李雯雯 杜蒙 王曉軍 孫允超

摘 要：本研究建立了基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）的磺胺類獸藥殘留分析方法。方法學(xué)考察表明，11種磺胺類獸藥殘留在10～200 μg·L-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；方法檢出限為0.84～1.62 μg·kg-1，方法定量限為2.8～5.4 μg·kg-1；在3個濃度水平下，目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率為74.5%～109.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.09%～8.12%。該方法可用于動物源食品中多種磺胺類獸藥殘留的定性、定量分析及篩查。

關(guān)鍵詞：磺胺類獸藥殘留；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)；分析篩查

Abstract： In this study， a method for the analysis of sulfa veterinary drug residues based on ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was established. Methodological investigation showed that the residues of 11 sulfonamides showed a good linear relationship in the range of 10～200 μg·L-1. The limits of detection were 0.84～1.62 μg·kg-1， and the limits of quantification were 2.8～5.4 μg·kg-1. The recoveries were 74.5%～109.9% and the relative standard deviations were 0.09%～8.12% at the three concentration levels. The method is suitable for qualitative and quantitative analysis and screening of various sulfonamides veterinary drug residues in animal derived food.

Keywords： sulfonamides veterinary drug residues; ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; analysis and screening

磺胺類藥物是一類以對氨基苯磺酰胺為基本母核結(jié)構(gòu)的化學(xué)合成抗菌藥物，具有廣譜、高效、價低等特點(diǎn)，在畜禽養(yǎng)殖過程中，為預(yù)防和控制疾病，常被添加到飼料中使用[1]。但磺胺類藥物在人體中代謝時間較長，易在人體內(nèi)蓄積。隨著近年來獸藥的大量使用，甚至濫用和誤用，出現(xiàn)了耐藥性、藥物殘留過高、部分人群過敏中毒等問題。動物源食品中的磺胺類藥物殘留逐漸引起人們的重視，從2005年起，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對動物產(chǎn)品中的磺胺類藥物殘留進(jìn)行重點(diǎn)管控。2022年9月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了第594號公告，發(fā)布了《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中41種獸藥最大殘留限量》（GB 31650.1—2022）[2]，對磺胺類藥物（總量）和磺胺二甲嘧啶的最大殘留量分別進(jìn)行了補(bǔ)充。與此同時，磺胺類藥物殘留的檢測技術(shù)逐步更新。傳統(tǒng)的磺胺類獸藥殘留檢測方法包括液相色譜質(zhì)譜法、液相色譜法、酶聯(lián)免疫分析法和熒光分析法，其中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因靈敏度高、準(zhǔn)確度好、高通量等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動物源食品中的獸藥多殘留檢測分析[3-4]。

本研究擬建立11種磺胺類獸藥殘留的液相色譜質(zhì)譜檢測技術(shù)，通過對質(zhì)譜的檢測參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和方法學(xué)評估，形成一種高效、精確的磺胺類獸藥殘留分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲惡唑、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲異惡唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶和磺胺間二甲氧嘧啶，均購于壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；Knorth HLB固相萃取柱，北京科德諾思技術(shù)有限公司；豬肉，購自聊城華盛超市；HPLC甲醇、HPLC乙腈，美國Fisher Scientific公司；超純水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple Quad 5500+超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜，AB SCIEX公司；氮吹濃縮儀，廣州得泰儀器科技有限公司；冷凍離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司；渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和工作液

將11種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品（100 mg·L-1）分別移取100 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到1 mg·L-1的磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液；稱?。?.00±0.02）g不含11種獸藥殘留的空白豬肉樣品，提取和凈化，得到空白基質(zhì)溶液；混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋，分別得到10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、150 μg·L-1和200 μg·L-1的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于繪制基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線。

1.3.2 上機(jī)溶液制備

取豬肉樣品，絞碎并均質(zhì)，稱取試樣（1.00±0.02）g，加入Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，渦旋振蕩、超聲、離心，取上清液，殘渣用磷酸鹽緩沖液重復(fù)提取，合并兩次上清液備用；采用Knorth HLB固相萃取柱對上清液進(jìn)行凈化和洗脫，洗脫液渦旋混勻、氮吹至干，用10%甲醇-10%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）復(fù)溶過膜，得到待上機(jī)樣品溶液。

1.3.3 儀器檢測條件

（1）色譜條件。Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱，柱溫35 ℃，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量1 μL，流動相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動相B為含0.1%甲酸的甲醇∶乙腈（2∶8，體積比）溶液，洗脫方式為梯度洗脫，見表1。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓為正離子模式（ESI+）5 500 V；離子源溫度350 ℃，氣簾氣（Curtain gas）35 psi，離子源氣體1（Gas Ⅰ）和氣體2（Gas Ⅱ）分別設(shè)置為50和60，檢測方式MRM。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化方法選擇

動物源食品的基質(zhì)比較復(fù)雜，易對液質(zhì)聯(lián)用的電噴霧離子化過程中形成的目標(biāo)化合物分子信號造成干擾，影響檢測靈敏度和準(zhǔn)確性。有效的基質(zhì)凈化前處理方法能減弱和消除基質(zhì)效應(yīng)。其中，固相萃取技術(shù)在動物源性食品基質(zhì)凈化領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛，能夠快速、簡便、高效地去除各類食品中的干擾基質(zhì)，達(dá)到分離和富集待測組分的目的[5]。故本試驗選擇固相萃取柱凈化樣品，通過方法學(xué)評估，能滿足磺胺類獸藥殘留的檢測需求。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化及譜圖

將200 μg·L-1的11種磺胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以針泵的方式連續(xù)進(jìn)樣，在正離子模式下，采用一級質(zhì)譜掃描（Q1 Scan）確定母離子質(zhì)荷比；采用碎片離子掃描（Product Ion Scan）確定干擾少、信噪比高的1～2個子離子，分別作為定性離子和定量離子；采用多反應(yīng)監(jiān)測掃描（Multiple Reaction Monitoring，MRM）優(yōu)化定性離子和定量離子的去簇電壓（Declustering Potential，DP）和碰撞能量（Collision Energy，CE），最終建立質(zhì)譜采集參數(shù)，結(jié)果見表2。以優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)為方法，獲得11種磺胺類化合物的總離子流圖（見圖1）和磺胺甲噁唑質(zhì)譜圖（見圖2、圖3）。

2.3 方法學(xué)評估

2.3.1 線性關(guān)系和檢出限、定量限

使用基質(zhì)空白溶液配制10～200 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以磺胺類化合物的濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，本試驗在豬肉空白基質(zhì)中加入10 μg·kg-1混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，參考章萍萍等[6]的計算方法，按試驗方法進(jìn)行6次平行試驗，計算檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差（Standard Deviation，SD）、3SD（檢出限）、10SD（定量限），結(jié)果見表3。11種磺胺類化合物在10～200 μg·L-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.994 8，檢出限為0.84～1.62 μg·kg-1，定量限為2.8～5.4 μg·kg-1，均滿足《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31658.17—2021）[7]的要求，且低于標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.2 精密度和回收率

準(zhǔn)確稱取空白基質(zhì)樣品，在低、中、高3個濃度水平下，采用優(yōu)化后的檢測方法，進(jìn)行6次平行試驗，根據(jù)結(jié)果計算回收率和精密度，用于評價方法。由表4可知，3個水平下，回收率為74.5%～109.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.09%～8.12%，本方法的回收率和精密度均符合獸藥多殘留分析要求。

3 結(jié)論

本研究建立了一種同時測定11種磺胺類化合物的UPLC-MS/MS獸藥多殘留分析方法，采用固相萃取法凈化，通過優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，用電噴霧正離子（ESI+）多反應(yīng)監(jiān)測模式對目標(biāo)化合物進(jìn)行定性定量分析。通過方法學(xué)考察評估，證明該方法靈敏、快速、高效，可以滿足實際工作需要。

參考文獻(xiàn)

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[5]季寶成，楊瀾瑞，韓雨，等.動物源性食品獸藥多殘留檢測中基質(zhì)凈化與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究進(jìn)展[J/OL].輕工學(xué)報：1-9[2023-07-20].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/41.1437.ts.20230625.0928.006.html.

[6]章萍萍，方如意，任可.動物源性食品中十三種磺胺類藥物檢測方法優(yōu)化[J].中國食品工業(yè)，2023（5）：62-66.

[7]中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，國家衛(wèi)生健康委員會，國家市場監(jiān)督管理總局.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 動物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：GB 31658.17—2021[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2021.