羅 飛, 穆 青, 余知和, 孫美麗, 郭 濤,李文紅, 汪漢成, 蔡劉體

(1.長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081；3.貴州省煙草公司 黔西南州公司，貴州 興義 562400；4.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，貴陽 550006；5.長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

茄科勞爾氏菌Ralstonia solanacearum是一種土壤習(xí)居細(xì)菌[1]，其遺傳變異性高、環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、寄主范圍廣，是制約全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要植物病原之一[2-3]。煙草是我國重要經(jīng)濟(jì)作物，由于連作、氣候變化、防治藥劑單一等因素，導(dǎo)致由茄科勞爾氏菌引發(fā)的煙草青枯病的發(fā)病頻率和范圍均呈不同程度增加。煙草青枯病通常會(huì)導(dǎo)致煙葉品質(zhì)和產(chǎn)量下降，在發(fā)病嚴(yán)重地塊甚至造成絕收[4]。目前，生產(chǎn)上對煙草青枯病的防治措施主要集中在培育抗病煙草品種[5]、篩選適宜的生防菌[6]和使用化學(xué)藥劑[7]等方面。然而，不同的防控措施均存在一定的局限性?；瘜W(xué)防控因見效快、成本低等特點(diǎn)而成為煙草青枯病的主要防控手段，但可有效防控?zé)煵萸嗫莶〉乃巹┤允钟邢?。因此，亟待篩選能高效防治煙草青枯病的新藥劑。

碳源是影響植物病原菌生存和致病性的重要營養(yǎng)物質(zhì)[8]。有研究表明，Biolog OmniLog 系統(tǒng)中可使用包括Biolog GEN Ⅲ 在內(nèi)的多種微平板檢測微生物對碳源代謝、pH 耐受性、鹽耐受性和還原力等多種生理特征[9-11]。Wang 等[12-13]利用Biolog FF 微平板研究表明，在藥劑脅迫下，灰葡萄孢Botrytis cinerea減少了產(chǎn)孢所需碳源的種類，而九州鐮刀菌Fusarium kyushuense降低了對糖酵解和三羧酸循環(huán)中多種碳源的代謝。Chojniak 等[14]利用Biolog ECO 和PM 微平板分別對沙雷氏菌Serratia marcescens的生理特征和耐藥性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)沙雷氏菌可利用D-甘氨酸、L-天冬酰胺和L-絲氨酸在內(nèi)的31 種碳源，且對氟啶酸、亞碲酸鉀、巴龍霉素、新生霉素和萘啶酸敏感，對潔霉素、紅霉素和奇霉素等43 種藥劑則均具有耐藥性。了解不同藥劑脅迫下茄科勞爾氏菌的碳源代謝特征，對準(zhǔn)確挖掘可高效防治煙草青枯病的化學(xué)藥劑，以及深入探究藥劑對茄科勞爾氏菌的毒理作用機(jī)制尤為重要[15]。為此，本研究分別通過平板菌落計(jì)數(shù)法和Biolog GEN Ⅲ 微平板法，測定了中生菌素等5 種藥劑對茄科勞爾氏菌的抑制活性，以及菌株在藥劑脅迫壓力下的碳代謝特征，旨在為篩選高效防治煙草青枯病的藥劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：茄科勞爾氏菌R.solanacearumRS-1 菌株由貴州省煙草科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室保存，在營養(yǎng)瓊脂 (NA) 培養(yǎng)基上活化后用于后續(xù)試驗(yàn)。

藥劑：20%中生菌素 (zhongshengmycin) 以及92%氯溴異氰尿酸 (chlorobromoisocyanuric acid)和95%噻霉酮 (benziothiazolinone) 原藥，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院殺菌劑實(shí)驗(yàn)室提供；98%春雷霉素 (kasugamycin) 購自源葉生物科技有限公司；930 U/mg 土霉素 (oxytetracycline) 購自索萊寶生物科技有限公司。先將上述藥劑配制成質(zhì)量濃度為1.0 × 104mg/L 的母液，其中，春雷霉素、中生菌素、土霉素和氯溴異氰尿酸用無菌水溶解配制，噻霉酮用丙酮溶解配制。母液經(jīng)0.2 μm 的微孔濾膜 (#FJ0612 Pall Corporation) 過濾除菌后，置于4 ℃避光條件下存放，備用。

營養(yǎng)瓊脂 (NA) 培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g，水1 L，用于菌株活化培養(yǎng)及抑菌活性測定；CPG 培養(yǎng)基：酪蛋白水解物1 g，蛋白胨10 g，蔗糖5 g，水1 L，用于茄科勞爾氏菌菌液培養(yǎng)。

Biolog GEN III 微平板 (貨號(hào)：#1030)、IF-A(#72401) 接種液、Biolog OmniLog 系統(tǒng) (#91372)和 8 通道電動(dòng)移液器 (#3501A)，購自美國 Biolog公司。

1.2 藥劑對茄科勞爾氏菌的抑制活性測定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法[16]測定5 種供試藥劑對茄科勞爾氏菌的抑制活性。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別配制含不同藥劑梯度濃度的NA 平板。其中，中生菌素、土霉素和噻霉酮：0、0.0625、0.125、0.25、0.50、1 和2 mg/L；春雷霉素：0、0.625、1.25、2.50、5、10 和20 mg/L；氯溴異氰尿酸：0、25、50、100、200、400 和800 mg/L；以不添加藥劑的NA 平板為空白對照。

挑取NA 平板上預(yù)培養(yǎng)的單菌落接種于CPG培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min、黑暗條件下培養(yǎng)12 h。移取50 μL 稀釋后的菌懸液 (106cfu/mL) 涂布于各含藥NA 平板上，28 ℃黑暗培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板的菌落數(shù)量。根據(jù)菌落數(shù)量平均值，按式 (1)計(jì)算不同藥劑的抑制率 (I)。每濃度3 次重復(fù)。

其中，NC為對照組菌落數(shù)量；NT為處理組菌落數(shù)量。

1.3 藥劑脅迫下茄科勞爾氏菌的代謝測定

采用IF-A 接種液配制濁度為90%～98% TU 的茄科勞爾氏菌菌懸液[14]。根據(jù)平板計(jì)數(shù)結(jié)果，將各藥劑分別加入菌懸液中，配制藥劑質(zhì)量終濃度分別為：中生菌素0、1.5、6 mg/L，土霉素0、1、8 mg/L，春雷霉素0、15、30 mg/L，噻霉酮0、2、8 mg/L，氯溴異氰尿酸0、274、5738 mg/L，并設(shè)不含藥劑的空白對照組 (CK)。采用多孔道移液器將含各濃度藥劑的菌懸液分別加至不同GENⅢ 微平板中，每孔100 μL，置于Biolog OmniLog表型芯片系統(tǒng)內(nèi)，28 ℃孵育4 d，通過讀取顏色值的變化，檢測茄科勞爾氏菌對71 種碳源的代謝情況以及對不同pH 值和包括不同濃度NaCl 在內(nèi)的 23 種化學(xué)物質(zhì)的敏感性差異。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Excel 軟件 (V2021) 求得毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù) (r)、各藥劑對茄科勞爾氏菌的半數(shù)抑制效應(yīng)濃度 (EC50) 和90%抑制效應(yīng)濃度 (EC90)；使用Heml (V1.0.3.3) 繪制茄科勞爾氏菌的代謝豐度熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試 5 種藥劑對茄科勞爾氏菌的抑制活性

各藥劑不同濃度處理下，茄科勞爾氏菌菌落生長情況如圖1 所示。低濃度下，茄科勞爾氏菌在含藥平板上的生長狀況與空白對照組無顯著性差異；隨著藥劑質(zhì)量濃度升高，菌落大小和數(shù)量均受到不同程度的抑制。5 種殺菌劑對茄科勞爾氏菌生長的抑制效果由強(qiáng)到弱依次為中生菌素 ＞ 土霉素 ＞ 噻霉酮 ＞ 春雷霉素 ＞ 氯溴異氰尿酸，對應(yīng)的EC50值分別為0.24、0.74、2.84、7.95 和273.99 mg/L (表1)。依據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，初步可認(rèn)為中生菌素對茄科勞爾氏菌的抑制作用較強(qiáng)，春雷霉素、土霉素和噻霉酮的抑制作用較弱，而氯溴異氰尿酸的抑制效果最差。

表1 供試5 種藥劑對茄科勞爾氏菌的抑制活性Table 1 Inhibitory activity of five chemicals against R.solanacearum

圖1 不同濃度藥劑處理下茄科勞爾氏菌的菌落生長情況Fig.1 Growth of Ralstonia solanacearum under the treatments of five chemicals

2.2 5 種藥劑脅迫下茄科勞爾氏菌的代謝能力分析

藥劑對病原菌的抑制活性越強(qiáng)，病原菌對GEN Ⅲ 微平板中碳源的代謝程度就越弱。在不同濃度5 種藥劑脅迫下，茄科勞爾氏菌對GEN Ⅲ微平板中71 種碳源的代謝情況如圖2 所示。結(jié)果表明：無藥劑脅迫時(shí)，71 種碳源均能被茄科勞爾氏菌代謝，其中能被高效代謝的有糊精、α-D-葡萄糖和α-酮-戊二酸等47 種碳源。在不同濃度中生菌素 (1.5、6 mg/L)、土霉素 (1、8 mg/L)、噻霉酮 (2、8 mg/L)、氯溴異氰尿酸 (274、5734 mg/L)和春雷霉素 (15 mg/L) 脅迫下，與空白對照組相比，茄科勞爾氏菌對71 種碳源的代謝程度均受到不同程度抑制，其中氨基酸、己糖酸和羧酸、酯和脂肪酸類碳水化合物受到的抑制作用最顯著。

圖2 供試5 種藥劑脅迫下茄科勞爾氏菌代謝功能聚類熱圖Fig.2 Cluster heat map of carbon metabolic function of R.solanacearum under pressure of five agents

5 種藥劑不同濃度之間對茄科勞爾氏菌碳源代謝的影響存在顯著差異。在低質(zhì)量濃度 (1.5 mg/L中生菌素、1 mg/L 土霉素、2 mg/L 噻霉酮、15 mg/L春雷霉素和274 mg/L 氯溴異氰尿酸) 藥劑脅迫下，茄科勞爾氏菌能高效代謝的碳源種類分別為3、0、1、7 和1 種，代謝程度較低的碳源種類分別為68、71、70、64 和70 種；隨著藥劑質(zhì)量濃度升高，在6 mg/L 中生菌素、8 mg/L 土霉素、8 mg/L噻霉酮、30 mg/L 春雷霉素和5738 mg/L 氯溴異氰尿酸脅迫下，能高效代謝的碳源種類分別為0、0、1、4 和2 種，代謝程度較低的碳源種類分別為71、71、70、67 和69 種；表明隨藥劑質(zhì)量濃度增加，茄科勞爾氏菌對GEN Ⅲ 微平板中碳源的代謝能力整體呈降低趨勢。

同一藥劑不同濃度之間對茄科勞爾氏菌碳源代謝的影響也存在差異。隨著中生菌素、土霉素、噻霉酮、春雷霉素和氯溴異氰尿酸質(zhì)量濃度增加，相較于低質(zhì)量濃度下，在6 mg/L 中生菌素、8 mg/L 土霉素、8 mg/L 噻霉酮、30 mg/L 春雷霉素和5738 mg/L 氯溴異氰尿酸脅迫下，5 種藥劑對65、18、71、60 和7 種碳源的代謝程度分別降低，同時(shí)對6、53、0、10 和60 種碳源的代謝程度分別增強(qiáng)。所有處理中，茄科勞爾氏菌對D-絲氨酸和α-酮-丁酸的代謝程度均較低，推測茄科勞爾氏菌對D-絲氨酸和α-酮-丁酸的利用能力較弱。此外值得注意的是，在不同濃度的春雷霉素、噻霉酮、土霉素脅迫下，茄科勞爾氏菌對D-果糖-6-磷酸的代謝程度均高于對D-葡糖-6-磷酸，而在氯溴異氰尿酸脅迫下卻剛好相反。

2.3 5 種藥劑脅迫下茄科勞爾氏菌對化學(xué)物質(zhì)的敏感性

在不同濃度的5 種藥劑脅迫下，茄科勞爾氏菌對GEN Ⅲ 微平板中23 種化學(xué)物質(zhì)的敏感性表現(xiàn)不同 (圖2)。其中，茄科勞爾氏菌對低pH 值(5) 的敏感性均高于高pH 值 (6)；而對不同濃度NaCl (1%、4%、8%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 的敏感性則隨NaCl 濃度升高而升高。在無藥劑脅迫時(shí)，茄科勞爾氏菌對GEN Ⅲ 微平板中的醋竹桃霉素、鹽酸胍、二甲胺四環(huán)素、D-絲氨酸、硫酸四癸鈉、丁酸鈉、溴酸鈉和氯化鋰8 種化學(xué)物質(zhì)敏感性較高，而對乳酸鈉、梭鏈孢酸、利福霉素SV、氨曲南、亞碲酸鉀、萘啶酮酸、四唑藍(lán)、四唑紫、萬古霉素及林肯霉素10 種化學(xué)物質(zhì)的敏感性較低。在低質(zhì)量濃度藥劑 (15 mg/L 春雷霉素、2 mg/L 噻霉酮、1 mg/L 土霉素、1.5 mg/L 中生菌素和274 mg/L 氯溴異氰尿酸) 脅迫下，茄科勞爾氏菌對乳酸鈉、萬古霉素和鹽酸胍等18 種化學(xué)物質(zhì)的敏感性相較于空白對照均不同程度升高；隨著藥劑質(zhì)量濃度升高，與空白對照相比，茄科勞爾氏菌對GEN Ⅲ 微平板中23 種化學(xué)物質(zhì)的敏感性則分別呈升高或降低趨勢。

3 結(jié)論與討論

由茄科勞爾氏菌引起的煙草青枯病是煙葉生產(chǎn)上的主要病害，常給煙農(nóng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[5,17-18]，化學(xué)防治是其最為經(jīng)濟(jì)有效的防控手段之一。本研究發(fā)現(xiàn)，春雷霉素、土霉素、噻霉酮、中生菌素和氯溴異氰尿酸5 種藥劑對茄科勞爾氏菌的生長均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，抑菌活性由強(qiáng)到弱依次為中生菌素(EC50= 0.24 mg/L) ＞ 土霉素(EC50= 0.74 mg/L) ＞ 噻霉酮(EC50= 2.84 mg/L) ＞春雷霉素(EC50= 7.95 mg/L) ＞ 氯溴異氰尿酸(EC50=273.99 mg/L)，所得結(jié)果與前人對番茄青枯菌及生姜青枯菌的測定結(jié)果類似[19-22]。

藥劑作用方式不同可能會(huì)導(dǎo)致其對病原菌毒力效應(yīng)的不同。本研究所選5 種藥劑均是直接作用于病原菌，其中中生菌素、土霉素和春雷霉素主要通過抑制菌體蛋白質(zhì)合成[23-25]，噻霉酮通過破壞病原菌細(xì)胞核結(jié)構(gòu)和干擾細(xì)胞的新陳代謝，使其生理紊亂[26]，氯溴異氰尿酸則是通過釋放的Cl-和Br-形成次氯酸和次溴酸分子而發(fā)揮抑菌作用，但次氯酸和次溴酸極不穩(wěn)定[27]，因而可能影響氯溴異氰尿酸的抑菌活性。同樣，環(huán)境pH 值也可能會(huì)影響藥劑對病原菌的抑制活性。本研究中，茄科勞爾氏菌在無藥劑處理和不同濃度的5 種藥劑脅迫下，在pH 值為6 時(shí)對GEN Ⅲ 微平板中碳源的代謝程度均高于pH 值為5 時(shí)。pH 值具體如何影響藥劑對茄科勞爾氏菌的抑制活性值得進(jìn)一步深入研究。何宗桃[26]報(bào)道，春雷霉素在弱酸環(huán)境下活性更高，本研究結(jié)果與之相比結(jié)果相反。本研究僅測定了pH 為5 和6 兩種環(huán)境條件下藥劑的抑制活性，后續(xù)還有待測定更寬pH 范圍下藥劑對茄科勞爾氏菌的抑制活性，以便明確供試5 種藥劑的施用最適pH 值。研究表明，中生菌素、土霉素和噻霉酮是對茄科勞爾氏菌防控效果較為理想的藥劑，春雷霉素次之，氯溴異氰尿酸較差。

根據(jù)不同微生物在利用GEN Ⅲ 微平板中不同碳源時(shí)表現(xiàn)出不同代謝指紋圖譜的特性，可將病原菌鑒定到種水平，同樣，同一微生物在不同環(huán)境下對同一碳源的利用情況也會(huì)有所不同[28-30]。本研究采用Biolog GEN Ⅲ 微平板，分析了茄科勞爾氏菌對碳源的利用情況，發(fā)現(xiàn)在5 種藥劑脅迫下，α-酮-戊二酸、檸檬酸、L-蘋果酸、D-葡糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸等多種碳源的代謝均受到高水平抑制。其中D-半乳糖醛酸和葡萄糖醛酰胺(己糖酸類碳水化合物) 參與2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)和糖醛酸等多種生化途徑；而α-酮-戊二酸、檸檬酸、L-蘋果酸是三羧酸(TCA)循環(huán)中的重要物質(zhì)；D-葡糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸(磷酸己糖)是微生物進(jìn)行糖代謝的一類重要碳水化合物，但D-葡糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸所參與的代謝途徑不同[31]。茄科勞爾氏菌在不同濃度5 種藥劑脅迫下對D-葡糖-6-磷酸和D-果糖-6-磷酸的利用程度存在差異，推測茄科勞爾氏菌在5 種藥劑脅迫下進(jìn)行糖代謝的途徑不同。上述結(jié)果表明，中生菌素、土霉素、噻霉酮、春雷霉素和氯溴異氰尿酸5 種藥劑均可抑制茄科勞爾氏菌對多種碳源的生化代謝途徑，其中，中生菌素、噻霉酮、土霉素和春雷霉素對茄科勞爾氏菌的抑制活性測定結(jié)果與Biolog 碳源代謝結(jié)果相符，抑制活性和碳源代謝強(qiáng)度均與藥劑質(zhì)量濃度成正比效應(yīng)。

目前，由于單一藥劑的長期、多頻次不合理使用易造成病原菌的抗藥性問題[4]，因此將多種不同類型藥劑進(jìn)行復(fù)配后防治病害在實(shí)際生產(chǎn)中已被廣泛應(yīng)用[22,32-34]。本研究中關(guān)于茄科勞爾氏菌對化學(xué)物質(zhì)敏感性測定部分所涉及的梭鏈孢酸、NaCl、醋竹桃霉素、利福霉素SV、林肯霉素和萬古霉素等多種化學(xué)物質(zhì)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，這些化學(xué)物質(zhì)與本研究測定的5 種藥劑所形成的復(fù)配劑在Biolog 系統(tǒng)中均能顯著降低茄科勞爾氏菌的代謝程度，但能否將其應(yīng)用于煙草青枯病的防治還有待進(jìn)一步研究。此外，本研究利用Biolog GEN III 系統(tǒng)，測定了在5 種藥劑脅迫下茄科勞爾氏菌對71 種碳源的代謝情況和對23 種化學(xué)物質(zhì)的敏感性差異，初步反映了藥劑對病原菌代謝途徑的影響，但具體還需通過Biolog phenotypic microarrays (PM)技術(shù)進(jìn)一步深入探討。