趙 彪，馮 旭，賀付蒙，徐永清，石齊海，馮艷忠，李鳳蘭

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000）

硒是促進(jìn)植物生長(zhǎng)的有益元素，也是人體必需的稀有元素之一[1-2]。合理地?cái)z入硒可有效預(yù)防癌癥、排毒解毒、抗衰老、提高免疫力和紅細(xì)胞攜氧能力等[3-4]。但人體自身無法合成也不能在體內(nèi)長(zhǎng)期保存硒元素，因此，必須通過膳食攝入補(bǔ)充[5]。我國(guó)居民人均硒攝入量為26～32μg∕d，遠(yuǎn)低于中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)推薦的成人膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量60～250μg∕d[6]。食物中硒元素以無機(jī)（亞硒酸鈉和硒酸鈉）和有機(jī)（硒谷氨酸）形式存在，機(jī)體對(duì)有機(jī)硒的利用率高于無機(jī)硒[7]。目前，公認(rèn)最安全、有效和科學(xué)的補(bǔ)硒方法為食用富硒農(nóng)產(chǎn)品[8]。大米作為我國(guó)居民的主食之一，其硒元素的含量與居民健康密切相關(guān)。因此，促進(jìn)水稻富硒，進(jìn)而提高水稻籽粒硒含量，對(duì)提高居民健康水平具有重要意義。水稻屬于非特異性富硒作物，只能通過外源施加硒元素提高水稻硒積累[9]。

水稻富硒的途徑主要有土壤施硒肥、硒肥浸種拌種和葉面施硒肥，但前2 種成本太高。葉面噴施硒肥可有效利用生物富集和轉(zhuǎn)化作用，將不可食用的無機(jī)硒轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C(jī)硒[10]。硒肥分為無機(jī)硒肥和有機(jī)硒肥，不同形態(tài)硒的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑不同，水稻籽粒中以硒代胱∕半胱氨酸和硒代蛋氨酸的有機(jī)硒形態(tài)存在。研究發(fā)現(xiàn)，施用無機(jī)硒肥，其在水稻莖葉滯留嚴(yán)重，影響籽粒對(duì)硒的吸收，而葉面施有機(jī)硒肥可提高籽粒中硒的積累[11-13]。LONG 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施有機(jī)硒可減少硒在水稻其他器官中的累積和滯留，提高籽粒中硒的利用率。微生物肥因具有提供營(yíng)養(yǎng)、控制病害和改良土壤等附加作用而發(fā)展迅猛[15]。不同微生物自身活性物質(zhì)不同，富硒能力有較大差異。酵母普遍具有強(qiáng)大且穩(wěn)定的富硒能力，最高富硒量可達(dá)4 mg∕g，主要通過高半胱氨酸合酶∕半胱氨酸合酶途徑將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為高活性的有機(jī)硒，是理想的富硒微生物載體[16]。EM（Effective microorganisms）菌是一種包含光合菌、乳酸菌等的復(fù)合生物菌劑，具有提高作物品質(zhì)、減少農(nóng)藥和化肥用量等功效[17]。同時(shí)，施用EM 菌肥可顯著降低土地管理和肥料成本，提升作物抗逆性和產(chǎn)量[18-19]。目前，關(guān)于酵母和EM 菌兩者相結(jié)合的復(fù)合肥研究尚未見報(bào)道，更未見其對(duì)水稻產(chǎn)量、品質(zhì)的影響研究。為此，以EM 菌液為發(fā)酵液，考察酵母接種量、無機(jī)硒質(zhì)量濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和pH值對(duì)EM 富硒酵母菌劑有機(jī)硒質(zhì)量濃度的影響，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，獲得最佳EM 富硒酵母菌劑的制備工藝；同時(shí)探討了EM 富硒酵母菌劑對(duì)水稻硒含量、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，為EM 富硒酵母菌劑的后期開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻品種龍稻18 和EM 菌液（有效活菌數(shù)＞106cfu∕mL，主要成分為光合細(xì)菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、放線菌和丁酸梭菌等）由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供；酵母（Saccharomyces cerevisiae）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)寒地藥用植物資源平臺(tái)提供；1 000 mg∕L硒標(biāo)準(zhǔn)液和亞硒酸鈉均購(gòu)自哈爾濱市泰思閣生物科技有限公司；津國(guó)有機(jī)硒素（有機(jī)硒質(zhì)量濃度＞6 g∕L）由唐山津國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)開發(fā)有限公司研制。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 EM 富硒酵母菌劑制備工藝條件的單因素試驗(yàn) 取亞硒酸鈉、紅糖30 g、酵母、3 L EM 菌液加入玻璃發(fā)酵罐中，充分混勻，調(diào)節(jié)pH 值后恒溫發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)行EM 富硒酵母菌劑制備的單因素試驗(yàn)。預(yù)設(shè)酵母接種量8%、無機(jī)硒質(zhì)量濃度5 g∕L、pH值4.0、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間3 d 為單因素試驗(yàn)中的常規(guī)值，分別研究不同酵母接種量（4%、6%、8%、10%、12%）、無機(jī)硒質(zhì)量濃度（1、3、5、7、9 g∕L）、pH 值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、發(fā)酵溫度（24、26、28、30、32 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（1、2、3、4、5 d）對(duì)EM 富硒酵母菌劑有機(jī)硒質(zhì)量濃度的影響，確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.2.2 EM 富硒酵母菌劑制備工藝條件的響應(yīng)面試驗(yàn) 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取影響因素及水平，見表1。根據(jù)Box-Behnken 中心組合原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)。試驗(yàn)組合總數(shù)N=2k+2k+n0，式中，k表示獨(dú)立變量個(gè)數(shù)，n0表示中心點(diǎn)在試驗(yàn)中的重復(fù)次數(shù)。分析各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，擬合回歸曲線，預(yù)測(cè)最優(yōu)發(fā)酵工藝條件[20]。按最優(yōu)工藝條件進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)最佳發(fā)酵工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 EM富硒酵母菌劑制備工藝條件的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Response surface test design for the preparation process conditions of EM selenium-enriched yeast agent

1.2.3 EM 富硒酵母菌劑在水稻上應(yīng)用的大田試驗(yàn) 在黑龍江省肇東市（125°22′～126°22′E、45°10′～46°20′N）進(jìn)行分區(qū)對(duì)比試驗(yàn)，樣地土壤養(yǎng)分含量見表2。水稻灌漿初期，設(shè)置3 個(gè)噴施處理，分別噴施清水（CK）、EM富硒酵母菌劑和津國(guó)有機(jī)硒素，每個(gè)處理500 m2，3 次重復(fù)，每500 m2使用0.187 L，稀釋30 倍，每7 d 噴施一次，連續(xù)噴施3 次。2021 年4 月14 日育苗，5 月11 日插秧，種植密度14 cm×30 cm（即24萬穴∕hm2），每穴3～5株。肥料分為基肥、蘗肥和穂肥，基肥：史丹利復(fù)合肥（N-P2O5-K2O：15-15-15）150 kg∕hm2；蘗肥：史丹利復(fù)合肥60 kg∕hm2；穂肥：史丹利復(fù)合肥60 kg∕hm2。田間管理一致。

表2 土壤養(yǎng)分含量Tab.2 Soil nutrient content

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 酵母菌劑有機(jī)硒質(zhì)量濃度 采用紫外分光光度法繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。采用梯度稀釋法將1 000 mg∕L 硒標(biāo)準(zhǔn)液配制成0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg∕L硒溶液。向各梯度硒溶液中加入2 mL EDTA-2Na溶液，混勻后調(diào)pH 值至1.5～2.0，30 ℃水浴22 min，加入10 mL 甲苯振蕩萃取后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)333 nm 下甲苯層的吸光度A 并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用紫外分光光度法測(cè)定EM 富硒酵母菌劑的總硒質(zhì)量濃度和無機(jī)硒質(zhì)量濃度[21]。其中，發(fā)酵液消化處理后直接測(cè)總硒質(zhì)量濃度；發(fā)酵液在65 ℃、40 kHz 下超聲1 h 后過濾，測(cè)定濾液中硒質(zhì)量濃度即為無機(jī)硒質(zhì)量濃度。由總硒質(zhì)量濃度和無機(jī)硒質(zhì)量濃度計(jì)算有機(jī)硒質(zhì)量濃度，公式如下。

式中：X表示硒質(zhì)量濃度；C表示標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)硒質(zhì)量濃度；m表示樣品體積；V為測(cè)定時(shí)吸取消解液的體積；N1為樣品測(cè)定時(shí)的稀釋倍數(shù)；N2為樣品消化時(shí)的稀釋倍數(shù)。

1.3.2 莖和葉硒含量 在水稻乳熟期、蠟熟期，取各小區(qū)水稻的葉和莖，采用紫外分光光度法測(cè)定有機(jī)硒含量[21]。

1.3.3 產(chǎn)量及其構(gòu)成因素 成熟期，隨機(jī)選取3 點(diǎn)取樣，每點(diǎn)取1 m2內(nèi)相連的28株水稻植株進(jìn)行有效穗數(shù)、空癟率和千粒質(zhì)量等指標(biāo)測(cè)定[22]。

1.3.4 品質(zhì)指標(biāo) 籽粒硒含量采用氫化物原子熒光光譜法（GB 5009.93—2017）測(cè)定[23]，直鏈淀粉含量采用分光光度法（NY∕T 2639—2014）測(cè)定[24]，粗蛋白含量采用分光光度法（GB 5009.5—2016）測(cè)定[25]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析，采用Excel 2019、GraphPad Prism 8.0.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、繪圖及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EM富硒酵母菌劑制備工藝條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酵母接種量 由圖1A 可知，發(fā)酵液中有機(jī)硒質(zhì)量濃度隨酵母接種量的增加呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)。當(dāng)酵母接種量達(dá)到10%時(shí)，發(fā)酵液中有機(jī)硒質(zhì)量濃度最高；之后隨著酵母接種量增加，發(fā)酵液中有機(jī)硒質(zhì)量濃度減少。因此，酵母接種量以10%最佳。

圖1 不同發(fā)酵條件對(duì)EM富硒酵母菌劑中有機(jī)硒質(zhì)量濃度的影響Fig.1 Effect of different fermentation conditions on the concentration of organic selenium in EM selenium-enriched yeast agent

2.1.2 無機(jī)硒質(zhì)量濃度 由圖1B可知，有機(jī)硒質(zhì)量濃度隨無機(jī)硒質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，在5 g∕L 下，底物與酵母中半胱氨酸合酶的結(jié)合達(dá)到飽和，發(fā)酵液中有機(jī)硒質(zhì)量濃度最高。因此，無機(jī)硒質(zhì)量濃度以5 g∕L最佳。

2.1.3 pH 值 pH 值可影響微生物生長(zhǎng)代謝和酶解效率。由圖1C 可知，當(dāng)pH 值在3.0～5.0 時(shí)，發(fā)酵液中有機(jī)硒質(zhì)量濃度隨pH值變化較小，以pH值為4.0時(shí)最高。因此，pH值以4.0最佳。

2.1.4 發(fā)酵溫度 溫度是影響發(fā)酵反應(yīng)和酶促反應(yīng)的重要因素之一。由圖1D 可知，發(fā)酵液中有機(jī)硒質(zhì)量濃度隨發(fā)酵溫度的升高呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度升高至30 ℃時(shí)，發(fā)酵液中有機(jī)硒質(zhì)量濃度最高；隨溫度繼續(xù)升高，酶活性受到抑制，導(dǎo)致發(fā)酵液有機(jī)硒質(zhì)量濃度下降。因此，發(fā)酵溫度以30 ℃為宜。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間 適宜的發(fā)酵時(shí)間可保證有機(jī)硒的充分轉(zhuǎn)化。由圖1E 可知，隨發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵液中有機(jī)硒質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，在3 d 時(shí)達(dá)到最高，之后發(fā)酵液中有機(jī)硒質(zhì)量濃度基本不變。因此，發(fā)酵時(shí)間以3 d為宜。

2.2 EM富硒酵母菌劑制備工藝條件的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 綜合2.1 中單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度影響較大的3 個(gè)因素酵母接種量（A）、無機(jī)硒質(zhì)量濃度（B）和發(fā)酵溫度（C）進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。將表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到表示有機(jī)硒質(zhì)量濃度與各因素間關(guān)系的二次多項(xiàng)式回 歸 方 程 ：Y=844.00-25.75A-2.00B+7.75C-14.75AB-2.25AC+42.75BC-89.63A2-82.12B2-62.63C2。

表3 EM富硒酵母菌劑制備工藝條件的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Response surface test results of EM selenium-enriched yeast agent preparation process conditions

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。該模型的P值為0.000 7（P＜0.01），即噪音影響僅0.07%的可能性，說明該模型極顯著。在該模型中，A、BC、A2、B2和C2的P值均小于0.05，說明A、BC、A2、B2和C2是重要的模型項(xiàng)。失擬項(xiàng)P值0.147 0（P＞0.05），說明擬合的回歸曲線與實(shí)際情況相符合，該模型可用于發(fā)酵工藝的分析和預(yù)測(cè)。各因素對(duì)響應(yīng)值的影響顯著性可用檢驗(yàn)值F評(píng)價(jià)，F(xiàn)（A）=7.57，F(xiàn)（B）=0.05，F(xiàn)（C）=0.69，即各因素對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度的影響表現(xiàn)為酵母接種量＞發(fā)酵溫度＞無機(jī)硒質(zhì)量濃度。由各因素P值可以發(fā)現(xiàn)，酵母接種量（A）對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度的影響極顯著（P＜0.01）；二次項(xiàng)A2、B2和C2的P值均小于0.01，對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度的影響極顯著；兩兩交互作用中，BC 對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度的影響極顯著（P＜0.01），說明無機(jī)硒質(zhì)量濃度與發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度的影響比較大?；貧w方程的誤差統(tǒng)計(jì)分析中，R2=0.954 0，=0.894 8，顯示該模型可反映89.48%的響應(yīng)值變化；變異系數(shù)為3.61%，表明該模型能較好地反映真實(shí)試驗(yàn)值。綜上表明，該模型對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度具有較好的擬合度，可用于EM 富硒酵母菌劑制備工藝優(yōu)化。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Tab.4 Results of regression model ANOVA

2.2.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖形是對(duì)響應(yīng)值對(duì)應(yīng)試驗(yàn)因素的回歸方程的形象描述，響應(yīng)曲面的坡度反映該因素對(duì)響應(yīng)值的影響。等高線圖是三維曲面圖的投影，等高線的橢圓化程度反映兩兩因素間交互作用大小。等高線的密集程度反映該因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度。由圖2 可知，BC 交互作用的曲面彎曲程度最大，等高線圖呈橢圓形，說明BC 交互作用對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度的影響最大，AB次之。

圖2 酵母接種量、無機(jī)硒質(zhì)量濃度和發(fā)酵溫度兩兩交互作用對(duì)EM富硒酵母菌劑中有機(jī)硒質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of interactions of yeast inoculation，inorganic selenium concentration and fermentation temperature on the concentration of organic selenium in EM selenium-enriched yeast agent

如圖2A 所示，等高線橢圓形說明AB 間有交互作用，相較于無機(jī)硒質(zhì)量濃度，酵母接種量對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度影響作用更強(qiáng)。在無機(jī)硒質(zhì)量濃度一定時(shí)，有機(jī)硒質(zhì)量濃度隨酵母接種量升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在酵母接種量10%、無機(jī)硒質(zhì)量濃度5 g∕L時(shí)達(dá)到頂點(diǎn)。

如圖2B 所示，等高線近橢圓形說明AC 間交互作用不明顯，相較于發(fā)酵溫度，酵母接種量對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度影響更大。在發(fā)酵溫度一定時(shí)，有機(jī)硒質(zhì)量濃度隨酵母接種量的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在酵母接種量10%、發(fā)酵溫度30 ℃時(shí)達(dá)到頂點(diǎn)。

如圖2C 所示，等高線橢圓形說明BC 間交互作用明顯，相較無機(jī)硒質(zhì)量濃度，發(fā)酵溫度對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度的影響更大。在無機(jī)硒質(zhì)量濃度一定時(shí)，有機(jī)硒質(zhì)量濃度隨發(fā)酵溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在無機(jī)硒質(zhì)量濃度5 g∕L、發(fā)酵溫度30 ℃時(shí)達(dá)到頂點(diǎn)。

2.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果由回歸模型得出，EM 富硒酵母菌劑制備的最佳條件：在3 L EM 菌液中，酵母接種量10%、無機(jī)硒質(zhì)量濃度5 g∕L、發(fā)酵溫度30 ℃，預(yù)測(cè)有機(jī)硒質(zhì)量濃度為846.14 mg∕L。對(duì)上述條件進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，得到EM 富硒酵母菌劑的平均有機(jī)硒質(zhì)量濃度為833.61 mg∕L。0.20%的RSD和1.50%的相對(duì)誤差表明該優(yōu)化模型具備較好的穩(wěn)定性。

2.3 EM富硒酵母菌劑在水稻富硒生產(chǎn)中的應(yīng)用

2.3.1 莖、葉硒含量 水稻葉中有機(jī)硒含量可反映硒的吸收情況。由圖3A 可以看出，對(duì)于水稻葉片，乳熟期，EM 富硒酵母菌劑處理有機(jī)硒含量較CK 和津國(guó)有機(jī)硒素處理顯著提高，分別提高72.68%和84.36%；蠟熟期，EM 富硒酵母菌劑處理有機(jī)硒含量與CK 和津國(guó)有機(jī)硒素處理無顯著差異，且三者均低于乳熟期。由圖3B 可以看出，對(duì)于水稻莖，乳熟期，EM 富硒酵母菌劑處理有機(jī)硒含量較CK 和津國(guó)有機(jī)硒素處理顯著降低，以津國(guó)有機(jī)硒素處理最高；蠟熟期，EM 富硒酵母菌劑處理有機(jī)硒含量與CK 無顯著差異，兩者均顯著低于津國(guó)有機(jī)硒素處理，且除EM 富硒酵母菌劑處理外均低于乳熟期。綜上，水稻葉對(duì)EM 富硒酵母菌劑的吸收主要在乳熟期。

圖3 EM富硒酵母菌劑對(duì)水稻葉（A）、莖（B）有機(jī)硒含量的影響Fig.3 Effect of EM selenium-enriched yeast agent on organic selenium content of rice leaves（A）and stems（B）

2.3.2 產(chǎn)量及其構(gòu)成因素 由表5可知，與CK和津國(guó)有機(jī)硒素處理相比，EM 富硒酵母菌劑處理水稻空癟率顯著降低，分別降低24.84%和21.23%；有效穗數(shù)分別提高6.39%和17.03%，但差異不顯著；千粒質(zhì)量差異不顯著；產(chǎn)量為7 114.95 kg∕hm2，分別提高8.38%和7.52%，但差異不顯著。說明噴施EM 富硒酵母菌劑對(duì)水稻有一定的增產(chǎn)作用，但不顯著。

表5 EM富硒酵母菌劑對(duì)水稻產(chǎn)量及其構(gòu)成因素的影響Tab.5 Effect of EM selenium-enriched yeast agent on rice yield and its components

2.3.3 品質(zhì) 直鏈淀粉含量與稻米硬度、咀嚼性和彈性呈極顯著正相關(guān)，而與黏度呈極顯著負(fù)相關(guān)，是水稻口感的主要影響因素[26]。蛋白質(zhì)是稻米的主要營(yíng)養(yǎng)成分，其含量決定了稻米的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。由表6可知，EM 富硒酵母菌劑處理籽粒直鏈淀粉含量最高，分別較CK 和津國(guó)有機(jī)硒素處理提高20.60%和30.86%，但3 個(gè)處理間差異不顯著；3 個(gè)處理間粗蛋白含量差異也不顯著；EM 富硒酵母菌劑處理硒含量最高，為0.24 mg∕kg，較CK顯著提高23倍，且高于津國(guó)有機(jī)硒素處理。根據(jù)GB∕T 22499—2008《富硒稻谷》規(guī)定，富硒稻谷的硒元素含量為0.04～0.30 mg∕kg[27]，低于這個(gè)范圍屬于低硒稻谷，高于這個(gè)范圍的稻谷具有毒性，不宜食用?？梢姡珽M 富硒酵母菌劑處理稻米中硒含量達(dá)到富硒稻谷要求。

表6 EM富硒酵母菌劑對(duì)水稻籽粒直鏈淀粉、粗蛋白和硒含量的影響Tab.6 Effect of EM selenium-enriched yeast agent on the contents of amylose，crude protein and selenium in rice grain

3 結(jié)論與討論

本研究以EM 菌液作為發(fā)酵液、無機(jī)硒為底物探究各發(fā)酵條件對(duì)有機(jī)硒轉(zhuǎn)化的影響，主要考察酵母接種量、無機(jī)硒質(zhì)量濃度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和pH 值對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件：在3 L EM菌液中，酵母接種量10%、無機(jī)硒質(zhì)量濃度5 g∕L、發(fā)酵溫度30 ℃、pH值4.0、發(fā)酵時(shí)間3 d；影響有機(jī)硒轉(zhuǎn)化的因素表現(xiàn)為酵母接種量＞發(fā)酵溫度＞無機(jī)硒質(zhì)量濃度；該條件下有機(jī)硒質(zhì)量濃度達(dá)833.61 mg∕L，而且具備較好的穩(wěn)定性。發(fā)酵溫度增加使有機(jī)硒質(zhì)量濃度先增后減，可能是因?yàn)闇囟冗^高抑制微生物代謝和酶活性所致[28]。隨著酵母接種量變化，有機(jī)硒質(zhì)量濃度變化較大，這可能與酵母-EM 菌群的相互作用有關(guān)，酵母接種量影響EM 菌群中微生物的生長(zhǎng)速度和發(fā)酵產(chǎn)物的組成，接種量10%時(shí)發(fā)酵罐中底物、營(yíng)養(yǎng)與酵母量配比適宜，半胱氨酸合酶含量高，轉(zhuǎn)化速率高[29-30]。pH 值對(duì)有機(jī)硒質(zhì)量濃度影響微弱，可能是因?yàn)镋M 菌群通過自身代謝物調(diào)節(jié)環(huán)境pH 值，使發(fā)酵罐內(nèi)pH 值穩(wěn)定在適宜的范圍內(nèi)[31]。

硒的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)是決定稻米中硒含量的關(guān)鍵，CAREY 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，硒可能通過直接從莖向籽粒、劍葉向籽粒2 種途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，但EM 富硒酵母菌劑處理水稻在乳熟期和蠟熟期莖中硒含量低于CK，可能是乳熟期之前已完成轉(zhuǎn)運(yùn)。相較于水稻對(duì)亞硒酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中的硒滯留情況[33]，EM富硒酵母菌劑基本沒有。

張昊楠[34]研究發(fā)現(xiàn)，硒元素可以促進(jìn)水稻根系生長(zhǎng)和種子萌發(fā)。馬潔等[35]研究發(fā)現(xiàn)，葉面施硒對(duì)水稻千粒質(zhì)量、穗粒數(shù)無顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，施用EM 富硒酵母菌劑可顯著降低水稻空癟率，提高有效穗數(shù)和產(chǎn)量，但差異也不顯著。HOEWYK[36]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中硒代半胱氨酸可非特異性地參與蛋白質(zhì)的合成，因半胱氨酸殘基是大部分蛋白酶的活性中心位置，硒代半胱氨酸積累量可影響蛋白酶的折疊和催化功能，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成。但本研究中粗蛋白含量變化不顯著。EM 富硒酵母菌劑可應(yīng)用于寒地水稻的富硒生產(chǎn)，可使糙米中硒含量達(dá)0.24 mg∕kg，符合GB∕T 22499—2008《富硒稻谷》[27]規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。