張光晨，王洋,2，白東清,2，邱金來

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300392；2.天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點試驗室，天津 300392；3.天津三緣寶地農(nóng)業(yè)科技有限公司，天津 300000）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹，是最受國人喜愛的淡水蟹。據(jù)中國漁業(yè)年鑒記錄，我國河蟹年產(chǎn)量自2017—2019 年穩(wěn)步攀升，到2020 年達(dá)到775 887 t[1-4]。稻-蟹共生作為一種新興的生態(tài)化養(yǎng)蟹模式，經(jīng)濟(jì)效益高[5]，環(huán)境友好，發(fā)展速度較快[6]。稻-蟹模式用藥少或者不用藥，較單獨養(yǎng)殖模式相比，對疾病防控的要求更高[7]。益生菌制劑作為一種具有替抗?jié)撃艿奈镔|(zhì)，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的促生長、免疫調(diào)節(jié)及抗病制劑。Ayisi 等[8]綜述了微生態(tài)制劑在幾種海蟹中的應(yīng)用效果，包括提升免疫力、改善水質(zhì)、補充消化酶，以及降低發(fā)病率。褚蘭璐等[9]發(fā)現(xiàn)，EM菌能夠增強中華絨螯蟹的抗氧化能力和免疫能力。趙亮等[10]在全封閉育苗系統(tǒng)中使用光合細(xì)菌，明顯提高了中華絨螯蟹的成活率，使水中氨氮及亞硝態(tài)氮濃度降低40%以上。王典[11]使用“龍源”益生菌液使稻田養(yǎng)蟹增產(chǎn)，成活率提高。姚東瑞等[12]在太湖的中華絨螯蟹池塘內(nèi)單獨或聯(lián)合使用多種微生態(tài)制劑，使化學(xué)需氧量、固體懸浮物、總磷和氨態(tài)氮含量降低了40%以上，使湖水達(dá)到了排放標(biāo)準(zhǔn)。肖玉冰等[13]在中華絨螯蟹養(yǎng)殖中施加EM 菌，降低了水體氨氮、化學(xué)耗氧量、亞硝態(tài)氮和總磷含量，提高了蟹的成活率。Wan 等[14]以復(fù)合菌劑及低聚果糖飼喂中華絨螯蟹幼蟹，較單純使用益生菌，取得了更好地促生長和免疫的效果。然而，目前復(fù)合微生態(tài)制劑在稻田蟹養(yǎng)殖中的應(yīng)用尚不成熟，研究多聚焦單一復(fù)合微生態(tài)制劑對中華絨螯蟹的影響，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)三種復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用，可有效降低養(yǎng)殖損失，提升產(chǎn)品品質(zhì)，因此亟需開展對復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用效果的科學(xué)評價。

本研究將三種復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用，飼喂在稻田中養(yǎng)殖的中華絨螯蟹5 個月，最終收獲時檢測其生長指標(biāo)、營養(yǎng)品質(zhì)、感官品質(zhì)及環(huán)境微生物組成。研究結(jié)果可為三種復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用在稻-蟹共生模式中的應(yīng)用及“稻蟹益生菌”的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 中華絨螯蟹養(yǎng)殖試驗

在天津三緣寶地農(nóng)業(yè)科技有限公司稻田蟹養(yǎng)殖基地，取6 塊面積約80 m2的稻田進(jìn)行養(yǎng)殖試驗，四周圍起高50 cm 的塑料布。5 月中旬投放同批、大小相近、活力較好的“光合1 號”中華絨螯蟹幼蟹，密度為按6 g·m-2。其中3 個平行組稻田投喂中華絨螯蟹全價飼料[為盤錦大洼縣佳鑫飼料廠蟹樂河蟹配合飼料，飼料成分為玉米、豆粕、魚粉、菜粕、次粉、磷酸氫鈣、維生素（A、D3、E、B1 等）、微量元素（硫酸亞鐵、硫酸銅等）、脫殼素等]，作為對照組；另3 塊平行試驗稻田則投喂拌有三種復(fù)合微生態(tài)制劑的全價飼料，作為微生態(tài)制劑組，其余操作兩組均無區(qū)別。試驗中，每日8：00、18：00 在環(huán)溝的淺水處投喂2 次，日投飼率8%；每3 天上午換水三分之一，溫差在3 以內(nèi)；為保證蟹順利蛻殼，每15 d 施用一次葡萄糖離子鈣（奧立安（湖北）生物工程有限公司）。養(yǎng)殖5 個月時采樣，檢測生長和營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)。

1.2 試驗用復(fù)合微生態(tài)制劑

試驗中所用的三種復(fù)合微生態(tài)制劑購自廈門利洋水產(chǎn)科技有限公司。包括：①水產(chǎn)專用復(fù)合預(yù)混飼料“營養(yǎng)快線”氨基酸電解質(zhì)多維（煙酰胺、泛酸鈣、蛋氨酸、氯化鉀、葡萄糖組成，條碼：06951259640131）；②混合型飼料添加劑復(fù)合微生物“利多精”（含1.0×109CFU·g-1的枯草芽孢桿菌和破壁花粉，條碼：06951259616006）；③水產(chǎn)用復(fù)合預(yù)混飼料“LY-生命素”（主要成分為低聚殼聚糖、復(fù)合維生素、DL-蛋氨酸、泛酸鈣、啤酒酵母粉，條碼：06951259612251），復(fù)合微生態(tài)制劑具體原料組成及用量如表1 所示，每周使用一次。

表1 復(fù)合微生態(tài)制劑成分表及用量Tab.1 The ingredients and dosage of the composite probiotics

1.3 中華絨螯蟹品質(zhì)指標(biāo)的測定

中華絨螯蟹的品質(zhì)指標(biāo)主要包括生長指標(biāo)（蟹重、殼長、殼寬和殼厚）、體成分指標(biāo)、感官品質(zhì)和熟蟹色澤。從對照組和微生態(tài)制劑組各隨機(jī)取60 只蟹，測量生長指標(biāo)后，從中隨機(jī)取出5 只測定蟹肉及肝胰腺和性腺混合物（蟹黃）的營養(yǎng)指標(biāo)，分別采用冷凍干燥法[15]、凱氏定氮法[16]和索氏抽提法[17]分別測定水分、粗蛋白及粗脂肪含量。從剩余的蟹中隨機(jī)取雌雄蟹各10 只，蒸10 min 后感官評價并測定蟹殼色澤。感官評價組成員為7 名經(jīng)過感官試驗培訓(xùn)的師生，評價標(biāo)準(zhǔn)參考朱塽等[18]的文獻(xiàn)。通過色差儀（日本柯尼卡美能達(dá)CR-400）測定蒸熟蟹的蟹殼、蟹肉及蟹黃的L*（亮度）、a*（紅度）和b*（黃度）值。

1.4 中華絨螯蟹養(yǎng)殖稻田微生物多樣性的分析

從對照組和微生態(tài)制劑組稻田邊緣取水和底泥，低溫運回實驗室。水樣用雙層紗布濾除雜質(zhì)，再分別用0.45 μm 和0.22 μm 濾膜抽濾，以無菌生理鹽水洗滌所有濾膜，離心收集鹽水中的細(xì)菌；底泥樣本裝入無菌自封袋混合均勻；最終將同組3 塊田的樣本合并為一個混合樣本。低溫送往北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行DNA 提取和高通量測序。具體測序流程為：首先提取各樣本細(xì)菌的總DNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA，然后通過 TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase 對所提DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，每個樣本3個重復(fù)。將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳后使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠并回收PCR 產(chǎn)物?；厥盏腜CR 產(chǎn)物通過QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega 公司）進(jìn)行檢測定量，并按照測序量要求進(jìn)行混合。構(gòu)建Miseq 文庫構(gòu)建，并用MiseqPE300 測序。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 24 軟件對中華絨螯蟹品質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行T 檢驗，α=0.05。感官評價雷達(dá)圖通過Origin 2018 軟件繪制。微生物組數(shù)據(jù)采用奧維森云平臺分析處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用對中華絨螯蟹生長指標(biāo)的影響

收獲時對照組蟹的體質(zhì)量為（70.39±14.83）g，微生態(tài)制劑組為（81.86±25.80）g，二者無統(tǒng)計檢驗差異（表2）。對照組蟹與微生態(tài)制劑組蟹的體長，體寬和厚度均無顯著差異（P＞0.05）。

表2 三種復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用對中華絨螯蟹生長指標(biāo)的影響Tab.2 Effects of combined use of three complex probiotics on growth indices of Chinese mitten handed crab

2.2 飼喂復(fù)合微生態(tài)制劑對中華絨螯蟹蟹肉及肝胰腺和性腺混合物營養(yǎng)成分的影響

表3 列出了對照組和飼喂復(fù)合微生態(tài)制劑組中華絨螯蟹蟹肉及肝胰腺與性腺混合物的營養(yǎng)成分。對照組蟹肉的水分含量為（78.3±0.8）%，粗蛋白占干重的（82.9±1.7）%；飼喂微生態(tài)制劑對蟹肉水分和粗蛋白的含量沒有顯著影響（P＞0.05）。對照組蟹的肝胰腺與性腺混合物水分含量為（72.2±1.5）%，粗蛋白占干重的（44.5±1.9）%，粗脂肪占（46.9±1.9）%。飼喂微生態(tài)制劑對肝胰腺與性腺混合物的水分、粗蛋白和粗脂肪含量沒有顯著影響（P＞0.05）。

表3 三種復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用對中華絨螯蟹蟹肉和肝胰腺與性腺混合物營養(yǎng)成分的影響Tab.3 Effects of combined use of three complex probiotics on the nutrient composition of meat,hepatopancreas and gonad in Chinese mitten handed crab

2.3 感官評價

感官評分結(jié)果顯示（圖1），與對照組相比，飼喂復(fù)合微生態(tài)制劑組中華絨螯蟹的蟹殼色澤、肉質(zhì)、肉的鮮甜度、蟹香味及肥滿度評分顯著增加（P＜0.05），各項指標(biāo)的評分增加幅度分別為19.4%、25.0%、21.6%、25.0%和21.6%。

圖1 三種復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用對中華絨螯蟹感官評分的影響Fig.1 Effects of combined use of three complex probiotics on sensory scores of Chinese mitten handed crab

2.4 三種復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用對中華絨螯蟹熟蟹色澤的影響

表4 為蒸煮后中華絨螯蟹熟蟹蟹殼、蟹黃（肝胰腺與性腺混合物）及蟹肉的亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*）。微生態(tài)制劑組蟹殼呈褐紅色，紅度值（25.59±3.04）顯著高于對照組（20.43±3.10）（P＜0.05），亮度和黃度與對照組沒有顯著差異。微生態(tài)制劑組的蟹黃色澤橘紅，其紅度（17.72±2.19）和亮度（51.17±3.39）顯著高于對照組（P＜0.05），黃度與對照組沒有差異。兩組蟹肉的色澤指標(biāo)沒有顯著差異（P＞0.05）。

表4 三種復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用對中華絨螯蟹蒸煮后色澤的影響Tab.4 Effects of combined use of three complex probiotics on the color of steamed Chinese mitten handed crab

2.5 對中華絨螯蟹稻田養(yǎng)殖環(huán)境中微生物多樣性的影響

2.5.1 高通量測序質(zhì)量

高通量測序表明，對照組和微生態(tài)制劑組中華絨螯蟹養(yǎng)殖稻田中泥和水樣中，測得有效序列共186 995 條，其中對照組泥樣33 592 條、水樣38 848條；微生態(tài)制劑組泥樣24 521 條、水樣90 034 條。其中99.95%的有效序列長度在400～440 bp 范圍（圖2-A），各樣本的多樣性及新發(fā)現(xiàn)物種數(shù)隨樣本測序量的升高逐漸趨于平緩（圖2-B），表明本次測序質(zhì)量好，深度足夠。

2.5.2 物種維恩圖

中華絨螯蟹稻田泥和水樣微生物OTU 數(shù)量如圖3 所示，各樣本共有OTU 數(shù)192 個，對照組泥樣的獨有OTU 數(shù)最多，為228 個，而微生態(tài)制劑組水樣獨有OTU 數(shù)為46 個，為四個樣本中最少。微生態(tài)制劑組各樣本獨有OTU 數(shù)均低于相同取樣部位的對照組樣本。

圖3 中華絨螯蟹養(yǎng)殖稻田泥和水樣的微生物OTU 維恩圖Fig.3 The microbiological Venn diagram of mud and water in the paddy fields with Chinese mitten crab farming

2.5.3 α 多樣性情況

中華絨螯蟹稻田泥和水樣微生物α 多樣性如表5 所示。與對照組相比，微生態(tài)制劑組的水樣和泥樣的PD whole tree 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和觀測物種數(shù)量（observed species）指數(shù)更低。表明使用微生態(tài)制劑降低了中華絨螯蟹稻田水樣和泥樣的微生物α 多樣性。

表5 中華絨螯蟹養(yǎng)殖稻田泥和水樣的微生物α 多樣性Tab.5 Microbial alpha diversity in mud and water in the Chinese mitten handed crab farming paddy field

2.5.4 中華絨螯蟹養(yǎng)殖稻田微生物物種組成

中華絨螯蟹養(yǎng)殖稻田泥和水樣微生物組成如圖4 所示。各樣本組門水平上均主要由變形菌門、擬桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門、放線菌門等12 個門組成（在任意一個樣本中相對豐度均大于1%），其中變形菌門是在各樣本中均為最優(yōu)勢門。除變形菌門外，對照組中水樣中擬桿菌門（13.89%）、藍(lán)細(xì)菌門（19.34%）和放線菌門（12.49%）是次優(yōu)勢微生物（相對豐度＞8%），泥樣中的次優(yōu)勢微生物門為酸桿菌門（20.80%）和綠彎菌門（11.06%）；微生態(tài)制劑組，水樣的擬桿菌門（17.84%）和放線菌門（8.67%）為次優(yōu)勢菌門，而泥樣中，則為擬桿菌門（10.76%）、厚壁菌門（10.39%）、酸桿菌門（9.22%）和藍(lán)綠菌門（8.88%）。

圖4 中華絨螯蟹養(yǎng)殖稻田泥和水樣的微生物組成（A 門水平，B 科水平）Fig.4 The microbial composition in mud and water in the Chinese mitten handed crab farming paddy field（A: phylum,B:family）

在科水平上，對照組（23.96%）和微生態(tài)制劑組（30.28%）水樣中叢毛單胞菌科均占比最高。與對照組相比，聯(lián)用三種復(fù)合微生態(tài)制劑使魚孢菌科和隱鞭藻科相對豐度降低，普雷沃菌科（7.33%）上升為次優(yōu)勢科。對照組泥樣，大量微生物無法鑒定（unidentified），其次為Blastocatellaceae_Subgroup_4（4.85%），而其他微生物所占比例較低，微生態(tài)制劑組泥樣中無法分科的黃單胞菌目微生物（7.98%）和Family I（5.39%）成為優(yōu)勢。與水稻細(xì)菌性穗枯病相關(guān)的伯克霍爾德氏菌科在用微生態(tài)制劑后水樣和泥樣中的相對豐度均增長。

2.5.5 β 多樣性情況

圖5 顯示了中華絨螯蟹養(yǎng)殖稻田泥和水樣微生物群落的相似性。第1 主成分（PC1）特征值的貢獻(xiàn)率為65.33%，第2 主成分特征值的貢獻(xiàn)率為19.77%，兩者之和占總變異的85.1%，說明這兩個主成分可代表中華絨螯蟹養(yǎng)殖稻田的微生物多樣性。圖5 中各樣本點間的距離代表樣本間的相似性情況，因此可知這四組中華絨螯蟹稻田環(huán)境樣本間微生物群落差異較大。

圖5 中華絨螯蟹養(yǎng)殖稻田泥和水樣的微生物主成分分析Fig.5 Principal component analysis of the microbial composition in mud and water in the Chinese mitten handed crab farming paddy field

3 討論

3.1 三種復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用對中華絨螯蟹感官 品質(zhì)的影響

本研究證明，聯(lián)用三種復(fù)合微生態(tài)制劑能夠顯著提高稻田蟹熟蟹的感官品質(zhì)。本試驗中聯(lián)用三種復(fù)合微生態(tài)制劑可以提高中華絨螯蟹色澤，使其變得更加褐紅、油亮，具有更少的雜斑。蟹的色澤與類胡蘿卜素的種類和含量有關(guān)[19]。只能通過食物鏈和代謝[20,21]獲得?？莶菅挎邨U菌可以提升凡納濱對蝦（Litopenaeus Vannamei）組織中的蝦青素濃度，改變體色[22]。李立新等[23]報道，復(fù)合維生素有促進(jìn)雨生血球藻（Haematococcus Pluvialis）蝦青素的積累。水產(chǎn)動物體內(nèi)維生素A 和維生素E 的含量也會影響胡蘿卜素的合成[24]。聯(lián)用三種復(fù)合微生態(tài)制劑后，中華絨螯蟹蟹肉口感更佳，肉質(zhì)更細(xì)膩、富有彈性，多種維生素可以影響肉質(zhì)[25]。復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用還使蟹的口味更加清甜，聞起來有更濃郁的蟹香味。這些味道上的變化與蟹中的呈味非揮發(fā)性物質(zhì)和揮發(fā)性化合物有關(guān)[26]，如谷氨酸、5’-肌苷一磷酸二鈉、5’-腺苷一磷酸二鈉[27]，醛類等[28]。因此，有必要進(jìn)一步關(guān)注呈味物質(zhì)的含量。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用復(fù)合微生態(tài)制劑使蟹重和殼長增加，蟹黃和蟹膏更加豐滿。重量和肥滿度是影響中華絨螯蟹價格的重要品質(zhì)，未來可繼續(xù)開展聯(lián)用復(fù)合微生態(tài)制劑提高重量和肥滿度的機(jī)制研究，為稻田蟹用復(fù)合微生態(tài)制劑的應(yīng)用和研發(fā)提供依據(jù)。

3.2 三種復(fù)合微生態(tài)制劑聯(lián)用對稻-蟹共生環(huán)境微生物多樣性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用三種復(fù)合微生態(tài)制劑降低了中華絨螯蟹稻田環(huán)境的細(xì)菌豐度，也改變了其組成。值得注意的是，復(fù)合微生態(tài)制劑的聯(lián)用使叢毛單胞菌科的相對豐度顯著增加。叢毛單胞菌科中的許多微生物見于水、土壤和污染環(huán)境中，具有降解復(fù)雜有機(jī)物[29]和除磷的功能[30]，還可以作為硫酸鹽還原劑[31]和降氮劑[32]，因此提高叢毛單胞菌的相對豐度對養(yǎng)殖水體水質(zhì)凈化有積極作用。同時聯(lián)用三種復(fù)合微生態(tài)制劑也明顯提高了黃單胞菌目和伯克霍爾德氏菌科的相對豐度。黃單胞菌目-稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae）是引起稻-蟹共生中的主產(chǎn)品-水稻的病原體。它能夠引起作為水稻最嚴(yán)重的病害之一的水稻白葉枯病和重要性日益顯現(xiàn)的細(xì)菌性條斑病，使水稻品質(zhì)下降和減產(chǎn)[33]。伯克霍爾德氏菌科-Burkholderia glumae 是全球水稻越來越嚴(yán)峻的細(xì)菌性穗枯病的病原菌[34]，使用微生態(tài)制劑后水樣和泥樣中的伯克霍爾德氏菌科的相對豐度提高，提示有產(chǎn)生細(xì)菌性穗枯病的可能。所以后續(xù)有必要深入分析聯(lián)用三種復(fù)合微生態(tài)制劑對系統(tǒng)中水稻患細(xì)菌性疾病的風(fēng)險。

本研究未檢測稻田蟹的代謝能力、免疫水平、腸道微生物組、稻田水質(zhì)、水稻相關(guān)生理特性及試驗中聯(lián)用的復(fù)合微生態(tài)制劑中每一種物質(zhì)的作用效應(yīng)以及共同作用機(jī)制。后續(xù)將深入開展相關(guān)試驗，有助于全面評估本研究所聯(lián)用的復(fù)合微生態(tài)制劑在中華絨螯蟹稻-蟹共生養(yǎng)殖模式中使用的可行性。

3.3 結(jié)論

本研究證明了在稻-蟹共生模式下飼喂復(fù)合微生態(tài)制劑可提升中華絨螯蟹蟹殼和肝胰腺色澤與蟹的感官指標(biāo)，有助于提高“稻-蟹共生”中華絨螯蟹的價值和品質(zhì)。聯(lián)用三種復(fù)合微生態(tài)制劑改變了中華絨螯蟹養(yǎng)殖稻田環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)，提升了氮、磷、硫降解菌的比例，但使?jié)撛谒静≡?xì)菌比例略有增加。繼續(xù)深入分析蟹的代謝和免疫水平，水稻的生理和發(fā)病風(fēng)險，可為聯(lián)用復(fù)合微生態(tài)制劑在稻-蟹共生模式中的使用提供更全面的理論支持。