李婷婷 陸冰洋 丁樹榮 唐娟 王彩先 劉華棟

關(guān)鍵詞：鴿源Ⅰ型副黏病毒（PPMV-1）；RT-PCR；大腸桿菌；藥敏試驗；抗體效價

鴿副黏病毒病是由鴿源Ⅰ型副黏病毒（PigeonParamyxovirusType1，PPMV-1）引起的一種鴿急性、高度接觸性傳染病，又稱鴿新城疫。PPMV-1病毒是經(jīng)典新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）的變異株，最早在20世紀(jì)70年代中東地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，隨后該病毒在世界范圍內(nèi)流行[1]。PPMV-1可經(jīng)呼吸道和消化道傳播，對不同日齡和品種的鴿均有易感性；該病毒對成年鴿損傷較輕，多表現(xiàn)為無癥狀感染，但對乳鴿或幼齡鴿危害較大[2]，感染后表現(xiàn)為扭頸、斜翅等神經(jīng)癥狀，死亡率可達(dá)50%～80%[3-4]。隨國內(nèi)市場對鴿肉需求量的逐漸增大，肉鴿養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，鴿群感染PPMV-1的報道屢見不鮮[5-6]，該病對鴿群危害巨大，需進(jìn)行重點(diǎn)防控。

鴿副黏病毒病與雞新城疫癥狀相似，若對飼養(yǎng)環(huán)境不進(jìn)行控制，通常伴有其他細(xì)菌感染[7-8]。李杰峰等[9]調(diào)查顯示，新城疫病毒發(fā)生混合感染遠(yuǎn)高于其他病毒，在新城疫病毒的混合感染中，以大腸桿菌最為常見。大腸桿菌是動物體內(nèi)一種條件性致病菌，大腸桿菌和鴿副黏病毒是引發(fā)鴿場疫情的“最佳搭檔”，混合感染使鴿群發(fā)病率和死亡率均升高，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2022年5月，太原市郊區(qū)某肉鴿場疑似發(fā)生鴿新城疫，表現(xiàn)為13～15d乳鴿精神沉郁、食欲減退、拉綠色稀便、斜頸等癥狀，每日死亡乳鴿10只左右；剖檢可見病鴿腺胃乳頭間和腸道彌漫性出血，黏膜變薄，盲腸扁桃體出血，脾臟、腎臟腫大，氣管充血，肝臟表面有少量的白色纖維素性沉淀物，但成年鴿無明顯臨床癥狀。

本研究通過臨床診斷，采集病鴿組織病料進(jìn)行病毒PCR鑒定、病毒和細(xì)菌的分離培養(yǎng)、細(xì)菌生化鑒定、藥敏試驗等實驗室診斷，以確診其是否為鴿副黏病毒繼發(fā)大腸桿菌的混合感染，并通過血清抗體檢測及動物回歸試驗分析發(fā)病原因，制定綜合防治措施。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 15d未免疫健康乳鴿購自山西谷鴿兒鴿業(yè)有限公司；SPF雞胚購自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所SPF試驗場，14dSPF雛雞由SPF雞胚孵化。試驗動物飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)醫(yī)學(xué)研究室動物房內(nèi)。

1.1.2 病料 2022年5月，采集太原郊區(qū)某肉鴿場發(fā)病乳鴿咽肛拭子，將拭子分別在病鴿的喉頭和泄殖腔內(nèi)旋轉(zhuǎn)擦拭后取出，折斷拭子頭留于采樣管中。針對病死乳鴿，剖檢后無菌采集腦、肺、肝、脾等組織并做好標(biāo)記，-20℃保存?zhèn)溆?。隨機(jī)選取發(fā)病鴿群的20只乳鴿和10對親本成年鴿，翼下靜脈采血2mL/只，于2000r/min離心5min，分離血清，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要儀器與試劑 一次性采樣器，購自漢威生物科技有限公司；RNA核酸提取試劑盒、新城疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒，購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染液和全部生化試劑，購自杭州濱和微生物試劑公司；抗菌藥敏紙片，購自杭州微生物試劑公司；新城疫血凝抑制試驗抗原，購自青島易邦生物工程有限公司。

將三糖鐵瓊脂倒入試管制成斜面，其余瓊脂均制成平板。1%雞紅細(xì)胞懸液、新城疫陽性和陰性抗原由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究室制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 鴿源Ⅰ型副黏病毒（PPMV-1）RT-PCR鑒定 拭子樣本經(jīng)渦旋振蕩后吸取100μL備用。稱取病死鴿肺臟和脾臟組織各1g，剪碎后取0.05g混合物加入1.5mL無菌生理鹽水研磨，勻漿后8000r/min離心2min，吸取100μL上清備用。

按照柱式RNA核酸提取試劑盒和新城疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒使用說明書提取PPMV-1的RNA，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和電泳檢測。

1.2.2 病毒的分離培養(yǎng) 取病死鴿病料組織，研磨勻漿后反復(fù)凍融3次，加入終濃度為4000IU/mL的青-鏈霉素雙抗，室溫下靜置感作2h。10000r/min離心15min后吸取上清，經(jīng)0.22μm的一次性細(xì)菌過濾器過濾后，按照0.2mL/枚的劑量，接種于5枚10d的SPF雞胚尿囊腔中，在溫度37℃、濕度60%的孵化箱中孵育，每8h照蛋一次，棄去24h內(nèi)疑似細(xì)菌感染的死亡雞胚，收集24～96h內(nèi)死亡雞胚及其尿囊液，觀察死亡雞胚的病理變化，并連傳3代。

將收獲的尿囊液，并按照《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T16550—2008）方法[10]進(jìn)行血凝試驗（HA）。將HA檢測陽性的尿囊液用NDV（新城疫病毒）和H5和H9亞型AIV（禽流感病毒）標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行血凝抑制試驗（HI），將陽性病毒尿囊液保存于-70℃。

1.2.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 在無菌條件下挑取病死鴿的心血、肝臟和脾臟組織液于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，37℃恒溫條件下培養(yǎng)18～24h。挑取單個菌落，分別劃線接種于麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂，穿刺接種于三糖鐵斜面并涂布表面，37℃再培養(yǎng)24h，觀察各菌落生長情況，挑取分離單個菌落涂片，革蘭氏染色后鏡檢。

1.2.4 細(xì)菌的生化鑒定 挑取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)24h，待肉湯渾濁后用于常規(guī)生化試驗。

1.2.5 藥敏試驗 采用K-B試紙擴(kuò)散法[11]，選取18種臨床常用藥物，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922為參照，將大腸桿菌菌液均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上，再將藥敏紙片等距離（間隔≥24mm）貼于營養(yǎng)瓊脂表面，37℃培養(yǎng)24h，測定各藥敏紙片抑菌直徑，依照《紙片法抗菌藥物敏感試驗標(biāo)準(zhǔn)》[12]判定結(jié)果。

1.2.6 乳鴿及成年鴿的抗體效價檢測 分別取乳鴿和成年鴿的血清樣本各20份，按照《新城疫診斷技術(shù)》[10]規(guī)定方法進(jìn)行血凝抑制試驗（HI），檢測鴿群新城疫抗體效價。

1.2.7 動物回歸試驗 將第3代雞胚尿囊液作為PPMV-1攻毒毒株，將大腸桿菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液（大腸桿菌含量調(diào)整為1.2×109cfu/mL）作為大腸桿菌攻毒菌株，分別感染15d非免疫健康乳鴿和14dSPF雛雞，感染分組和感染劑量列于表1。

病毒尿囊液采用滴鼻點(diǎn)眼的方式感染A組乳鴿和E組雛雞，大腸桿菌菌液采用肌肉注射的方式感染B組乳鴿和F組雛雞，C組乳鴿和G組雛雞同時接入病毒尿囊液和大腸桿菌菌液，對照D組乳鴿和對照H組雛雞給予同等劑量的生理鹽水，每組5只；隔離飼養(yǎng)14d，觀察記錄各組動物發(fā)病情況，臨床癥狀和死亡情況，分離發(fā)病和病死動物體內(nèi)的病毒和細(xì)菌并進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴿源Ⅰ型副黏病毒的RT-PCR鑒定

由圖1可知，被檢組織樣本與新城疫病毒試劑盒陽性對照均在362bp處擴(kuò)增出特異性條帶，表明該鴿場病鴿呈PPMV-1陽性。

2.2 病毒分離和培養(yǎng)

病鴿組織病料連傳3代后，第3代尿囊液的凝集效價為2log2～5log2。HI結(jié)果顯示，尿囊液中毒株的凝集反應(yīng)可以被NDV陽性血清抑制，但不能被AIV陽性血清抑制。剖檢96h內(nèi)死亡雞胚可見全身呈彌漫性出血和水腫，尤其以雞胚頭部、眼周及翼下出血最為嚴(yán)重；96h未死亡雞胚頭部有點(diǎn)狀出血點(diǎn)，剖檢可見腸道出血。

2.3 細(xì)菌的分離鑒定

2.3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 從圖2可以看出，在普通營養(yǎng)瓊脂上可見灰白色菌落，呈圓形半透明狀；麥康凱瓊脂上可見紅色圓形菌落；伊紅美藍(lán)瓊脂上可見帶有黑色金屬光澤菌落；三糖鐵斜面的表面和內(nèi)部均呈現(xiàn)黃色，并有產(chǎn)氣現(xiàn)象。

2.3.2 細(xì)菌的染色 革蘭氏染色后，顯微鏡下可見大量紅色、兩端鈍圓的短小桿菌，散在或成對分布，為革蘭氏陰性菌，結(jié)果如圖3所示。

2.4 生化鑒定

分離菌生化鑒定結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明該菌為大腸桿菌。

2.5 藥敏試驗

由表3可知，該菌對丁胺卡那霉素、慶大霉素和安普霉素高敏；對頭孢噻肟和鏈霉素中敏；對培氟沙星和土霉素低敏，對其余藥物均表現(xiàn)為耐藥，說明分離株存在多重耐藥現(xiàn)象。

2.6 新城疫抗體效價分布

從表4可以看出，在所檢測的乳鴿和成年鴿的血清樣本中，乳鴿的新城疫抗體效價均低于5log2，其中，14只種鴿的新城疫抗體效價在5log2以上，合格率為70%，且離散度較大。

2.7 動物回歸試驗結(jié)果

從表5可以看出，3組乳鴿在攻毒后均出現(xiàn)精神沉郁、采食量下降、閉眼縮脖等癥狀。其中，A、C組乳鴿出現(xiàn)扭頭斜頸、拉黃綠色稀便癥狀，剖檢可見腺胃乳頭有出血點(diǎn)，腺胃和肌胃交界處出血，腸道及盲腸扁桃體出血，腎臟有出血點(diǎn)，腦組織出血、水腫；B組乳鴿，F(xiàn)和G組雛雞均有呼吸道癥狀，表現(xiàn)為呼吸困難、下痢、糞便呈水樣；B、C、F、G組乳鴿剖檢后均可見腸道及盲腸扁桃體出血，心臟、肝臟表面有白色纖維素樣沉淀；E組雛雞僅有1只發(fā)病，剖檢可見腸道出血，未見其他病變，其余雛雞無臨床癥狀和肉眼可見病變。通過RT-PCR進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，A、C組乳鴿均呈PPMV-1陽性，E、G組雛雞PPMV-1陽性率分別為60%和40%。在B、C、F、G組中均可分離到大腸桿菌。D和H這2個對照組均無任何臨床癥狀，PPMV-1和大腸桿菌檢測結(jié)果均為陰性。

2.8 診斷與治療

根據(jù)病鴿臨床癥狀及病理剖檢變化，結(jié)合實驗室病毒和細(xì)菌鑒定結(jié)果，發(fā)病鴿群可診斷為鴿I型副黏病毒病與大腸桿菌病混合感染。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步制訂防治方案，隔離病鴿，無害化處理病死鴿及其糞便和飼料。針對鴿場內(nèi)乳鴿新城疫抗體效價不合格的情況，緊急使用2倍劑量的新城疫Ⅳ系疫苗滴鼻點(diǎn)眼。依據(jù)藥敏試驗結(jié)果，在飲水中加入丁胺卡那霉素治療大腸桿菌感染，同時添加電解多維和黃芪多糖。鴿場實行封閉管理，全面清掃和消毒，待病情得到控制后，鴿群全部采用2倍劑量的新城疫Ⅳ系疫苗滴鼻點(diǎn)眼，補(bǔ)免一次，并定期檢測抗體效價。

3 結(jié)論與討論

鴿新城疫自20世紀(jì)80年代經(jīng)香港傳入廣東、廣西、山東等省，隨著我國肉鴿養(yǎng)殖業(yè)和賽鴿業(yè)的快速發(fā)展，該病在我國各省均有流行發(fā)生，制約了我國養(yǎng)鴿業(yè)的健康發(fā)展。目前，接種新城疫疫苗是防控該病的主要手段，但在肉鴿生產(chǎn)養(yǎng)殖中，乳鴿在28日齡出欄上市，所以，僅對親本種鴿和后備種鴿進(jìn)行新城疫疫苗免疫，而乳鴿體內(nèi)的新城疫抗體均來自于母源抗體。研究表明，種鴿的新城疫抗體滴度值與種蛋、各周齡乳鴿的母源抗體滴度值呈正相關(guān)[13]，種鴿體內(nèi)保持較高的抗體水平是保證商品乳鴿不感染新城疫的必要條件[14]。本研究中，該鴿場15d乳鴿抗體效價均低于5log2，且親本種鴿抗體合格率僅為70%。由此可見，若種鴿抗體效價參差不齊，則容易發(fā)生乳鴿感染新城疫的現(xiàn)象。

大腸桿菌是肉鴿生產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的條件性致病菌[15]，極易在飼養(yǎng)環(huán)境不良、免疫力下降時侵害鴿群，對鴿群健康危害巨大。目前，治療大腸桿菌感染主要依靠抗生素，但是由于抗生素的濫用，大腸桿菌的耐藥性增強(qiáng)，耐藥菌株不斷增多[16]。本研究藥敏試驗結(jié)果表明，此次分離到的大腸桿菌存在多重耐藥現(xiàn)象，對β內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥或低敏，僅對氨基糖苷類抗生素部分藥物高敏。王洪彬等[17]臨床分離到的鴿源大腸桿菌存在嚴(yán)重的多重耐藥性，對阿莫西林、多西環(huán)素、磺胺二甲氧嘧啶和林可霉素等多種抗生素耐藥。CHROBAK-CHMIEL等[18]從賽鴿口腔中分離出的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌分離物對阿莫西林、慶大霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、磺胺甲惡唑-甲氧芐啶和氨芐西林等均具有耐藥性?？梢姡a(chǎn)養(yǎng)殖中濫用抗生素導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)和多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重影響了鴿大腸桿菌病的防治。

在BADR等[7]采集的50個鴿群組織樣本中，有82%存在大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌間的雙重或多重混合感染，有12%存在PPMV-1與細(xì)菌的混合感染。國內(nèi)也多有報道鴿群PPMV-1與大腸桿菌、沙門氏菌的混合感染病例[19]，研究表明，鴿I型副黏病毒與細(xì)菌混合感染易造成鴿群發(fā)病率和死亡率升高[20]。因此，肉鴿生產(chǎn)養(yǎng)殖中更應(yīng)重視大腸桿菌與副黏病毒的混合感染。

本研究分離到的PPMV-1和大腸桿菌分別感染乳鴿和雛雞，可見PPMV-1分離株對乳鴿具有極強(qiáng)的致病性，發(fā)病率為100%，死亡率可達(dá)80%～100%；而攻毒組雛雞并結(jié)合RT-PCR檢測后發(fā)現(xiàn)，雛雞感染PPMV-1后存在帶毒不發(fā)病的現(xiàn)象，僅少量出現(xiàn)死亡和臨床癥狀，表明鴿源PPMV-1對雞表現(xiàn)為低致病力，這與國內(nèi)外多數(shù)研究結(jié)果相似。胡北俠等[21]研究發(fā)現(xiàn)，鴿群感染PPMV-1后，死亡率可達(dá)70%～80%，SPF雞感染后則無明顯癥狀，但是雞體內(nèi)可檢測到PPMV-1，并可通過喉頭和泄殖腔向體外排毒。OLSZEWSKA等[22]用PPMV-1分別感染鴿、雞、火雞后觀察其組織病理學(xué)變化，病鴿出現(xiàn)腦組織單核細(xì)胞浸潤、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生和神經(jīng)元變性、水腫，腎小管壞死等病變，雞和火雞感染后則表現(xiàn)為輕微的病變。PPMV-1是NDV在鴿群中長期經(jīng)歷適應(yīng)性進(jìn)化后的產(chǎn)物，對鴿子有特殊宿主偏好，且對鴿的致病力強(qiáng)于其他家禽，PPMV-1在鴿子體內(nèi)獲得了比雞源NDV更強(qiáng)的生存優(yōu)勢[23-24]。由于鴿子的遷徙性及其疫苗接種難度大，帶菌、帶毒鴿群極易導(dǎo)致其飛行區(qū)域及周邊養(yǎng)殖場家禽發(fā)病，鴿子是NDV傳播給家禽的重大威脅[25]。

綜上所述，種鴿應(yīng)嚴(yán)格按照免疫程序進(jìn)行免疫，并定期監(jiān)測抗體效價，這樣可以為幼鴿和鴿群構(gòu)建起一道有效的免疫屏障，使該地區(qū)的鴿群獲得群體免疫力。同時，肉鴿養(yǎng)殖中應(yīng)保證乳鴿飼養(yǎng)環(huán)境的潔凈，降低各種病原入侵的機(jī)會。此外，如果鴿場發(fā)生細(xì)菌性疾病，應(yīng)通過藥敏試驗指導(dǎo)臨床用藥、交替使用抗生素，從而提高治療效果、減少耐藥菌株的產(chǎn)生[26]。