孫悅，趙宏晶，黃義棚，袁春營(yíng)，崔青曼

（天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱(chēng)河蟹，是中國(guó)養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物之一。稻田養(yǎng)蟹是以種植水稻以及養(yǎng)殖河蟹為目標(biāo)，充分利用自然資源，挖掘稻田的生產(chǎn)潛力，實(shí)現(xiàn)稻蟹產(chǎn)量的雙增收[1]。水稻種植過(guò)程中會(huì)使用一些農(nóng)藥，而對(duì)共生的中華絨螯蟹產(chǎn)生一定的影響。農(nóng)藥不僅破壞水體生態(tài)環(huán)境，還會(huì)影響水生生物的個(gè)體發(fā)育和繁殖，導(dǎo)致水生生物組織病理學(xué)的改變、脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和相關(guān)抗氧化酶活性改變等一系列生理變化，嚴(yán)重的還會(huì)致其死亡[2-7]。

新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑是世界上使用最廣泛的殺蟲(chóng)劑之一。它們對(duì)昆蟲(chóng)具有優(yōu)先毒性，而對(duì)脊椎動(dòng)物卻低毒性[8]。噻蟲(chóng)嗪是一種全新結(jié)構(gòu)的第二代煙堿類(lèi)高效低毒殺蟲(chóng)劑，具有獨(dú)特的作用機(jī)制和觸殺、胃毒和內(nèi)吸活性，適用于葉面、顆粒和種子的處理應(yīng)用[9]。Minakshi 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，噻蟲(chóng)嗪對(duì)雙殼貝類(lèi)的24 h、48 h、72 h 和96 h 的半致死濃度（LC50）分別為91.83 mg/L、61.91 mg/L、38.46 mg/L 和25.79 mg/L。在急性作用下，隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，雙殼貝類(lèi)的氧耗率降低。這是由于沉積在呼吸表面的高黏液分泌干擾氧的擴(kuò)散速率，減少氧的消耗，與急性作用相比，慢性作用下的耗氧率下降幅度較大[11]，表明噻蟲(chóng)嗪可能會(huì)損害淡水動(dòng)物的氧化代謝。陳姣姣等[12]研究發(fā)現(xiàn)，噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華蟾蜍（Bufo gargarizans）蝌蚪為低毒性，暴露于噻蟲(chóng)嗪96 h 后，中華蟾蜍蝌蚪的總超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性逐漸降低，丙二醛（MDA）含量明顯升高，說(shuō)明噻蟲(chóng)嗪會(huì)毒害中華蟾蜍蝌蚪的抗氧化防御系統(tǒng)。王召等[13]研究表明，噻蟲(chóng)嗪對(duì)鯽（Carassius auratus）幼魚(yú)96 h 的LC50為28.95 mg/L。暴露于1 mg/L 和10 mg/L 噻蟲(chóng)嗪中96 h 后，鯽幼魚(yú)肝胰腺和鰓組織中超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，表明噻蟲(chóng)嗪可導(dǎo)致鯽幼魚(yú)抗氧化防御系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的功能紊亂，影響鯽的正常發(fā)育。陳愛(ài)梅[14]研究發(fā)現(xiàn)，噻蟲(chóng)嗪能夠造成斑馬魚(yú)（Danio rerio）脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷肝臟細(xì)胞的DNA，并且隨時(shí)間和濃度增加，DNA 損傷程度增大。在稻田養(yǎng)蟹中，每平方米一般使用噻蟲(chóng)嗪1.10～1.64 μg/L，但很少有關(guān)于噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹影響的報(bào)道。為此，本研究采用半靜態(tài)毒性試驗(yàn)法，探討了噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴細(xì)胞數(shù)量、肝胰腺、血淋巴和鰓免疫代謝指標(biāo)及相關(guān)基因表達(dá)的影響，初步闡釋噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹的亞急性毒性效應(yīng)機(jī)理，為噻蟲(chóng)嗪在稻田養(yǎng)蟹上的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

共采用中華絨螯蟹幼蟹樣本480 只，平均殼長(zhǎng)為（2.78±0.23）cm，平均體質(zhì)量為（8.28±1.27）g，其他生物數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，購(gòu)自天津蟹源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司。

表1 不同濃度組中華絨螯蟹幼蟹的生物學(xué)數(shù)據(jù)Tab.1 Biological data of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis in different concentration groups

TRIzolTMReagent 試劑盒、M-MLV、Random Primer，Invitrogen Corporation；Oligo dT、DTT、RNA 酶抑制劑、dNTPs 混合溶液、氯仿及乙醇購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；異丙醇購(gòu)自天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；噻蟲(chóng)嗪（Thiamethoxam）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

熒光定量PCR 儀，美國(guó)ABI 公司；MIKRO 200R 離心機(jī)，德國(guó)Hettich 科學(xué)儀器公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置噻蟲(chóng)嗪濃度分別為0 μg/L、90 μg/L、180 μg/L、360 μg/L、720 μg/L 和1 440 μg/L，每組10 只河蟹，實(shí)驗(yàn)前按照河蟹體質(zhì)量3%～5%投喂飼料。實(shí)驗(yàn)容器為63 cm×43 cm×20 cm 的水族箱，驗(yàn)用水為充分曝氣的自來(lái)水，飼養(yǎng)水溫（23±2）℃。在噻蟲(chóng)嗪中暴露96 h，根據(jù)李燕華等[15]的公式法計(jì)算96 h的半致死濃度（LC50）和安全濃度（SC）：

其中xm是最大死亡組質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)，d 是相鄰兩組質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)差，p 是各組的死亡率。

在此基礎(chǔ)上，設(shè)置噻蟲(chóng)嗪濃度分別為0 μg/L（對(duì)照組）、28.25 μg/L、56.5 μg/L、113 μg/L 和226 μg/L，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20 只河蟹。實(shí)驗(yàn)持續(xù)21 d，期間按照河蟹體質(zhì)量3%～5%投喂飼料，飼料組分見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)第0 d、1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，每個(gè)重復(fù)各取2 只河蟹，冰浴上麻醉、酒精消毒河蟹體表，用1 mL 注射器從河蟹心臟處抽取血淋巴，用解剖剪剪開(kāi)河蟹外殼，取其肝胰腺和鰓組織置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 實(shí)驗(yàn)飼料的組分Tab.2 Ingredient of the experimental diets（g/kg dry matter）

1.2.2 血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)

從中華絨螯蟹幼蟹的心臟處抽取血淋巴與抗凝劑（每100 mL 2.05 g 葡萄糖，0.42 g 氯化鈉，0.8 g檸檬酸鈉）迅速混勻（1∶1），100 μL 血淋巴滴于血球計(jì)數(shù)板上，重復(fù)計(jì)數(shù)3 次。

1.2.3 免疫代謝相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

將每個(gè)濃度組第0 d、1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d取得的肝胰腺，與預(yù)冷的生理鹽水按照1∶9 的配比冰浴勻漿，4 000 r/min 高速冷凍離心10 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)含量和酶活性。蛋白質(zhì)含量按照Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。肝胰腺中的超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量以及血淋巴中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性按照試劑盒（南京建成生物工程研究）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。血淋巴中的酚氧化酶活性按照Ashida[16]方法略有修改進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 qRT-PCR 檢測(cè)酚氧化酶（PO）和Na+-K+-ATPase 基因表達(dá)

中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺和鰓組織RNA 的提取按照Trizol 總RNA 抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。β-action（內(nèi)參）、酚氧化酶（PO）和Na+-K+-ATPase 的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列見(jiàn)表3。qRT-PCR 反應(yīng)體系：10 μL 的SYBR Mix，0.4 μL 的50×ROX，0.5 μL 的上游引物，0.5 μL 的下游引物，7.6 μL 的雙蒸水和1 μL 的樣品cDNA 組成20 μL 的反應(yīng)體系。qRT-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃下反應(yīng)30s 進(jìn)行預(yù)變性；95 ℃下反應(yīng)5 s，60 ℃下反應(yīng)34 s，40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95 ℃下反應(yīng)15 s，60 ℃下反應(yīng)1 min，0.5 ℃/cycles，95 ℃反應(yīng)15 s。反應(yīng)結(jié)束后，保存并整理數(shù)據(jù)，利用2-△△ct法處理數(shù)據(jù)。

表3 引物序列Tab.3 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

測(cè)得的數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。采用SPSS 26.0 分析和處理數(shù)據(jù)。采用LSD 法進(jìn)行多重比較，GraphPadPrism 8 繪制相關(guān)柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華絨螯蟹幼蟹的半致死濃度和安全濃度

統(tǒng)計(jì)96 h 各濃度組中河蟹的死亡數(shù)量，得出96 h 半致死濃度（LC50）為452 μg/L，安全濃度（SC）為45.2 μg/L。

2.2 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻中嗪濃度的升高，河蟹血淋巴細(xì)胞數(shù)量先增加后降低；第14 d 和21 d，113 μg/L 和226 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹的血淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。表明噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴細(xì)胞的毒性效應(yīng)較大（表4）。

表4 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響（×106）Tab.4 Effect of thiamethoxam on the number of lymphocytes in juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.3 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺免疫指標(biāo)的影響

2.3.1 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺SOD 活性的影響

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻蟲(chóng)嗪濃度的升高，河蟹肝胰腺SOD 活性先上升后下降；第1 d、4 d、7 d 和14 d，28.25 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹SOD 活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），第7 d、14 d 和21 d，226 μg/L 組SOD 活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）（表5）。

表5 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺SOD 活性的影響/（U·mg-1prot）Tab.5 Effect of thiamethoxam on SOD activity in hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.3.2 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺M(fèi)DA 含量的影響

隨著噻蟲(chóng)嗪濃度的升高，河蟹肝胰腺M(fèi)DA 含量逐漸增加，第4 d、7 d、14 d 和21 d，56.5 μg/L、113 μg/L 和226 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹肝胰腺M(fèi)DA 含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；除了第0 d 外，226 μg/L噻蟲(chóng)嗪組河蟹肝胰腺M(fèi)DA 含量顯著高于其他三個(gè)噻蟲(chóng)嗪組（P＜0.05）（表6）。

表6 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺M(fèi)DA 含量的影響/（nmol·mg-1prot）Tab.6 Effect of thiamethoxam on MDA content in hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.4 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴免疫指標(biāo)的影響

2.4.1 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴GPT 活性的影響

隨著噻蟲(chóng)嗪濃度的升高，河蟹血淋巴GPT 活性逐漸增加，第7 d、14 d 和21 d，113 μg/L 和226 μg/L噻蟲(chóng)嗪組河蟹血淋巴GPT 活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；第7 d 和14 d，226 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹血淋巴GPT 活性顯著高于28.25 μg/L 和56.5 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組（P＜0.05，表7）?？梢?jiàn)，高濃度噻蟲(chóng)嗪可能破壞了中華絨螯蟹幼蟹的肝胰腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)，致使血淋巴中GPT 活性升高。

表7 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴GPT 活性的影響/（U·L-1）Tab.7 Effect of thiamethoxam on GPT activity in hemolymph of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.4.2 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴AST 活性的影響

隨著噻蟲(chóng)嗪濃度的升高，河蟹血淋巴AST 活性逐漸增加，第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，113 μg/L 和226 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹血淋巴AST 活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；第7 d、14 d 和21 d，226 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹血淋巴AST 活性顯著高于28.25 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組（P＜0.05，表8）。

2.4.3 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴PO 活性的影響

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻蟲(chóng)嗪濃度的升高，河蟹血淋巴PO 活性先上升后下降，且以28.25 μg/L 組為最高，其中第1 d、4 d 和7 d，該組河蟹血淋巴PO 活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。第7 d、14 d 和21 d，226 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹血淋巴PO活性顯著低于對(duì)照組（P＜0.05，表9）。

表9 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹血淋巴PO 活性的影響（/U·L-1）Tab.9 Effect of thiamethoxam on PO activity in hemolymph of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.5 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺po 和Na+/K+-ATPase 基因表達(dá)的影響

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻蟲(chóng)嗪濃度的升高，肝胰腺PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達(dá)水平先上升后下降。除第0 d 外，28.25 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹肝胰腺PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；第4 d 和7 d，56.5 μg/L噻蟲(chóng)嗪組河蟹肝胰腺PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；第14 d 和21 d，226 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹肝胰腺PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達(dá)水平顯著低于其他四組（P＜0.05）（圖1、圖2）。

圖1 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺po 基因表達(dá)的影響Fig.1 Effect of thiamethoxam on po gene expression level in hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

圖2 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹肝胰腺Na+/K+-ATPase 基因表達(dá)的影響Fig.2 Effect of thiamethoxam on Na +/K+-ATPase gene expression level in hepatopancreas of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

2.6 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹鰓組織PO 和Na+/K+-ATPase 基因表達(dá)的影響

第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻蟲(chóng)嗪濃度的升高，河蟹鰓組織PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達(dá)水平先上升后下降。第1 d、4 d 和7 d，28.25 μg/L和56.5 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹鰓組織PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），第21 d，113 μg/L 和226 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹鰓組織PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達(dá)水平顯著低于其他3 組（P＜0.05）（圖3、圖4）。

圖3 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹鰓組織po 基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of thiamethoxam on po gene expression level in gill of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

圖4 噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹鰓組織Na+/K+-ATPase 基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of thiamethoxam on Na +/K +-ATPase gene expression level in gill of juvenile Chinese mitten crab E.sinensis

3 討論

血細(xì)胞作為細(xì)胞免疫的一部分在甲殼動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)中處于非常關(guān)鍵的地位[17]。血細(xì)胞數(shù)量可以間接反映出動(dòng)物機(jī)體的健康狀態(tài)及免疫應(yīng)激能力，因此常作為衡量甲殼類(lèi)動(dòng)物免疫水平的指標(biāo)之一[18]。高濃度草甘膦明顯降低河蟹的血淋巴細(xì)胞數(shù)量[19]。本研究得到類(lèi)似的結(jié)果，河蟹血淋巴細(xì)胞數(shù)量隨噻蟲(chóng)嗪濃度的增加先上升后降低。究其原因，可能是低濃度噻蟲(chóng)嗪刺激中華絨螯蟹幼蟹機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使其血細(xì)胞數(shù)量升高以應(yīng)對(duì)應(yīng)激脅迫，而高濃度噻蟲(chóng)嗪則會(huì)抑制中華絨螯蟹幼蟹的免疫功能，導(dǎo)致其血淋巴細(xì)胞數(shù)量下降。

甲殼類(lèi)動(dòng)物沒(méi)有特異性免疫，其先天免疫主要由酚氧化酶和抗氧化酶等多種免疫因子組成[20]，其中，SOD 參與多種生理和代謝反應(yīng)，特別是清除自由基和防止生物分子損傷機(jī)體，是抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵酶。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，這些指標(biāo)的變化能反映機(jī)體受氧化損傷程度[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度噻蟲(chóng)嗪能提高河蟹肝胰腺SOD 活性，高濃度噻蟲(chóng)嗪則抑制河蟹肝胰腺SOD 活性，與郝文靜[22]的結(jié)果相一致。這可能是低濃度噻蟲(chóng)嗪脅迫能夠提高中華絨螯蟹的防御能力，大量產(chǎn)生SOD 以清除超氧物陰離子自由基，而高濃度噻蟲(chóng)嗪脅迫下或暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，過(guò)量的自由基不能被及時(shí)分解，反過(guò)來(lái)會(huì)抑制SOD 的活性[23]。MDA 的含量可反映脂質(zhì)的過(guò)氧化程度[24]。本研究中，隨著噻蟲(chóng)嗪濃度的升高，河蟹肝胰腺M(fèi)DA 含量逐漸增大，呈現(xiàn)出較好的濃度效應(yīng)關(guān)系。中華絨螯蟹幼蟹受阿維菌素[22]和苯噻酰草胺[6]脅迫時(shí)，肝胰腺M(fèi)DA 含量變化與本結(jié)果相似。28.25 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹肝胰腺M(fèi)DA 含量隨時(shí)間增加先上升后下降，當(dāng)MDA 含量較高時(shí)，肝胰腺SOD 仍具有較高活性，可能是肝胰腺脂質(zhì)過(guò)氧化損傷對(duì)其抗氧化系統(tǒng)影響較小，說(shuō)明中華絨螯蟹幼蟹對(duì)低于安全濃度的噻蟲(chóng)嗪有很好的適應(yīng)性。

GPT 是一種參與機(jī)體蛋白質(zhì)新陳代謝的酶，以肝細(xì)胞的線粒體中最多，當(dāng)1%肝細(xì)胞被破壞時(shí)，GPT 會(huì)大量被釋放進(jìn)入血液，使血液中該酶活性顯著升高。

AST 主要存在于肝細(xì)胞線粒體內(nèi)，當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死或破壞時(shí)，能引起谷草轉(zhuǎn)氨酶在血清中濃度偏高。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著噻蟲(chóng)嗪濃度的升高，河蟹血淋巴GPT 和AST 活性逐漸增加，可能是高濃度噻蟲(chóng)嗪破壞了中華絨螯蟹幼蟹的肝胰腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，第4 d、7 d 和14 d，28.25 μg/L 噻蟲(chóng)嗪組河蟹血淋巴GPT 和AST 活性比對(duì)照組略有升高，第21 d，增加緩慢，可能是隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，河蟹機(jī)體逐漸適應(yīng)了安全濃度下噻蟲(chóng)嗪的脅迫。

酚氧化酶（PO）是甲殼動(dòng)物重要的非特異性血淋巴免疫因子之一。于萍[25]研究指出，在第7 d 和14 d，隨著微塑料濃度的增加，中華絨螯蟹血淋巴中PO 活性呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。本研究也得到類(lèi)似的結(jié)果，第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻蟲(chóng)嗪濃度的升高，河蟹血淋巴PO 活性出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。第1 d、4 d、7 d、14 d 和21 d，隨著噻蟲(chóng)嗪濃度的升高，河蟹肝胰腺和鰓組織PO 和Na+/K+-ATPase 的基因表達(dá)水平也出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與郝文靜[22]的結(jié)果相一致?？赡苁堑蜐舛揉缦x(chóng)嗪對(duì)河蟹肝胰腺和鰓組織po 基因的表達(dá)有促進(jìn)作用，高濃度噻蟲(chóng)嗪則有抑制作用。Na+/K+-ATPase 可以水解ATP 獲得能量，利用該能量進(jìn)行Na+和K+逆濃度梯度穿過(guò)質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，維持細(xì)胞內(nèi)外液的滲透差，在機(jī)體的代謝中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度噻蟲(chóng)嗪脅迫下，Na+/K+-ATPase 的表達(dá)量升高，說(shuō)明噻蟲(chóng)嗪刺激中華絨螯蟹幼蟹的滲透壓調(diào)節(jié)，以抵御噻蟲(chóng)嗪帶來(lái)的損害，而在高濃度和長(zhǎng)時(shí)間暴露下，中華絨螯蟹機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)和結(jié)構(gòu)等受到損傷，肝胰腺細(xì)胞受到破壞，其功能受到影響，導(dǎo)致Na+/K+-ATPase 表達(dá)量降低。

綜上所述，高濃度的噻蟲(chóng)嗪對(duì)中華絨螯蟹幼蟹的抗氧化酶活性、血淋巴細(xì)胞數(shù)量和PO 及Na+/K+-ATPase 的基因表達(dá)有較大影響，低濃度的噻蟲(chóng)嗪對(duì)于中華絨螯蟹幼蟹的抗氧化和代謝系統(tǒng)具有刺激作用?；诒緦?shí)驗(yàn)結(jié)果，建議稻田養(yǎng)蟹中噻蟲(chóng)嗪使用濃度應(yīng)不超過(guò)45.2 μg/L。