梁景文，朱國(guó)柱，羅澤君，姜學(xué)涯，苑婷婷

(深圳凱吉星農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)認(rèn)證有限公司，廣東 深圳 518000)

引 言

甲拌磷是上世紀(jì)50年代由美國(guó)氰胺公司開(kāi)發(fā)研制的一種高效有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，因其高性價(jià)比特性而被廣泛用于害蟲(chóng)防治方面[1]。在自然條件下，甲拌磷經(jīng)過(guò)氧化反應(yīng)會(huì)代謝為甲拌磷砜和甲拌磷亞砜[2]。由于甲拌磷及其代謝物的高毒性，對(duì)人體傷害大，已被國(guó)家禁用，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第536號(hào)[3]自2022年9月1日起，撤銷(xiāo)甲拌磷原藥及制劑產(chǎn)品的農(nóng)藥登記，禁止生產(chǎn)。目前我國(guó)農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2763[4]規(guī)定肉類(lèi)中甲拌磷的限量為0.02 mg/kg，其檢測(cè)方法參照GB/T 23210[5]規(guī)定的方法測(cè)定，而GB/T 23210適用于牛奶和奶粉中農(nóng)藥的測(cè)定，并不適用于肉類(lèi)中農(nóng)藥的測(cè)定。因此針對(duì)營(yíng)養(yǎng)豐富備受人們喜愛(ài)的牛肉這一食用農(nóng)產(chǎn)品，建立一種甲拌磷及其代謝物殘留量的檢測(cè)分析方法具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

目前檢測(cè)甲拌磷及其代謝物的主要方法有：熒光光度法[6]、氣相色譜法[7]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、液相色譜法[9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]等。其中熒光光度法、氣相色譜法和液相色譜法存在基質(zhì)干擾較大，靈敏度低等缺點(diǎn)，氣相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法存在前處理繁瑣，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。目前我國(guó)尚未發(fā)布有關(guān)牛肉中甲拌磷及其代謝物檢測(cè)方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，因而急需建立一種實(shí)用且快速檢測(cè)牛肉中甲拌磷及其代謝物的分析方法，滿足食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的限量規(guī)定以及行業(yè)的訴求。本研究采用QuEChERS技術(shù)同時(shí)結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，開(kāi)發(fā)一種適用于牛肉中甲拌磷及其代謝物的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料 AB SCIEX QUAD 5500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀；離心機(jī)；Millipore Q純水機(jī)；MS 3 basic旋渦振蕩器；移液槍?zhuān)籕uEChERS鹽包、QuEChERS凈化管、0.22 μm有機(jī)濾膜；牛肉樣品。

甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜(純度≥98%)；甲醇、乙腈(色譜純)；甲酸、乙酸(分析純)；乙酸銨(分析純)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜各10.0 mg，用甲醇溶解并稀釋至100 mL，搖勻，制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-18℃避光保存，有效期3個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：分別準(zhǔn)確吸取甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各1 mL，用甲醇稀釋至10 mL，搖勻，制成10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，再次準(zhǔn)確吸取10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1 mL，用甲醇稀釋至10 mL，搖勻，制成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，0℃～4℃避光保存，有效期1個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取10、20、50、100、200 μL上述1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用甲醇稀釋至 1 mL，得到質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理 稱取10 g(精確至0.01 g)制備好的試樣置于50 mL離心管中，加入20 mL 含1%乙酸的乙腈溶液提取分離，-18℃冷凍放置20 min；加入QuEChERS鹽包迅速振搖至不發(fā)熱，5 000 r/min離心2 min。取上層液6 mL至15 mL 的QuEChERS凈化管中，渦旋3 min；5 000 r/min離心2 min，上清液供分析。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3(2.1 mm×150 mm，3 μm)，柱溫：40℃；流動(dòng)相A：10 mmol/L乙酸銨(加0.1%甲酸)溶液；流動(dòng)相B：甲醇；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5.0 μL；梯度洗脫程序(表1)。

表1 梯度洗脫程序

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)；掃描模式：正離子模式；電離電壓：5 500 V；霧化溫度：550℃；噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)；甲拌磷及其代謝物定性定量離子對(duì)及去簇電壓、碰撞能量(表2)。

表2 甲拌磷及其代謝物定性定量離子對(duì)及去簇電壓、碰撞能量

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器工作條件的選擇

2.1.1 色譜條件 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中多農(nóng)殘時(shí)常用含無(wú)機(jī)酸的無(wú)機(jī)鹽溶液和甲醇溶液作為流動(dòng)相[11]，經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，選擇的流動(dòng)相見(jiàn)1.2.3節(jié)，在此條件下，甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜均能得到有效分離，且色譜峰峰形良好。

2.1.2 質(zhì)譜條件 甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜屬于磷酸酯類(lèi)小分子農(nóng)藥，分子量為260.38、276.37、292.38，因此本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的小分子質(zhì)譜離子對(duì)優(yōu)化方法電離其碎片離子對(duì)。通過(guò)優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，得到甲拌磷及其代謝物響應(yīng)最佳的一對(duì)離子對(duì)用于定性定量分析(表2)，其中甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜的母離子均帶單電荷。

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1 萃取溶劑的優(yōu)化 由于牛肉中含有豐富的蛋白質(zhì)，在進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)前需要去除蛋白，而甲拌磷及其代謝物的極性較強(qiáng)，易溶于甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，同時(shí)有機(jī)溶劑具有使牛肉中的蛋白質(zhì)變性發(fā)生沉淀的效果[12]，因此本試驗(yàn)考察甲醇和乙腈作提取試劑進(jìn)行分析。結(jié)果表明：當(dāng)選擇乙腈作為提取試劑，待測(cè)牛肉中蛋白質(zhì)去除的效果較好，但是甲拌磷及其代謝物的提取效率不高，而當(dāng)選擇含有1%乙酸的乙腈溶液作為提取試劑時(shí)，不僅牛肉蛋白質(zhì)去除效果較好，且提取效率>75%，這是因?yàn)榧装枇准捌浯x物在酸性條件下穩(wěn)定不易分解。因此本試驗(yàn)選擇含有1%乙酸的乙腈溶液作為提取試劑。

2.2.2 凈化方法的優(yōu)化 QuEChERS樣品前處理方法，具有操作簡(jiǎn)便、處理速度快且溶劑消耗量少等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境和土壤污染物檢測(cè)中[13，14]。因此本試驗(yàn)采用高效的QuEChERS萃取鹽包及凈化管，通過(guò)簡(jiǎn)單的離心操作，將甲拌磷及其代謝物與牛肉樣品中的干擾組分(如脂肪酸、色素、脂類(lèi)等)分離。QuEChERS萃取鹽包中MgSO4用于除去樣品中的水分，其他緩沖鹽可調(diào)節(jié)樣品溶液pH值，確保對(duì)堿性敏感的農(nóng)藥也有較好的回收率。由于加入萃取鹽包后會(huì)放出大量熱，導(dǎo)致甲拌磷及其代謝物分解，因此需在-18℃冷凍放置20 min后再加入鹽包迅速振搖至不發(fā)熱，這樣可以確保提高甲拌磷及其代謝物的回收率。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng) 分別用空白樣品溶液和含1%乙酸的乙腈溶液配制的10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以各標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值與1的差值作為基質(zhì)效應(yīng)值[15]，以考察基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果(表3)。

表3 甲拌磷及其代謝物的基質(zhì)效應(yīng)

表4 甲拌磷及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

由表3可知：牛肉基質(zhì)對(duì)甲拌磷及其代謝物存在較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，為了降低基質(zhì)的影響，試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 線性范圍、檢出限和定量限 準(zhǔn)確移取1 μg/mL適量甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加到10.00 g空白樣品中，濃度為10、20、50、100、200 ng/mL的各系列空白添加試料，在上述液相色譜和質(zhì)譜條件下測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)Y，化合物濃度為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。研究結(jié)果表明，甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜在質(zhì)量濃度 10～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r為 0.998 8～0.999 5，檢出限為 3 ng/mL，定量限為10 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(圖1)。

圖1 甲拌磷及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.3.3 回收率和精密度 選取空白樣品，分別添加 3 個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平制備 6 個(gè)平行樣品進(jìn)行添加回收率，在添加濃度范圍內(nèi)，甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜的回收率為77.2%～93.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.8%～6.2%，能夠滿足檢測(cè)方法的要求，結(jié)果(表5)。

表5 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定 采用本研究建立的方法檢測(cè)深圳農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的20個(gè)牛肉樣品，其中甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜均未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了QuEChERS技術(shù)同時(shí)結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛肉中甲拌磷及其代謝物殘留的分析方法，甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜在質(zhì)量濃度 10～200 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為 3 ng/mL，定量限為 10 ng/mL。本方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，能夠滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的牛肉中甲拌磷及其代謝物殘留限量的檢測(cè)要求。