王思懿 盧佳寧 黃慶暉

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（廣州 510140）；2呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州 510180）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）是由于氣道慢性炎癥和（或）肺泡（肺氣腫）引起的慢性呼吸道癥狀，導(dǎo)致持續(xù)的、反復(fù)惡化的氣流阻塞［1］。COPD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要的致病因素是接觸吸入性有害顆粒物，特別是煙草煙霧和污染物，影響各器官系統(tǒng)，常合并其他多種疾病［2?4］，其中抑郁癥是最常見的合并癥之一。薈萃分析研究報(bào)告也顯示抑郁癥與COPD 高度相關(guān)［5?7］。有群體研究發(fā)現(xiàn)，煙草煙霧可能導(dǎo)致抑郁加重［8?9］，吸煙的抑郁癥患者比無吸煙史的患者的癥狀及認(rèn)知功能受損程度更嚴(yán)重［5］。

臨床上，合并抑郁會(huì)導(dǎo)致COPD 患者出現(xiàn)體力耐受性下降，精神異常，社交情感障礙，氣促加重、呼吸困難等臨床表現(xiàn)，患者治療依從性更低，治療效果以及生活質(zhì)量也嚴(yán)重受到影響，住院率和病死率因此上升［5，7，10］。因此，在COPD 發(fā)生發(fā)展的過程中可能伴隨著抑郁，或者COPD 的發(fā)病誘導(dǎo)了抑郁的發(fā)生，而抑郁又可加重COPD。兩者相互影響，相互促進(jìn)，使病情不斷惡化。目前，COPD 合并抑郁的臨床意義逐漸引起重視，但其相關(guān)基礎(chǔ)研究較少，COPD 合并抑郁的病理生物學(xué)機(jī)制也尚不清楚。為了繼續(xù)深入開展相關(guān)研究，尋找合適的動(dòng)物模型對(duì)于探究COPD 合并抑郁的復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。本研究在構(gòu)建COPD 小鼠模型的基礎(chǔ)上，以行為學(xué)結(jié)果為判斷依據(jù)，探究單純的煙草煙霧慢性暴露誘導(dǎo)的COPD 小鼠模型是否合并發(fā)生了抑郁，為將來COPD 合并抑郁的基礎(chǔ)研究提供一個(gè)新的模型選擇思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性8～10 周齡的SPF 級(jí)C57 BL/6J 小鼠，浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（浙）2019?0001。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組（CTL 組）、熏煙組（CS 組），每組10 只，每天定時(shí)添加糧食和水。觀察各組小鼠呼吸、毛發(fā)、活動(dòng)量、食量、體質(zhì)量等情況。動(dòng)物飼養(yǎng)室為清潔級(jí)，溫度（22～24 ℃）和12/12 h 光/暗循環(huán)。該研究中動(dòng)物使用及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（編號(hào)：GY2018?010），嚴(yán)格按照國(guó)家衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》執(zhí)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料紅梅牌香煙，焦油量11 mg，煙氣煙堿量0.9 mg；5?HT 試劑盒，Elabscience，E?EL?0033c；IL?6 試劑盒，ThermoFisher，88?7064?88；Mouse CXCL1/KC ELISA試劑盒，Catalog NO.DY452；熏煙箱、行為學(xué)所用設(shè)備，廣州醫(yī)科大學(xué)自制；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)，EthoVision XT 14；小動(dòng)物肺功能儀，美國(guó)Buxco 公司。

1.3 建立模型將CS 組小鼠置于熏煙箱內(nèi)，連續(xù)暴露于煙草煙霧中建立COPD模型：香煙9支/次，上午、下午各2 次，2 h/次，每1 小時(shí)至少換氣20 min，上下午至少間隔休息3 h，6 d/周。每天煙霧暴露結(jié)束后，CS 組和CTL 組小鼠置于同一飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。每周稱重1 次。24 周后造模結(jié)束。

1.4 肺功能檢測(cè)和行為學(xué)測(cè)試行為測(cè)試在最后一次煙草煙霧暴露24 h 后進(jìn)行。行為學(xué)測(cè)試后，分別檢測(cè)CTL 組和CS 組小鼠的肺功能，驗(yàn)證COPD 模型的建立；心尖采集血液樣本，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）和肺組織、腦組織供進(jìn)一步研究。

1.4.1 曠場(chǎng)測(cè)試在行為學(xué)研究中往往用來做對(duì)照，以反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)行為?？梢詫?duì)動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)、探索行為及焦慮、抑郁狀態(tài)進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。測(cè)試在上午安靜房間內(nèi)進(jìn)行。儀器敞口且四周與底部封閉，40 cm × 40 cm × 40 cm，中心區(qū)域劃分為中間20 cm × 20 cm 區(qū)域。每只小鼠單獨(dú)測(cè)試，統(tǒng)計(jì)5 min 內(nèi)小鼠的各類活動(dòng)行為。

1.4.2 懸尾測(cè)試將膠帶粘在老鼠尾巴末端1 cm處進(jìn)行固定，使其頭部向下懸掛，距離地面40 cm。攝像設(shè)備記錄6 min，統(tǒng)計(jì)小鼠最后4 min 的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。小鼠間斷性不動(dòng)、四肢細(xì)微抖動(dòng)也判定為相對(duì)靜止不動(dòng)的狀態(tài)，并將其時(shí)間段納入統(tǒng)計(jì)。

1.4.3 肺功能檢測(cè)測(cè)試結(jié)束后的第2 天進(jìn)行肺功能測(cè)試。小鼠腹腔注射1.2%阿佛丁，按體質(zhì)量計(jì)算用量，0.2 mL/10 g，進(jìn)行麻醉。暴露小鼠頸部中心氣管，對(duì)其鈍性分離并切開一個(gè)小口后插入連接三通開關(guān)的氣管插管，小鼠處于仰臥位狀態(tài)置于肺功能儀中，記錄各項(xiàng)參數(shù)值。

1.5 處理血清和BALF肺功能檢測(cè)完成后，立馬心臟采血0.7 mL 左右，室溫下靜置2 h，4 ℃3 000 r/min 離心15 min，取上清液，?80 ℃保存待測(cè)。嚴(yán)格按照5?HT 試劑盒說明書檢測(cè)小鼠血清中5?羥色胺（5?hydroxytryptamine，5?HT）的含量表達(dá)水平。暴露小鼠氣管后，插管連接1 mL 針筒勻速注入0.6 mL 生理鹽水，沖洗BALF 并盡可能多地抽回收集，反復(fù)6 次，前后3 次各自合并收集在一個(gè)EP 管里。4 ℃ 1 000 r/min 離心10 min，取上清液于?80 ℃保存，待檢測(cè)BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平變化。

1.6 組織病理學(xué)分析取出完整的腦組織和右肺，生理鹽水清洗后置于組織固定液中固定24 h后進(jìn)行脫水、包埋、切片制作石蠟切片。石蠟切片脫蠟后，肺組織石蠟切片進(jìn)行蘇木精?伊紅（H&E）染色，腦組織石蠟切片進(jìn)行尼氏染色。

1.6.1 鏡下觀察通過鏡下觀察與拍照小鼠肺部結(jié)構(gòu)變化和炎癥浸潤(rùn)程度，并隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)算肺泡平均截距。

1.6.2 尼氏染色是用堿性染料染神經(jīng)組織的一種方法，尼氏體是胞質(zhì)內(nèi)的一種嗜堿性物質(zhì)，廣泛分布于各種神經(jīng)元中，用來觀察神經(jīng)元內(nèi)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，了解神經(jīng)元的損傷情況。鏡下觀察神經(jīng)元數(shù)量及形態(tài)，采集后用Image?ProPlus 8.0 分析軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用GraphPad Prism 8.0 軟件統(tǒng)計(jì)與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并作圖。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 煙草煙霧暴露誘導(dǎo)小鼠體重長(zhǎng)勢(shì)緩慢與CTL 組相比，CS 組體質(zhì)量增長(zhǎng)更緩慢（P< 0.001），見圖1A；整個(gè)造模過程，CTL 組小鼠體重增加量大于CS 組（P< 0.001），見圖1B。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化Fig.1 Changes in body weight in mice

2.2 煙草煙霧暴露誘導(dǎo)小鼠肺功能下降通過肺功能測(cè)試來評(píng)估COPD 小鼠模型是否構(gòu)建成功。CS組的功能殘氣量（FRC）、用力肺活量（FVC）均大于CTL 組（P< 0.001），見圖2A?B；CTL 組的20 毫秒率（FEV20/FVC）和50 毫秒率（FEV50/FVC）均大于CS 組（P< 0.05），見圖2C?D。肺功能結(jié)果符合COPD 小鼠典型表現(xiàn)。

圖2 CS 暴露對(duì)肺功能的影響Fig.2 Effects of tobacco smoke exposure on lung function

2.3 煙草煙霧暴露誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)肺氣腫及氣道炎癥CTL 組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁正常，肺泡間隔未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無明顯病理性損傷改變。CS 組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡大小不一，肺泡間隔斷裂，肺泡融合，肺泡腔擴(kuò)大，肺泡間隔及肺泡腔內(nèi)有較多的炎性細(xì)胞，為典型COPD病理學(xué)損傷性改變，見圖3A。與CTL 組相比，CS組小鼠支氣管管壁增厚，管腔變窄，氣道上皮細(xì)胞受損脫落，黏膜下及管壁均可見較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖3B。平均肺泡截距統(tǒng)計(jì)顯示，CS 組小鼠平均肺泡截距較CTL 組小鼠明顯增大（P< 0.001），見圖3C。

圖3 CS 暴露對(duì)小鼠肺泡及氣道的影響（HE，200 ×）Fig.3 Effects of tobacco smoke exposure on alveoli and airway in mice（HE，200 ×）

2.4 煙草煙霧暴露誘導(dǎo)小鼠BALF 中炎癥因子增加CS 組BALF 中IL?6（P< 0.01）和KC（P< 0.001）含量均高于CTL 組，見圖4。

圖4 CS 暴露對(duì)小鼠BALF 中炎癥因子表達(dá)的影響Fig.4 Effect of tobacco smoke exposure on expression of inflammatory cytokines in BALF in mice

2.5 煙草煙霧暴露誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)抑郁樣表現(xiàn)曠場(chǎng)測(cè)試中，CS組運(yùn)動(dòng)總路程、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間均小于CTL 組（P< 0.05），見圖5A?C；懸尾測(cè)試中，CS組不動(dòng)時(shí)間大于CTL組（P< 0.05），見圖5D。CS 組血清中5?HT 水平低于CTL 組（P<0.001），見圖5E。

圖5 CS 暴露對(duì)行為學(xué)及血清中5?HT 水平的影響Fig.5 Effects of tobacco smoke exposure on behavioral and 5?HT levels in serum

2.6 煙草煙霧暴露誘導(dǎo)小鼠腦組織出現(xiàn)病理改變腦組織尼氏染色結(jié)果顯示，CTL 組神經(jīng)細(xì)胞保留原有形態(tài)，細(xì)胞核充實(shí)飽滿，核仁清晰可見，呈圓形或橢圓形，CS 組神經(jīng)細(xì)胞空泡化，細(xì)胞核消失，神經(jīng)元固縮，著色變深，見圖6A?B；與CTL 組相比，CS 組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元損傷增加，見圖6A?B；CS 組大腦皮質(zhì)受損神經(jīng)元數(shù)/神經(jīng)元總數(shù)大于CTL 組（P< 0.001），見圖6C；CS 組海馬CA3 區(qū)受損神經(jīng)元數(shù)/神經(jīng)元總數(shù)大于CTL 組（P< 0.01），見圖6D。

圖6 CS 暴露對(duì)腦組織及細(xì)胞的影響（尼氏染色，400 ×）Fig.6 Effects of tobacco smoke exposure on brain tissue and cells（Nissl staining，400 ×）

3 討論

抑郁癥作為一種常見的危及生命的精神疾病，是社會(huì)的巨大負(fù)擔(dān)［6］。近年來各方面的壓力及其他因素導(dǎo)致抑郁癥發(fā)病率逐年上升，預(yù)計(jì)到2030 年抑郁癥將成為世界第一負(fù)擔(dān)疾?。?1］。抑郁癥是COPD 患者普遍存在的心理健康問題，也是COPD 病情進(jìn)展甚至惡化的危險(xiǎn)因素之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，導(dǎo)致COPD 病死率不斷上升［12］。煙草煙霧在COPD 和抑郁的發(fā)生發(fā)展中占主導(dǎo)地位［13］。多項(xiàng)研究表明，伴有抑郁病史的COPD 患者身體機(jī)能較差，健康狀況受損嚴(yán)重，急性加重的情況更為多見［10］。2022 年一項(xiàng)基于英國(guó)人群的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與無COPD 的受試者相比（5.7；95%CI：5.5～5.8），每年COPD 患者每1 000 人的抑郁癥發(fā)病率更高（11.4；95%CI：10.9～11.8）（P<0.001）［14］。建立合格的COPD 合并抑郁小鼠模型是研究成功的第一步。

既往研究采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)行為、反映動(dòng)物活動(dòng)度情況及對(duì)新環(huán)境的探索欲，這兩個(gè)測(cè)試均為抑郁癥研究最常用的行為學(xué)測(cè)試，作為抑郁證模型是否成模的判斷方法。以小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)靜止不動(dòng)時(shí)間增加與曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)總路程、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)、中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間降低為判斷造模成功的主要依據(jù)［15?16］。本研究結(jié)果顯示，煙草煙霧慢性暴露影響了小鼠的行為學(xué)特性，小鼠對(duì)環(huán)境的探索欲和活動(dòng)能力顯著降低，靜止不動(dòng)時(shí)間增加，反映了行為絕望狀態(tài)的增加，與臨床上的抑郁癥表現(xiàn)相似［14，17］。小鼠腦組織的病理切片結(jié)果顯示，CS 組小鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)受損的神經(jīng)元數(shù)量顯著增加，說明煙草煙霧引起皮質(zhì)和海馬區(qū)損傷［18］。單胺遞質(zhì)不足是抑郁癥發(fā)病的原因之一［19-20］，因此5?HT 常作為抑郁癥評(píng)價(jià)的研究指標(biāo)之一。本研究檢測(cè)到煙草煙霧暴露后顯著降低了小鼠血清中5?HT 含量水平，輔助證明了COPD小鼠合并抑郁的發(fā)生。長(zhǎng)期的煙草煙霧暴露可誘發(fā)COPD 慢性全身性炎癥，肺功能下降，增加體內(nèi)炎癥因子水平。本研究結(jié)果顯示，相較于CTL 組，CS 組小鼠的FRC、FVC 上升，20 毫秒率、50 毫秒率降低，表現(xiàn)出肺部炎癥加重，支氣管及其周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多，肺組織肺泡間隙增加，血清中促炎細(xì)胞因子IL?6、KC 含量水平升高。以上表征說明，單純的煙草煙霧慢性暴露成功誘導(dǎo)了小鼠慢性阻塞性肺疾病模型，并且在此過程小鼠合并發(fā)生了抑郁。

有研究［21］建立COPD 合并抑郁障礙大鼠模型采取多因素造模法：在第1、14 天氣管內(nèi)滴注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），其余26 d 每天煙霧暴露1 h，每天熏煙后隨機(jī)給予一種應(yīng)激刺激。LPS在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常被廣泛用來構(gòu)建抑郁模型［22-23］，引起中樞的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，炎性細(xì)胞因子的升高，小鼠抑郁樣行為和認(rèn)知改變，因此LPS 本身也被視作是抑郁癥的致病因素之一［24-26］，這就造成與臨床COPD 合并抑郁的成因不符。本研究選擇單因素的造模方式，是構(gòu)建小鼠COPD 模型的經(jīng)典方法，但通過該法發(fā)現(xiàn)，單純煙草煙霧慢性暴露建立COPD小鼠模型，證實(shí)了在COPD造模過程中，合并抑郁的發(fā)生，排除了LPS 及其他應(yīng)激刺激的干擾，設(shè)計(jì)更為合理，較好模擬了臨床上COPD 合并抑郁的主要發(fā)病因素和臨床特征［27-31］。雖然單因素造模的干擾項(xiàng)少，但實(shí)驗(yàn)時(shí)間跨度較長(zhǎng)，造模過程中偶有死亡等意外情況發(fā)生，為了減少影響，在保證動(dòng)物數(shù)量達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基礎(chǔ)上，可以考慮增加動(dòng)物的數(shù)量，并探索更科學(xué)、更全面的新技術(shù)進(jìn)行方法學(xué)改良，為以后COPD 合并抑郁的機(jī)制研究提供更好的選擇與依據(jù)。

綜上所述，單純的煙草煙霧慢性暴露誘導(dǎo)的COPD 小鼠模型在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中合并發(fā)生了抑郁，由此推斷，該模型可以作為COPD 合并抑郁研究合理的動(dòng)物模型備選方案之一。此外，本研究?jī)H僅討論了煙草煙霧誘導(dǎo)COPD 小鼠合并抑郁模型的建立以及小鼠腦中神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生改變，煙草煙霧對(duì)小鼠腦組織產(chǎn)生影響的具體機(jī)制、細(xì)胞分子水平的作用靶點(diǎn)等方面尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。