組織化學(xué)及Western blot 實(shí)驗(yàn)探索了TRPV2 在OSCC 中的表達(dá)水平，并探討了其與OSCC 患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。最后，還進(jìn)行了GSEA 及GO 富集分析及免疫浸潤(rùn)分析，以進(jìn)一步了解TRPV2 在OSCC發(fā)病機(jī)制中的生物學(xué)作用，以期為后期臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012-2020 年間在石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為OSCC 的石蠟包埋組織標(biāo)本129 例，另外選取配對(duì)癌旁組織50 例，依據(jù)AJCC 分期第8 版劃定TNM 分期，倫理審批號(hào)：KJX-2021-002-01。隨訪時(shí)間從手術(shù)日起，截止到2022年11月31日或死亡日期。OSCC細(xì)胞系（Cal-27、Scc-15）來自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），正?？谇唤琴|(zhì)細(xì)胞（HOK）來自北納生物。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化采用EnVision 兩步法檢測(cè)OSCC中TRPV2、巨噬細(xì)胞蛋白CD68 表達(dá)水平。由2 名中級(jí)以上職稱病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行評(píng)定，TRPV2、CD68 定位于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞漿中。細(xì)胞染色程度（未著色=0，淺黃色=1，黃色=2，棕黃色=3），陽(yáng)性細(xì)胞百分率（0%～5%=0，6%～25%=1，26%～50%=2，51%～75%=3，76%～100%=4）。根據(jù)細(xì)胞染色程度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率得分乘積計(jì)為總分：≤ 4 分標(biāo)記低表達(dá)組，> 4 分標(biāo)記高表達(dá)組。

1.2.2 Western blot 檢測(cè)將細(xì)胞在RIPA 裂解緩沖液中裂解，提取細(xì)胞總蛋白。通過SDS?PAGE 電泳將總蛋白進(jìn)行分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。抗體封閉液封閉30 min，TRPV2 抗體（1/500）4 ℃過夜孵育，室溫下二抗孵育2 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行顯影，于暗室中暴露于X 射線膠片。使用Image J 軟件測(cè)蛋白灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.2.3 生物信息學(xué)方法使用R（4.2.1）采用DE?Seq2 R 包從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取320 例OSCC 中TRPV2 的差異表達(dá)基因用于功能富集分析。使用GEOquery［2.64.2］從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載共264 例OSCC 芯片表達(dá)數(shù)據(jù)（GSE30784、GSE41613，平臺(tái)GPL570），將樣本以TRPV2表達(dá)中位數(shù)分為高低表達(dá)組，使用limma［3.52.2］進(jìn)行差異分析獲取差異基因，使用ClusteProfiler［4.4.4］包實(shí)施GO 功能分析及GSEA通路富集分析。GSEA選擇MSigDB 集合中的 c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt 作為參考基因集合。對(duì)TCGA 中OSCC 數(shù)據(jù)，使用GSVA R包（4.2.1）的ssGSEA 算法將TRPV2 與24 種免疫細(xì)胞進(jìn)行免疫浸潤(rùn)相關(guān)性分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)所有數(shù)據(jù)使用R（4.2.1）及Graphpad prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)來分析非配對(duì)樣本之間的表達(dá)水平差異。使用Pearson χ2檢驗(yàn)分析TRPV2 表達(dá)與OSCC 臨床病理特征及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)聯(lián)。經(jīng)Log-rank 檢驗(yàn)分析TRPV2 表達(dá)OSCC 患者術(shù)后總生存時(shí)間之間的關(guān)系，并構(gòu)建Kaplan Meier 生存曲線。以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRPV2表達(dá)情況免疫組化檢測(cè)TRPV2主要在胞質(zhì)及細(xì)胞膜中顯色，OSCC 組織中TRPV2 的陽(yáng)性表達(dá)率為81.4%（105/129），癌旁組織中為32.0%（16/50）（圖1A-B），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.001）。Western bolt 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在OSCC 細(xì)胞系Scc-15、Cal-27 中TRPV2 表達(dá)顯著高于口腔正常角化上皮細(xì)胞HOK，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05，圖1C-D）。

圖1 TRPV2 在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)Fig.1 Expression of TRPV2 in oral squamous cell carcinoma

2.2 TRPV2 表達(dá)與OSCC 臨床病理參數(shù)的關(guān)系結(jié)果表明TRPV2 蛋白表達(dá)與OSCC 患者的性別、年齡、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期TNM 以之間沒有明顯相關(guān)性（均P> 0.05），但與病理學(xué)分級(jí)（P=0.031，χ2=4.636）及腫瘤直徑范圍T 分期（P=0.024，χ2=5.109）有著密切關(guān)聯(lián)。見表1。

表1 TRPV2 蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Tab.1 Correlation of TRPV2 protein expression with clini?copathological parameters 例（%）

2.3 TRPV2高表達(dá)與預(yù)后不良結(jié)局相關(guān)在129例OSCC 患者中獲得118 例完整的預(yù)后隨訪信息。Log-rank 生存分析比較OSCC 中TRPV2 表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示TRPV2 高表達(dá)OSCC 者生存時(shí)間較低表達(dá)組顯著縮短，TRPV2 高表達(dá)OSCC患者預(yù)后不佳（P=0.015，HR=2.697，圖2）。

圖2 TRPV2 蛋白表達(dá)與OSCC 患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)Fig.2 Association of TRPV2 protein expression with the prognosis of OSCC patients

2.4 GO 及GSEA 信號(hào)通路分析GSEA 通路富集發(fā)現(xiàn)TRPV2 在OSCC 中主要參與細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用、PI3K/AKT、橫紋肌收縮途徑、Sarscov 2 參與的免疫反應(yīng)、同種異體移植排斥反應(yīng)等通路（圖3A、3B），GO 富集分析主要在白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、T 細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)、淋巴細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)、質(zhì)膜外側(cè)及免疫受體活性等（圖3C、3D）。

圖3 OSCC 中TRPV2 富集分析Fig.3 TRPV2 enrichment analysis in OSCC

2.5 TRPV2 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性GO及GSEA 富集分析發(fā)現(xiàn)TRPV2 與免疫反應(yīng)具有密切相關(guān)性，所以基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)研究了OSCC 中TRPV2 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系。結(jié)果顯示，TRPV2 的表達(dá)與巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、輔助型T細(xì)胞1、T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞這5 種免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈強(qiáng)正相關(guān)（R> 0.6，P< 0.001，圖4A）。進(jìn)一步探索OSCC 中TRPV2 表達(dá)對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，將TRPV2 mRNA 依據(jù)中位數(shù)分為高、低表達(dá)組，以探究免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述5 種具有強(qiáng)相關(guān)的免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平具有顯著性差異（圖4B）。結(jié)果還表明，TRPV2 表達(dá)與NK CD56 bright cells、效應(yīng)記憶T 細(xì)胞、Tgd 這三種細(xì)胞不相關(guān)。

圖4 TRPV2 的表達(dá)與24 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系Fig.4 Relationship between TRPV2 expression and the infiltration of 24 immune cells

圖5 TRPV2 及CD68 的表達(dá)Fig.5 TRPV2 and CD68 expression

2.6 TRPV2與巨噬細(xì)胞免疫浸潤(rùn)的關(guān)系通過對(duì)90 例同一OSCC 組織進(jìn)行免疫組化驗(yàn)證，結(jié)果提示TRPV2 高表達(dá)伴隨高的巨噬細(xì)胞蛋白CD68 浸潤(rùn)表達(dá)水平，差異分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（R=0.562，P< 0.001）。

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)TRPV2 可以作為大麻二酚等抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)，而且在順鉑藥物治療方面發(fā)揮重要作用，可以作為順鉑耐藥性的潛在靶標(biāo)。據(jù)報(bào)道，大麻二酚可以通過調(diào)控TRPV2 對(duì)子宮內(nèi)膜癌［8］，肺癌［9］、乳腺癌［10］、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［11］等發(fā)揮抑癌作用。此外，子宮內(nèi)膜癌中TRPV2 高表達(dá)且增加對(duì)順鉑的化學(xué)敏感性［8］，在非小細(xì)胞肺癌中TRPV2 高表達(dá)可以降低順鉑耐藥性［9］，但在胃癌TRPV2 高表達(dá)可以加強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性且其表達(dá)與順鉑敏感性呈負(fù)相關(guān)［12］。基于目前的研究，將TRPV2 列入了重要的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)TRPV2 可以作為OSCC 個(gè)性化治療靶點(diǎn)的良好候選者。

本研究從細(xì)胞及組織學(xué)水平分別證實(shí)TRPV2在OSCC 中較鄰近正常組織中顯著高表達(dá)，與目前研究發(fā)現(xiàn)一致。TRPV2 蛋白在各種類型的癌癥中高度表達(dá)，包括：胃癌［12］、子宮內(nèi)膜癌［8］、非小細(xì)胞肺癌［9］、乳腺癌［10］、食管鱗狀細(xì)胞癌［13］。這些結(jié)果表明，TRPV2 有可能成為OSCC 的診斷標(biāo)志物。此外，我們還發(fā)現(xiàn)TRPV2 與OSCC T 分期及組織學(xué)分級(jí)具有相關(guān)性，進(jìn)一步支持TRPV2 的表達(dá)可能與OSCC 的惡性程度有關(guān)。MARINELLI 等［8］證實(shí)子宮內(nèi)膜癌中TRPV2 的表達(dá)隨著腫瘤組織的惡性程度而增加，GUéGUINOU 等［14］證實(shí)RPV2 在乳腺癌中高表達(dá)且與腫瘤組織學(xué)分級(jí)關(guān)，與G0-1 組織相比，TRPV2 在G2-3 乳腺癌組織相中高表達(dá)。這與本研究具有一致性，TRPV2 在多數(shù)腫瘤中與腫瘤組織學(xué)分級(jí)具有相關(guān)性。

目前研究表明，TRPV2 高表達(dá)是各種腫瘤的不良預(yù)后生物標(biāo)志物，所以實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析TRPV2表達(dá)與OSCC 預(yù)后的關(guān)系，在112 例隨訪的OSCC患者中發(fā)現(xiàn)，TRPV2 高表達(dá)患者的生存期顯著縮短，預(yù)后不佳。另有多項(xiàng)研究都表明TRPV2 與預(yù)后密切相關(guān)，包括在子宮內(nèi)膜癌，肺癌、乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、消化系統(tǒng)腫瘤、血液腫瘤［8-15］等都發(fā)現(xiàn)TRPV2 高表達(dá)患者預(yù)后不佳。這與本研究結(jié)果相同，證明了TRPV2 是OSCC 中具有預(yù)后價(jià)值的新型生物標(biāo)志物。

TRPV2 作為調(diào)節(jié)Ca2+通道的因子，在導(dǎo)致腫瘤發(fā)展的各種生物學(xué)功能如遷移、侵襲及增殖凋亡方面發(fā)揮重要作用。但目前尚無研究發(fā)現(xiàn)TRPV2在OSCC 中所具體發(fā)揮的作用機(jī)制，所以本實(shí)驗(yàn)使用生物信息學(xué)方法探索TRPV2 在OSCC 中的作用機(jī)制。富集分析發(fā)現(xiàn)TRPV2 在OSCC 主要參與PI3K/AKT、橫紋肌收縮途徑、SARS?Cov?2 免疫反應(yīng)、同種異體移植排斥反應(yīng)、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體相互作用等通路。目前實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，TRPV2可通過PI3K/AKT/途徑促進(jìn)食管鱗癌的腫瘤形成和轉(zhuǎn)移及乳腺癌的遷移［13-14］。另外，在IWATA等［16］的研究中通過產(chǎn)生中和TRPV2 的功能抗體，可以改善擴(kuò)張型心肌病和肌肉萎縮癥，這也進(jìn)一步說明了TRPV2 可能參與心臟橫紋肌的收縮。這與我們的研究相一致，但是TRPV2 是否參與其余通路目前尚沒有明確的研究，后期有望通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

目前已知可通過樹突狀細(xì)胞疫苗等免疫治療方法治療口腔鱗狀細(xì)胞癌［17］。通過生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)在OSCC 中TRPV2 與免疫反應(yīng)密切相關(guān)，包括白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、T 細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)、淋巴細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)、質(zhì)膜外側(cè)及免疫受體活性等。基于目前研究發(fā)現(xiàn)，TRPV2 發(fā)揮免疫作用主要與其傳導(dǎo)Ca2+相關(guān)，其C 端具有一個(gè)鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)（654-683），可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)外Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，而Ca2+參與免疫系統(tǒng)的激活和維持［18］，進(jìn)而發(fā)揮免疫作用。由于腫瘤微環(huán)境中不同免疫細(xì)胞發(fā)揮的作用不同，所以本實(shí)驗(yàn)基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析了OSCC 中TRPV2 表達(dá)與24 種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)TRPV2 的表達(dá)與巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及輔助型T 細(xì)胞1、T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞等免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的浸潤(rùn)水平呈強(qiáng)正相關(guān)。此外，將TRPV2 表達(dá)分為高、低表達(dá)時(shí)上述免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平具有顯著差異。通過免疫組化證明在OSCC 中TRPV2 高表達(dá)時(shí)伴隨巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)蛋白CD68 高表達(dá)，且目前研究發(fā)現(xiàn)TRPV2在巨噬細(xì)胞中呈密集陽(yáng)性表達(dá)，參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞結(jié)合及吞噬功能［19］。另外，在抗原呈遞過程中發(fā)現(xiàn)TRPV2 以協(xié)調(diào)Ca2+信號(hào)在T 細(xì)胞活化、增殖發(fā)揮效應(yīng)［20］，同時(shí)已證明TRPV2 在和B 淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞中均過表達(dá)［21-22］。上述研究結(jié)果與本研究分析結(jié)果具有高度一致性，所以TRPV2 可以通過影響巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平進(jìn)而調(diào)控OSCC 的發(fā)生發(fā)展，但腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)控具有高度復(fù)雜性，其他類型免疫細(xì)胞也可能影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。

本研究為TRPV2 在OSCC 中的所發(fā)揮的作用機(jī)制提供了全面的認(rèn)識(shí)，但仍有一定的局限性：與臨床病理及巨噬細(xì)胞的相關(guān)性研究中樣本量相對(duì)不足，隨訪時(shí)間較短等，造成實(shí)驗(yàn)可能存在一定的誤差，后期尚需擴(kuò)大樣本量及長(zhǎng)期隨訪便于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加精確。對(duì)于通路富集分析及與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性研究，是基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的分析，存在一定的不足，后期會(huì)進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。下一步研究方向是明確TRPV2 是否通過PI3/AKT通路參與調(diào)控OSCC 的表型表達(dá)等，及通過干擾TRPV2 明確其是否通過影響巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)水平進(jìn)而調(diào)控OSCC。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)TRPV2 在OSCC 中高表達(dá)，與腫瘤病理分級(jí)、T 分期具有相關(guān)性，且TRPV2高表達(dá)患者常常預(yù)后不佳。功能富集分析發(fā)現(xiàn)，TRPV2 可通過PI3K/AKT 等通路參與調(diào)控OSCC 進(jìn)展，另外，TRPV2 通過影響腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平參與免疫反應(yīng)。本研究為闡明TRPV2 在腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的潛在作用提供了前期研究基礎(chǔ)，考慮到TRPV2 可以被大麻二酚等抗腫瘤藥物作用進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用，而且TRPV2 表達(dá)與免疫反應(yīng)密切相關(guān)，使用TRPV2 進(jìn)行口腔鱗狀細(xì)胞癌靶向治療可能是一種新的研究方向。