朱鳳亭,費(fèi)洋,盧忠秋,蘭公劍

(南京正大天晴制藥有限公司,江蘇 南京 210046)

API作為藥物中的主要活性成分,其中的雜質(zhì)研究一直是備受關(guān)注的重點(diǎn),如:有機(jī)雜質(zhì)、無機(jī)雜質(zhì)和殘留溶劑[1-3],而無機(jī)雜質(zhì)中的元素雜質(zhì)是關(guān)注的重點(diǎn)。因?yàn)樵仉s質(zhì)的存在不僅對藥品的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,嚴(yán)重的可能會危及患者的健康,帶來不可估量的后果[4-6]。右雷佐生又名右丙亞胺,是雙內(nèi)酰亞胺類化合物,也是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞內(nèi)交聯(lián)劑。1995年7月獲FDA批準(zhǔn)可用于降低蒽環(huán)類化合物(柔紅霉素、多柔比星、表柔比星)心臟毒性的藥物,也就是一種心臟保護(hù)劑[7-11]。目前國內(nèi)關(guān)于元素雜質(zhì)檢測的研究很多,對右雷佐生中元素雜質(zhì)的測定未見報道[12-15]。根據(jù)歐洲EMA、美國FDA、國際藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會議(ICH)和中華人民共和國藥典(四部)關(guān)于元素雜質(zhì)的指導(dǎo)原則等要求[16-18],右雷佐生每日攝入量不大于10 g,可采用ICH Q3D中限度計算方法1計算出各目標(biāo)元素的最大允許限度,本研究首次建立了電感耦合等離子質(zhì)譜儀(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer,ICP-MS),可準(zhǔn)確、靈敏地測定右雷佐生原料藥中16種元素雜質(zhì)的量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

PE電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP-MS,NexION 2000B,珀金埃爾默股份有限公司); 十萬分之一電子分析天平(XS204,梅特勒-托利多儀器上海有限公司);超純水儀(Milli-Q IQ 7000,Millipore)。

1.2 試藥

鹽酸(UPS級別,純度:38.0%～40.0%,蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司);ICP-MS調(diào)諧液(批號:27-179GSX1,含量:1 ng/ml(Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U),珀金埃爾默股份有限公司);鋰(Li)、鋁(Al)、釩(V)、鉻(Cr)、錳(Mn)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、銅(Cu)、砷(As)、鉬(Mo)、鎘(Cd)、銻(Sb)、鋇(Ba)、汞(Hg)、鉛(Pb)、鈧(Sc)、鍺(Ge)、銦(In)、鉍(Bi)、金(Au),共21種單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL,均來源于國家有色金屬及電子材料分析測試中心。右雷佐生原料藥(批號:19061401、19061402、19061403)(南京正大天晴制藥有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 元素雜質(zhì)的限度要求

根據(jù)ICH現(xiàn)行版Q3D元素雜質(zhì)指南中的注射劑PDE值(每日允許日暴露量),對1類元素(鎘Cd、鉛Pb、砷As、汞Hg);2A類元素(鈷Co、釩V、鎳Ni);3類元素(鋰Li、銻Sb、鋇Ba、鉬Mo、銅Cu、鉻Cr)及其他類生產(chǎn)中可能引入的元素(鋁Al、錳Mn、鐵Fe)雜質(zhì)進(jìn)行控制。由于注射用鹽酸右雷佐生每日攝入量不大于10 g,可采用ICH Q3D中限度計算方法1計算出各目標(biāo)元素的最大允許限度,將限度的30%定義為控制閾值,具體如表1所示。

表1 元素的PDE值及限度

2.2 儀器參數(shù)

ICP-MS儀器工作參數(shù)如表2所示。

表2 PE Nexion2000B儀器工作參數(shù)

2.3 檢測方法

內(nèi)標(biāo)溶液在線加入,取供試品溶液與對照品溶液進(jìn)樣,記錄同位素7Li、27Al、51V、52Cr、55Mn、57Fe、59Co、60Ni、63Cu、75As、98Mo、114Cd、121Sb、138Ba、202Hg、208Pb、45Sc、74Ge、115In、209Bi測定值。其中7Li、27Al、51V、52Cr、55Mn、57Fe、59Co、60Ni以45Sc作為內(nèi)標(biāo);65Cu、75As以74Ge作為內(nèi)標(biāo);98Mo、111Cd、121Sb、137Ba作為內(nèi)標(biāo);202Hg、208Pb以209Bi作為內(nèi)標(biāo)。按內(nèi)標(biāo)校正的標(biāo)準(zhǔn)加入法計算。

2.4 溶液的制備

2.4.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液

混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液①:分別精密量取鋰單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鋁單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、釩單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鉻單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、錳單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鐵單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鈷單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鎳單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、銅單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、砷單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鉬單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鎘單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、銻單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鋇單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、汞單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鉛單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量,用稀釋劑制得每1 mL含鋰2.5 μg、鋁50 μg、釩0.1 μg、鉻11 μg、錳2.5 μg、鐵13 μg、鈷0.05 μg、鎳0.2 μg、銅3 μg、砷0.15 μg、鉬15 μg、鎘0.02 μg、銻0.9 μg、鋇7 μg、汞0.03 μg、鉛0.05 μg的溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液②:精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液①2 mL,置10 mL量瓶中,用稀釋劑稀釋至刻度,搖勻,即得(每1 mL含鋰500 ng、鋁10 000 ng、釩20 ng、鉻2 200 ng、錳500 ng、鐵2 600 ng、鈷10 ng、鎳40 ng、銅600 ng、砷30 ng、鉬3 000 ng、鎘4 ng、銻180 ng、鋇1 400 ng、汞6 ng、鉛10 ng)。

2.4.2 內(nèi)標(biāo)液

分別精密量取銦單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鈧單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鍺單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、鉍單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、金單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量,用稀釋劑制得每1 mL含鈧2 μg、鍺2 μg、銦2 μg、鉍1 μg、金20 μg的溶液。

2.4.3 系列對照品溶液

供試品母液:取本品0.2 g,精密稱定,置50 mL量瓶中,用稀釋劑溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

精密量取供試品母液5 mL平行6份,分別精密加入內(nèi)標(biāo)液0.2 mL,后依次精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液②0,0.2,0.5,1.0,1.5,2 mL,用稀釋劑稀釋至10 mL,搖勻,即得(相當(dāng)于限度0%,20%,50%,100%,150%,200%)。同法制得空白溶液。

2.4.4 供試品溶液

取右雷佐生樣品0.1 g,精密稱定,置50 mL量瓶中,精密加入內(nèi)標(biāo)液1 mL,用稀釋劑溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得供試品溶液。同法制得試劑空白溶液。

2.4.5 加樣回收率溶液

取右雷佐生樣品0.1 g,精密稱定,置50 mL量瓶中,精密加入內(nèi)標(biāo)液1 mL,平行12份,平均分成4組,其中第一組精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.25 mL;第二組精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.5 mL;第三組精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1 mL;第四組精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1.5 mL,用稀釋劑溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得,即得相當(dāng)于限度25%,50%,100%,150%的加樣回收率溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn)

取“2.4.3系列對照品溶液”項(xiàng)下空白溶液和20%對照溶液,照“2.2 儀器參數(shù)”及“2.3檢測方法”項(xiàng)下測定,記錄各元素的離子響應(yīng)值,專屬性測定結(jié)果見表3。空白溶液響應(yīng)值均小于20%對照品溶液響應(yīng)值,空白溶液不干擾測定,表明本方法的專屬性良好。

表3 專屬性試驗(yàn)測定結(jié)果

2.5.2 線性關(guān)系試驗(yàn)

取“2.4.3系列對照品溶液”項(xiàng)下0%～200%的線性溶液,照“2.2 儀器參數(shù)”及“2.3檢測方法”項(xiàng)下測定,記錄各元素的離子響應(yīng)值,以待測元素濃度為橫坐標(biāo)(X),校正響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算回歸方程。線性測定結(jié)果見表4。各元素在相當(dāng)于限度濃度0%～200%范圍內(nèi),濃度與校正響應(yīng)值線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。

表4 線性與范圍測定結(jié)果

2.5.3 定量限與檢測限試驗(yàn)

照“2.4.4供試品溶液”項(xiàng)下配制試劑空白溶液,平行配制10份。照“2.2 儀器參數(shù)”及“2.3檢測方法”項(xiàng)下測定。儀器檢測限為連續(xù)測定10份試劑空白溶液響應(yīng)值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(3SD)所對應(yīng)的待測元素濃度;儀器定量限為連續(xù)測定10份試劑空白溶液響應(yīng)值的10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(10SD)所對應(yīng)的待測元素濃度,并根據(jù)方法供試品溶液配制的稀釋倍數(shù),分別計算方法檢測限和方法定量限,測定結(jié)果見表5。各元素檢測限均低于限度的10%;定量限均低于限度的30%,表明該方法靈敏度良好。

表5 檢測限和定量限結(jié)果(n=10)

2.5.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取“2.4.5加樣回收率溶液”項(xiàng)下溶液,照“2.2 儀器參數(shù)”及“2.3檢測方法”項(xiàng)下測定,計算各濃度下的平均回收率及RSD。準(zhǔn)確度測定結(jié)果見表6。16個元素的回收率均在93.0%～104.8%,RSD在0.9%～4.5%,表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表6 準(zhǔn)確度測定結(jié)果

2.5.5 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取“2.4.3系列對照品溶液”項(xiàng)下100%對照溶液,連續(xù)進(jìn)樣6針,照“2.2 儀器參數(shù)”及“2.3檢測方法”項(xiàng)下測定,計算測得濃度的RSD。各元素濃度值的RSD(n=6)在0.6%～2.1%,表明方法的進(jìn)樣精密度良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按照“2.4.5加樣回收率溶液”項(xiàng)下100%加樣回收率溶液配制,平行配制6份,照“2.2 儀器參數(shù)”及“2.3檢測方法”項(xiàng)下測定,計算6份加標(biāo)供試品中各元素含量的RSD。6份加標(biāo)供試品中各元素含量的RSD在0.3%～3.4%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.7 中間精密度試驗(yàn)

不同的分析人員在不同日期進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn),照“2.5.6重復(fù)性”項(xiàng)下方法重新配制6份加標(biāo)供試品溶液,測定加標(biāo)供試品溶液中各元素的含量,與重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果計算12次測量結(jié)果的RSD。12份加標(biāo)供試品中各元素含量的RSD在1.3%～3.6%(n=12),表明該方法中間精密度良好。

2.5.8 溶液穩(wěn)定性

取“2.4.3系列對照品溶液”項(xiàng)下100%對照溶液在室溫條件下,放置0,2,24 h后測定,考察對照品溶液中各元素的濃度變化情況,計算與0 h的比值(%)考察溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明在24 h內(nèi)對照品溶液中各元素測得濃度與0 h比值均在95.4%～103.8%范圍內(nèi),表明對照溶液在室溫下放置24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。由于本方法為標(biāo)準(zhǔn)加入法,供試品溶液與對照品溶液相同,故不需另行考察供試品溶液穩(wěn)定性。

2.6 樣品測定

取3批樣品(批號:75619120802、75619120803、75619120804),按“2.4.4”項(xiàng)下溶液配制方法配制供試品溶液,按“2.2 儀器參數(shù)”及“2.3檢測方法”項(xiàng)下測定,采用內(nèi)標(biāo)校正的標(biāo)準(zhǔn)加入法計算,結(jié)果如表7。3個批次中16個元素雜質(zhì)含量均遠(yuǎn)小于限度值,所測 16個元素雜質(zhì)均符合規(guī)定。

表7 樣品檢測結(jié)果

3 結(jié)論

驗(yàn)證結(jié)果表明:空白溶劑中各元素校正響應(yīng)值均小于20%對照品溶液元素校正響應(yīng)值,能滿足專屬性要求;16種元素雜質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.999,表明方法的線性關(guān)系良好;各元素檢測限均低于限度的10%;定量限均低于限度的30%,表明該方法靈敏度良好。精密度試驗(yàn)、準(zhǔn)確度試驗(yàn)均能滿足要求。采用該方法測定了3批右雷佐生原料藥中16種元素雜質(zhì)含量,測定結(jié)果顯示各目標(biāo)元素雜質(zhì)含量均小于其限度,滿足 ICH Q3D中元素雜質(zhì)限度要求。通過對右雷佐生元素雜質(zhì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證,確定該測定方法在指定的測定系統(tǒng)下可以用于右雷佐生中16種元素雜質(zhì)的檢測,保證元素含量測定檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,為該分析方法的科學(xué)性與合理性提供依據(jù)。