徐莉 陳運(yùn)旺 廖趙妹 林強(qiáng) 陳乙云

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科一區(qū)（?？?570311）

腎母細(xì)胞瘤在臨床上是較常見的兒童實(shí)體性腫瘤病癥之一，患病率在小兒全部腫瘤疾病中占9%，且有較高的病死率，嚴(yán)重影響患兒的生命安全［1-3］。臨床主要選用化療或放療等方案治療小兒腎母細(xì)胞瘤。因腎母細(xì)胞瘤的生物機(jī)制較多變，且目前腎母細(xì)胞瘤病理機(jī)制尚未清晰，因此找尋具有特異性的腫瘤標(biāo)志物極為重要［4］。學(xué)者在胃癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌等多類的實(shí)體腫瘤內(nèi)監(jiān)測出RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 呈現(xiàn)異常表達(dá)，而TOPOⅡα、CXCR4 以及RGS4 蛋白在小兒腎母細(xì)胞瘤產(chǎn)生、進(jìn)展中的意義報(bào)道較少［5-6］?；诖?，本研究分析了經(jīng)測定RGS4 蛋白、CXCR4 及TOPOⅡα 在小兒腎母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)，探究在小兒腎母細(xì)胞瘤中上述指標(biāo)的病理特征及與預(yù)后生存的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年1 月至2020 年1 月于海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的腎母細(xì)胞瘤40 例患兒為研究對(duì)象，并在術(shù)后留取距離癌組織邊緣＞4 cm 的癌旁組織40 例作對(duì)照。臨床資料具有可比性（P＞0.05），且此次研究均在患兒家屬同意下完成。研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［批準(zhǔn)號(hào)：（2016）倫審第（42）號(hào)］。

預(yù)后效果判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）預(yù)后良好，腎母細(xì)胞瘤＜5 cm，5 年生存率≥84%；（2）預(yù)后不良，腎母細(xì)胞瘤≥5 cm，且伴有其他先天性發(fā)育不良。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有小兒腎母細(xì)胞瘤均符合《兒童腎母細(xì)胞瘤診療專家共識(shí)》［7］中的相關(guān)診斷要求；均經(jīng)影像學(xué)、病理特征、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等明確病癥；術(shù)前未接受放療、化療等診治的患兒。

排除標(biāo)準(zhǔn)：存在心肺功能異常、慢性感染性病癥、惡性腫瘤等病癥的患兒；伴有精神類病癥和心理病癥的患兒。

1.2 免疫組織化學(xué)法檢測RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 表達(dá) 采用免疫組化法對(duì)RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 進(jìn)行檢測，步驟如下：脫蠟，脫蠟前在室溫中將組織放約2 h，或60 ℃恒溫下烘烤10 ～15 min，后用二甲苯浸泡、沖洗。用5% 甲醇培養(yǎng)15 min，加緩沖液內(nèi)直到煮沸，自然冷卻至室溫?？乖迯?fù)，加封閉血清液，室溫放30 min，清除多余血清，加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育40 min。加顯色劑，光鏡下顯色，光鏡下觀察免疫組化染色情況。

按染色狀況及細(xì)胞高表達(dá)的百分比分析CXCR4、RGS4 蛋白、TOPOⅡα 表達(dá)水平：（1）無色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分；（2）未出現(xiàn)高表達(dá)細(xì)胞為0 分，細(xì)胞高表達(dá)比例＜10%為1 分，比例處于10% ～15%為2 分，比例＞50%為3分。總評(píng)分：上述兩項(xiàng)得分相乘，≤3 分為低表達(dá)，≥4 分為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。應(yīng)用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Kaplan-Meier 法繪制腎母細(xì)胞瘤患兒生存曲線，生存比較采用Log-rank 檢驗(yàn)，應(yīng)用多元線性逐步回歸分析影響小兒腎母細(xì)胞瘤預(yù)后的危險(xiǎn)因素，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 在腎母細(xì)胞瘤組織、癌旁組織的表達(dá) 如表1、圖1 所示，相較于癌旁組織，腎母細(xì)胞瘤組織中TOPOⅡα、CXCR4的高表達(dá)率升高，RGS4 蛋白高表達(dá)率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 在腎母細(xì)胞瘤組織、癌旁組織的表達(dá)Tab.1 Expression of RGS4 protein，CXCR4，and TOPOⅡα in nephroblastoma tissue and paracancerous tissue 例（%）

2.2 RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 表達(dá)與腎母細(xì)胞瘤患兒臨床病理特征的關(guān)系分析 如表2 所示，RGS4 蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理種類、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、TNM 分期呈負(fù)相關(guān)；CXCR4、TOPOⅡα 與病理種類、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05）。

表2 RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 表達(dá)與腎母細(xì)胞瘤患兒臨床病理特征的關(guān)系分析Tab.2 Relationship between expression of RGS4 protein，CXCR4，TOPOⅡα and clinicopathologic features in pediatric wilms tumor例（%）

2.3 腎母細(xì)胞瘤患兒3年生存率 隨訪3年，有2例失訪，38 例腎母細(xì)胞瘤患兒3 年的總生存率為68.42%（26/38）。RGS4 蛋白高表達(dá)者總生存率較高，CXCR4、TOPOⅡα 高表達(dá)的患兒總生存率較低（圖2）。

圖2 小兒腎母細(xì)胞瘤的生存曲線Fig.2 Survival curve of pediatric wilms' tumor

3 討論

腎母細(xì)胞瘤屬于小兒腎癌內(nèi)較常見的一類疾病，據(jù)研究表明，在小兒惡性腎腫瘤中腎母細(xì)胞瘤的患病率約占6%［8-9］。惡性腫瘤疾病的產(chǎn)生、浸潤轉(zhuǎn)移及發(fā)展是由各種轉(zhuǎn)錄因子、趨化因子及介導(dǎo)信號(hào)等途徑實(shí)現(xiàn)，因而找尋診斷腎母細(xì)胞瘤的產(chǎn)生、發(fā)展有關(guān)的腫瘤標(biāo)志物為目前的研究熱點(diǎn)［10-11］。

RGS 屬于GTP 酶激活蛋白的一種，能促進(jìn)GTP 的水解，且RGS 可對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)G 蛋白信號(hào)進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，以對(duì)G 蛋白信號(hào)的介導(dǎo)水平調(diào)節(jié)及平衡不同的G 蛋白信號(hào)傳導(dǎo)通路之間的關(guān)系，可在介導(dǎo)信號(hào)通路的偶聯(lián)能力調(diào)節(jié)過程中參與［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，癌旁組織中RGS4 蛋白的高表達(dá)率明顯高于腎母細(xì)胞瘤組織，且RGS4 蛋白高表達(dá)率可與臨床病理特征相關(guān)，與其他學(xué)者研究較相似［14-15］。RGS4 蛋白與多種類型的腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展有緊密聯(lián)系，且RGS4 可經(jīng)失活的G 蛋白抑制G 蛋白的受體偶聯(lián)傳導(dǎo)信號(hào)通路，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，故而推測RGS4 蛋白在腎母細(xì)胞瘤內(nèi)屬于抑癌因子［16］。表明RGS4 蛋白表達(dá)可能在腎母細(xì)胞瘤的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移及發(fā)展期間發(fā)揮重要意義。

CXCR4 屬于CXCL12 中主要的受體之一，CXCL12 還能與CXCR4 的N 端結(jié)合，在腫瘤對(duì)免疫反應(yīng)介導(dǎo)、侵潤侵襲轉(zhuǎn)移、腫瘤血管新生提高等病理過程中發(fā)揮重要的作用。有國外研究［17］發(fā)現(xiàn)，在腎癌、乳癌及前列腺癌等疾病產(chǎn)生中CXCR4 異常表達(dá)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。TOPOⅡα 可有效傳導(dǎo)DNA的斷裂且生成新的DNA-蛋白酶的復(fù)合物，在DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及翻譯中均與參與。腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控中，其編碼的TOPOⅡα 屬于ATP 依賴的對(duì)于細(xì)胞發(fā)揮重要作用的合成酶及水解酶。作用于染色體濃縮維持、分離染色體等主要的生理過程，且在增殖活性異常提升的腫瘤細(xì)胞內(nèi)TOPOⅡα 水平明顯上升［18］。本研究顯示，CXCR4 高表達(dá)是影響腎母細(xì)胞瘤患兒預(yù)后生存的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。相較于癌旁組織中CXCR4 表達(dá)，在腎母細(xì)胞瘤組織中CXCR4、TOPOⅡα 表達(dá)較高，還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期、臨床病理特征等相關(guān)，與其他學(xué)者研究結(jié)果較為一致［19-20］。表明CXCR4 在患兒生存預(yù)后評(píng)估中有著重要的作用。

綜上所述，通過檢測腎母細(xì)胞瘤組織中的RGS4 蛋白、CXCR4、TOPOⅡα 表達(dá)變化，可發(fā)現(xiàn)RGS4 蛋白、TOPOⅡα、CXCR4 與TNM 分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后療效有緊密的關(guān)聯(lián)。

【Author contributions】XU Li performed the experiments and wrote the article.CHEN Yunwang，LIAO Zhaomei，LIN Qiang and CHEN Yiyun performed the experiments.All authors read and approved the final manuscript as submitted.