孟泉祿,張明軍,史金平,付玲娟,劉 婷,張全偉,成述儒

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

甘肅省地域遼闊,適合多個(gè)綿羊品種生長繁殖,且不同品種綿羊在生長繁育過程中能保持其獨(dú)有的生產(chǎn)特性。甘肅高山細(xì)毛羊主產(chǎn)于甘肅省肅南縣,是我國高寒山區(qū)第1個(gè)綿羊新品種,主要特點(diǎn)是能適應(yīng)高寒牧區(qū)嚴(yán)酷的自然生態(tài)條件[1];蒙古羊膻味較輕、肉質(zhì)鮮美和育肥增膘能力等生產(chǎn)性能顯著,廣泛分布于內(nèi)蒙古和甘肅地區(qū)[2];藏綿羊是典型的中國粗毛羊品種,抗逆性強(qiáng)、耐粗飼[3];小尾寒羊?qū)偻鈦砥贩N,生長發(fā)育快、肉用性能好,是世界著名高繁殖力綿羊之一[4];灘羊原屬蒙古羊,具有耐干旱、個(gè)體大和適應(yīng)性強(qiáng)等特性[5]。綿羊生產(chǎn)性能受環(huán)境影響,同時(shí)還受到遺傳因素調(diào)控,挖掘與綿羊生長性能相關(guān)基因,是提高綿羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的理論基礎(chǔ)。

DLK1(delta-like 1 homologue,DLK1)是一種父源表達(dá)印記基因,定位于人14號染色體、小鼠12號染色體和綿羊18號染色體上,其主要編碼跨膜蛋白,同時(shí)對肌肉生長也具有一定的調(diào)節(jié)作用[6]。研究表明,DLK1轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物在人類胎兒期各組織中廣泛表達(dá),出生后表現(xiàn)出組織特異性,僅在胰腺、垂體和腎上腺等組織中表達(dá)[7]。同其他印記基因相似,DLK1是哺乳動(dòng)物生長發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子,其表達(dá)水平對細(xì)胞增殖和分化有顯著影響[8]。Andersen等[9]通過對骨骼肌重塑過程中DLK1的表達(dá)量研究發(fā)現(xiàn),DLK1在人類所有疾病中都呈上調(diào)趨勢,且DLK1轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物的表達(dá)高峰與成肌細(xì)胞分化融合的表達(dá)相一致,由此推測,DLK1可能在不同的水平和時(shí)間點(diǎn)參與肌肉發(fā)育和重塑的過程。Shin等[10]對處于不同生長時(shí)期雞的DLK1克隆和序列分析發(fā)現(xiàn),DLK1可能在脂肪和肌肉組織發(fā)育的早期階段起重要作用。Waddell等[11]通過建立小鼠DLK1基因敲除和過表達(dá)模型發(fā)現(xiàn),DLK1基因敲除導(dǎo)致小鼠出生后生長遲緩和肌肉再生能力受損;相反,DLK1過表達(dá)能抑制培養(yǎng)成肌細(xì)胞的增殖和增強(qiáng)分化。因此,DLK1可促進(jìn)哺乳動(dòng)物肌肉生長發(fā)育,但對脂肪組織分化和增長具有抑制作用。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)綿羊的雙肌臀性狀也是由DLK1基因過表達(dá)所致[12],但具體有關(guān)DLK1基因參與肌肉的生長發(fā)育的機(jī)制尚不清楚[13]。本研究就DLK1基因多態(tài)性是否影響綿羊生長性能開展試驗(yàn),以期尋找新的與綿羊生長性能相關(guān)的分子標(biāo)記,進(jìn)而為提高甘肅綿羊生產(chǎn)性能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)以甘肅省內(nèi)固有綿羊品種—藏綿羊、蒙古羊、甘肅高山細(xì)毛羊、灘羊和外來品種小尾寒羊共240頭為研究對象,具體來源和數(shù)量見表1。

表1 羊樣品信息

綿羊不同生長期(0,1,3,6,9月齡)測定記錄體質(zhì)量、體高、體長和胸圍等生長性能指標(biāo);9月齡頸靜脈采集綿羊血液,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 血液基因組DNA提取

室溫溶化冷凍血液樣品,按照TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(天根生化科技有限公司)操作說明提取基因組DNA,NanoDrop 2000分光光度計(jì)測定其純度和濃度,以1.8～2.0為參考作為純DNA,用于后續(xù)試驗(yàn),1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量,檢測合格后用于下一步PCR擴(kuò)增。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI提供綿羊DLK1基因(XM_027957404.2)CDS序列,使用Primer 3.0在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站設(shè)計(jì)DLK1基因特異性引物,引物由西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司合成,引物信息如下DLK1-F:5′-GGACGCTTGTTGAGTGAGTGT-3′,DLK1-R:5′-TTTGTTCAGAGTGAGAGCCAA-3′,目的片段大小216 bp。

1.4 DLK1基因的PCR擴(kuò)增程序

PCR反應(yīng)體系20 μL:2×Taq Master Mix 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板(80 ng/μL)1 μL,ddH2O 8 μL。擴(kuò)增程序如下:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,重復(fù)循環(huán)40次;最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增完成后使用1×TBE 緩沖液、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量,凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝片。

1.5 DLK1基因多態(tài)性PCR-SSCP分析

SSCP基因分型反應(yīng):4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和6 μL變性緩沖液振蕩混合均勻,98 ℃金屬浴變性10 min,結(jié)束后快速置于冰盒中冷卻10 min完成變性;之后將變性產(chǎn)物迅速注入凝膠孔,待樣品沉入膠孔底部,150 V恒壓電泳;至2條DNA單鏈分開后,增加電壓至180 V于含1×TBE的聚丙烯酰胺凝膠中電泳6 h。

為使條帶更清晰可視化,對電泳產(chǎn)物進(jìn)行銀染顯型,凝膠成像儀攝片。挑選不同基因型個(gè)體送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行DNA測序。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)PCR-SSCP檢測結(jié)果,對多態(tài)基因座的不同基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,利用MEGA 7.0軟件比對核酸序列,POPGENE分析軟件處理基因型頻率等相關(guān)群體遺傳參數(shù),SPSS 20.0對生長性狀指標(biāo)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液基因組DNA

提取待測定血液DNA濃度及純度,得到單個(gè)樣品質(zhì)量濃度大于50 ng/μL,OD260/280為1.8～2.0,表明提取DNA樣本純度高,無污染;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量,條帶清晰、無雜帶,表明提取DNA完整性高,符合后續(xù)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 DLK1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測如圖1:各泳道電泳條帶清楚,無雜帶,符合其后SSCP電泳檢測標(biāo)準(zhǔn)。

1—9.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,250 bp;M.DL1000 Marker。

2.3 DLK1基因SSCP檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠,在恒溫4 ℃,恒壓180 V電壓下進(jìn)行SSCP電泳檢測,結(jié)果如圖2:DLK1基因共存在3種基因型,將其定義為AA、AB和BB。

圖2 DLK1基因內(nèi)含子5分型圖

2.4 DLK1基因多態(tài)基因型測序

5個(gè)綿羊種群DLK1基因不同基因型PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化回收,送至生物公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果如圖3。將標(biāo)準(zhǔn)序列XM_027957404.2與擴(kuò)增序列進(jìn)行比對(圖4)發(fā)現(xiàn),在DLK1基因內(nèi)含子5區(qū)域發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)G30412C(G→C)。

圖3 測序峰圖

圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與GenBank同源序列的比對

2.5 DLK1基因多態(tài)位點(diǎn)遺傳特性分析

結(jié)合SSCP及測序結(jié)果分析,統(tǒng)計(jì)出5個(gè)綿羊品種突變位點(diǎn)的基因型數(shù)量、計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率,結(jié)果見表2。甘肅高山細(xì)毛羊、藏綿羊、蒙古羊、灘羊和小尾寒羊AB基因型及B等位基因頻率分別為0.460 0/0.531 4、0.480 0/0.594 4、0.420 0/0.587 4、0.400 0/0.616 5和0.440 0/0.601 5。在5個(gè)綿羊品種中,AB基因型均為優(yōu)勢等位基因型,B均為優(yōu)勢等位基因,且在5個(gè)綿羊群體中均可以檢測到這3種基因型的個(gè)體。

表2 綿羊DLK1基因遺傳多態(tài)性分析

由表2可知,甘肅高山細(xì)毛羊、藏羊、蒙古羊、灘羊和小尾寒羊雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.464 4/0.385 6,0.445 2/0.379 8,0.414 4/0.365 2,0.367 6/0.356 7和0.431 3/0.369 0,其中甘肅高山細(xì)毛羊雜合度最高,灘羊雜合度最低;甘肅高山細(xì)毛羊多態(tài)信息含量最高,灘羊多態(tài)信息含量最低,且5個(gè)綿羊品種均表現(xiàn)出中度多態(tài)性(0.25

2.6 基因多態(tài)性與生長性狀關(guān)聯(lián)分析

運(yùn)用SPSS 20.0軟件分析DLK1不同基因型與生長性能之間的相關(guān)性,結(jié)果如表3?；蛐托?yīng)顯著影響1月齡和3月齡綿羊的體長和胸圍,對綿羊6月齡和9月齡體長、胸圍的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;1月齡和3月齡BB型綿羊個(gè)體體長和胸圍顯著高于AA型個(gè)體;總體來說,基因型效應(yīng)對這5個(gè)綿羊品種的體長和胸圍影響顯著,對體高和體質(zhì)量影響不大。

表3 綿羊DLK1基因不同基因型與生長性狀的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

DLK1首次被發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤中,是人類目前已發(fā)現(xiàn)的印跡基因之一,其主要參與編碼糖基化跨膜蛋白,同時(shí)還參與脂肪合成[14]。研究表明,DLK1基因在生物體生長發(fā)育和組織再生過程中發(fā)揮重要作用[15]。徐倩倩等[16]發(fā)現(xiàn),當(dāng)DLK1在骨骼肌中過表達(dá)時(shí),小鼠骨骼肌表現(xiàn)出肥大性狀,表明DLK1基因是否正常表達(dá)對肌肉組織發(fā)育和發(fā)揮功能起重要影響。與正常組織相比,DLK1在多種腫瘤組織中表達(dá)量有顯著增高趨勢,表明其對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起調(diào)控作用[17-18],同時(shí)DLK1可參與許多細(xì)胞的分化調(diào)節(jié),其中包括脂肪細(xì)胞和血細(xì)胞生成調(diào)節(jié),以及對創(chuàng)傷起修復(fù)作用。

作為一種印記基因,DLK1缺失或高表達(dá)都可能引起相關(guān)的印記基因疾病,但其致病的具體機(jī)制還未得到更加深入的研究[19]。目前,對于DLK1基因的多態(tài)性研究分析較多,涉及多個(gè)物種,但是在綿羊方面的研究非常少。本試驗(yàn)中DLK1基因并未檢測到與Freking等[20]試驗(yàn)相一致的突變結(jié)果,可能是由于引種時(shí)發(fā)生了始祖效應(yīng)或遺傳漂變,以及受人工選擇的影響。廖紅海等[21]通過熒光定量PCR檢測了山羊不同組織中DLK1基因的表達(dá)量,其結(jié)果顯示,在山羊不同組織中DLK1基因均有表達(dá),且腎臟組織中表達(dá)水平最高,脂肪組織中表達(dá)量最低,表明DLK1可能具有抑制脂肪合成的作用。陳付英[22]在南陽黃牛和郟縣紅牛遺傳多態(tài)性與生長性狀相關(guān)性研究中,對DLK1基因的多態(tài)性與生長發(fā)育性狀進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)不同的基因型對牛的生長發(fā)育有顯著的影響。李云龍等[23]通過對寧夏灘羊、特克塞爾、薩?？诉@3個(gè)綿羊群體進(jìn)行測序研究發(fā)現(xiàn),其DNA序列共有5個(gè)突變位點(diǎn),分別為第54 507位的G→C突變、第54 553位的T→C突變、第54 592位的 C→T 突變、第54 620 位的C→T突變和第54 638位的T→G 突變。通過與李云龍等[23]的研究序列比對發(fā)現(xiàn),本研究在5個(gè)綿羊品種中,DLK1基因第5內(nèi)含子的第30 412 bp處發(fā)現(xiàn)的G→C突變與其在第54 507處發(fā)現(xiàn)的G→C突變研究結(jié)果一致,且DLK1基因的不同基因型在灘羊的體高、體長和胸圍這3個(gè)生產(chǎn)性狀上存在顯著差異與本次研究結(jié)果一致。陳付英等[24]對不同品種牛樣本(秦川牛287頭,南陽牛、郟縣牛、晉陽牛、安格斯牛、中國荷斯坦牛、牦牛和水牛各50頭)進(jìn)行PCR-SSCP和DNA測序分析,結(jié)果表明,只在秦川牛DLK1外顯子5位點(diǎn)檢測到2個(gè)SSCP基因型,分別為E5-A和E5-B,且E5-A為優(yōu)勢基因型,通過測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)此突變?yōu)橥x突變,在其他樣本中只檢測到1種SSCP基因型。諸多研究證實(shí),DLK1基因不同基因型和家畜的體長、胸圍有顯著相關(guān)性,這與本研究結(jié)果相同。因此,DLK1基因可以作為選擇甘肅地方綿羊品種生產(chǎn)性狀的候選標(biāo)記基因。同時(shí),通過對比分析5個(gè)不同品種綿羊的生產(chǎn)性能表明,小尾寒羊在不同月齡的生產(chǎn)性狀均優(yōu)于其他4個(gè)綿羊品種。

本研究通過對比5個(gè)不同品種綿羊的DLK1基因發(fā)現(xiàn),DLK1基因在5個(gè)綿羊品種中均具有多態(tài)性,且在第5內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)G30412C,其對于5個(gè)綿羊品種的體長和胸圍具有顯著相關(guān)性。以上結(jié)果表明,DLK1基因可作為選擇甘肅地方綿羊品種生產(chǎn)性狀的候選基因。