彭多姿,黃顥源,范占煌,戴 悅,元妙新,張振乾

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院,湖南 長沙 410128;2.中節(jié)能大地(杭州)環(huán)境修復有限公司,浙江 杭州 310020)

土壤重金屬污染問題日益嚴重,土壤中富集的重金屬不僅會對植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量、品質(zhì)產(chǎn)生不利影響,還會嚴重影響其加工食品的質(zhì)量和安全[1]。重金屬污染土壤修復常用的方法有休耕、物理修復、化學改良修復和生物修復等[2]。生物修復操作簡單、成本低、效果明顯,且不會引起二次污染[3]。植物修復是生物修復的一種,具有應用性較好、清除重金屬污染物較徹底、成本低廉、操作簡單、安全清潔、環(huán)境友好等優(yōu)點,是近年來研究的熱點[4]。油菜(BrassicanapusL.)是中國南方地區(qū)第二大作物,不與水稻爭地,種植技術簡單,生物量遠較蜈蚣草、野趾草等超富集修復植物大,且有較強的吸收累積鎘能力[5],且重金屬主要積蓄于粕餅中,毛油中重金屬含量符合相關標準,不存在消費風險,可實現(xiàn)邊修復邊生產(chǎn)[6-7]。楊洋等[8]研究發(fā)現(xiàn),重金屬在不同類型油菜間的吸收積累及轉(zhuǎn)運情況差異顯著,芥菜型油菜適合Cu、Pb 污染的土壤,而甘藍型油菜對 Zn、Cd 的吸收積累效果最好,適合用來修復重金屬復合污染的土壤。范占煌等[9]研究結果發(fā)現(xiàn),甘藍型油菜在高濃度鎘存在的土壤中仍能生長、結實,且不影響菜籽油的食用價值,是一種理想的修復植物。當前的研究多為不同基因型,如甘藍型油菜[10]、白菜型油菜[11]和芥菜型油菜[12-13]之間的差異和不同類型甘藍型油菜不同品種[14-16]的修復效果研究及同一材料不同生育期及部位間重金屬累積情況[17],其中甘藍型油菜栽培面積較大[18],因而相關研究較多,但不同甘藍型油菜雜交類型油菜對修復作用影響相關的研究較少。

為明晰不同雜交類型油菜在修復重金屬污染土壤中的差異,本研究以自交系159-6、單交油菜灃油520和三交油菜159-6×灃油520 為材料,通過盆栽試驗比較在不同材料不同重金屬污染土配比環(huán)境下的苗期長勢、生理特性差異以及光合作用相關基因(Bna0280620[19]、Bna049040[20]和BnaC08g46180D[21])和抗金屬性相關基因(BnaA08g04000D[21]、BnaA09g24330D[22]、BnNRAMP[23]和BnPri-miR167a[23])的表達量差異,以期找出適宜的重金屬污染土壤油菜類型,為后續(xù)的修復研究及新品種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

灃油520(20A×C3R,國審油2009009)、自交系159-6和三交油菜159-6×灃油520均由湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院提供。

1.2 試驗設計

設計盆栽試驗,用營養(yǎng)土和污染土混合,以Ⅰ(100%營養(yǎng)土)生長環(huán)境為對照組Ⅰ(CK),設置不同污染土配比的Ⅱ(25%污染土,75%營養(yǎng)土)、Ⅲ(50%污染土,50%營養(yǎng)土)、Ⅳ(75%污染土,25%營養(yǎng)土)3個污染土環(huán)境,肥水、光照等其余條件均保持一致。每個生長環(huán)境下,每個材料種4盆,每盆留苗10株。

營養(yǎng)土:由基質(zhì)土、優(yōu)質(zhì)鋸末、進口椰糠、蛭石、珍珠巖混合發(fā)酵而成,含氮15%,含磷15%,含鉀15%。

重金屬污染土:由中節(jié)能大地環(huán)保公司提供,采集自溫州填埋場。主要成分:干物質(zhì)78.4%,pH=7.67,有機質(zhì)133 g/kg,水溶性總鹽量3.63 g/kg,鎘含量為1.5 mg/kg,鉻含量為913 mg/kg、鎳含量為165 mg/kg、鉛含量449 mg/kg、砷和汞含量分別12.600,0.443 mg/kg,以農(nóng)用地土壤污染國家控制標準(GB15618-2008)為依據(jù),鎘超標150.0%,鉻超標265.2%,鉛超標164.1%。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 油菜生長14 d后取新鮮葉片,于-80 ℃冰箱保存,用于測定生理生化指標;取新鮮葉片提取RNA,反轉(zhuǎn)成cDNA于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 干質(zhì)量測定 將油菜植株測鮮質(zhì)量后置于烘箱,105 ℃殺青30 min,80 ℃烘48 h至恒質(zhì)量,并稱質(zhì)量。

1.3.3 生理生化指標測定 分別采用蒽酮法測定可溶性糖含量,考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量,95%乙醇浸提法測定葉綠素含量,氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性,愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性、過氧化氫法測定過氧化氫酶(Catalase from micrococcus lysodeikticus,CAT)和丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量[24]。

1.3.4 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 用TransZol Up Plus RNA Kit 試劑盒提取RNA(全式金生物,北京),用2100生物分析儀檢測RNA質(zhì)量(Agilent,美國)。用Hieff?1stStrand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester Plus)試劑盒(翌圣生物,上海)反轉(zhuǎn)合成cDNA。

1.3.5 基因表達情況分析 用NCBI設計引物,由湖南擎科生物技術有限公司合成(表1),利用全式金熒光定量試劑盒(全式金生物,北京)進行定量PCR擴增反應。利用Hieff?qPCR SYBR?Green Maste Mix(High Rox Plus)試劑盒(翌圣生物,上海)進行熒光定量PCR,具體操作參照說明書。

表1 qRT-PCR基因引物序列

1.4 試驗儀器

U8000紫外分光光度計(元析,上海),冷凍離心機(元析,上海),2100生物分析儀(Agilent,美國)),GelDoc2000凝膠成像儀(Bio-Rad,美國),CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad,美國),PTC200 PCR儀(Bio-Rad,美國)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

RT-qPCR采用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量,用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù),Excel 2019作圖。

2 結果與分析

2.1 不同油菜干鮮質(zhì)量的差異分析

不同污染土配比對油菜干鮮質(zhì)量的影響如圖1,不同污染土配比下,159-6×灃油520和159-6鮮質(zhì)量均高于對照組Ⅰ,且隨著污染土比例的增加,先升高后降低;灃油520鮮質(zhì)量均低于對照組Ⅰ,呈持續(xù)下降的趨勢;159-6×灃油520干質(zhì)量均高于對照組Ⅰ,呈先升高后下降的趨勢;灃油520干質(zhì)量均低于對照組Ⅰ,趨勢為先下降后升高再下降;159-6干質(zhì)量先下降后升高再下降,在50%污染土配比下高于對照組Ⅰ。在含25%污染土配比環(huán)境中,159-6×灃油520的鮮質(zhì)量顯著高于159-6(P=0.036)。在50%和75%污染土配比環(huán)境中159-6×灃油520的干質(zhì)量和鮮質(zhì)量均顯著高于灃油520和159-6(P<0.05)。

不同小寫字母表示同一處理下不同材料間差異顯著(P<0.05)。圖2—7同。

2.2 生理指標分析

2.2.1 不同油菜可溶性糖含量的差異分析 不同污染土配比對油菜可溶性糖含量的影響如圖2,發(fā)現(xiàn)不同污染土配比下,油菜可溶性糖含量變化均較小,3個材料可溶性糖含量均無顯著差異,說明這3個材料的可溶性糖含量受到重金屬污染土環(huán)境影響較小。

圖2 不同污染土配比處理對油菜可溶性糖含量的影響

2.2.2 不同油菜可溶性蛋白含量的差異分析 不同污染土配比下油菜葉片中可溶性蛋白含量差異如圖3,159-6×灃油520可溶性蛋白含量隨著污染土比例的增加,先升高后降低,在含50%和75%污染土配比環(huán)境下低于對照組Ⅰ;灃油520可溶性蛋白含量先降低后升高再降低,在含有25%和75%污染土配比環(huán)境下低于對照組Ⅰ,159-6可溶性蛋白含量變化趨勢和灃油520一致,在25%污染土配比環(huán)境下低于對照組Ⅰ。在含25%和75%污染土配比環(huán)境中,159-6×灃油520和灃油520可溶性蛋白含量均顯著高于159-6。除在50%污染土配比環(huán)境下,灃油520可溶性蛋白含量最高,與159-6×灃油520和159-6有顯著差異。

圖3 不同污染土配比處理對油菜可溶性蛋白含量的影響

2.2.3 不同油菜葉綠素含量的差異分析 不同污染土配比對油菜葉綠素含量的影響如圖4,隨著污染土比例的增加,油菜葉綠素含量呈先升高后降低的趨勢。100%營養(yǎng)土環(huán)境中,159-6×灃油520葉綠素含量最高,顯著高于159-6。在25%污染土環(huán)境下,159-6葉綠素含量顯著高于159-6×灃油520和灃油520;在50%和75%污染土配比環(huán)境中,159-6×灃油520葉綠素含量均顯著高于灃油520和159-6。

圖4 不同污染土配比處理對油菜葉綠素含量的影響

2.2.4 不同油菜抗氧化酶活性和MDA含量的差異分析 不同污染土配比下油菜葉片中SOD、POD、CAT活性和MDA含量(以解質(zhì)量外)差異如圖5,SOD和CAT活性均隨著污染土比例增加先升高后降低,且在含75%污染土配比環(huán)境下均低于對照組Ⅰ;POD活性和MDA含量隨著污染土比例增加而逐漸升高。在含50%和75%污染土配比環(huán)境下,159-6×灃油520的SOD活性均最高;除75%污染土配比環(huán)境下,159-6×灃油520的POD活性均最高,其余污染土環(huán)境下灃油520的POD活性最高;不同污染土配比環(huán)境下,159-6×灃油520的MDA含量均最低。

圖5 不同污染土配比處理對油菜SOD、POD、CAT活性和MDA含量的影響

2.3 相關基因表達情況分析

2.3.1 不同油菜光合作用相關基因表達量的差異分析 不同污染土配比下的油菜葉片中Bna0280620、Bna049040和BnaC08g46180D3個光合作用基因表達情況如圖6,Bna0280620和Bna049040基因在不同污染土配比環(huán)境下的油菜葉片中均下調(diào)表達。在25%污染土環(huán)境下,BnaC08g46180D基因僅在灃油520葉片中上調(diào)表達;Bna0280620基因在159-6葉片中的表達量最高,在159-6×灃油520葉片中的表達量最低;Bna049040基因在159-6葉片中的表達量最高,在灃油520葉片中的表達量最低。在含50%污染土環(huán)境下,BnaC08g46180D基因僅在159-6×灃油520葉片中上調(diào)表達;Bna0280620基因在159-6葉片中的表達量最高,在159-6×灃油520葉片中的表達量最低;Bna049040基因在灃油520葉片中的表達量最高,在159-6葉片中的表達量最低。在含75%污染土環(huán)境下,BnaC08g46180D基因在3個材料中均上調(diào)表達,其中在灃油520葉片中的表達量最高,在159-6葉片中的表達量最低,Bna0280620和Bna049040基因在159-6×灃油520葉片中的表達量最高。

圖6 不同污染土配比處理下光合作用相關基因在不同類型油菜葉片中表達情況

2.3.2 不同油菜抗重金屬相關基因表達量的差異分析 不同污染土配比下的油菜葉片中4個抗重金屬相關基因BnaA08g04000D、BnaA09g24330D、BnNRAMP1和BnPri-miR167a的表達情況如圖7所示,BnaA08g04000D、BnaA09g24330D基因表達量隨著污染土比例升高在3個材料葉片中先降低后升高;BnNRAMP1和BnPri-miR167a基因表達量均在75%污染土配比下的159-6×灃油520葉片中達最高值。在含25%污染土環(huán)境下,BnNRAMP1和BnPri-miR167a基因在159-6×灃油520和159-6葉片中表達量均顯著高于灃油520。在含50%和75%污染土配比環(huán)境中,4個基因在159-6×灃油520葉片中的表達量均最高,在159-6葉片中的表達量最低,以上差異均達顯著水平。

圖7 不同污染土配比處理下抗重金屬相關基因在不同類型油菜葉片中表達情況

2.4 基因表達與生理指標的相關性分析

2.4.1 污染土環(huán)境下油菜光合相關基因表達量與生理指標的相關性分析 對污染土環(huán)境下不同油菜葉片的基因表達量與生理指標進行相關性分析,結果如表2所示,基因表達量與可溶性蛋白和葉綠素的關系更密切。Bna0280620基因在159-6中的表達量與鮮質(zhì)量、可溶性蛋白含量呈顯著負相關,其中與可溶性蛋白含量的相關性最大;在159-6×灃油520中的表達量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關。Bna049040基因在159-6×灃油520中的表達量與可溶性糖呈顯著正相關。BnaC08g46180D基因表達量與生理指標的關系較Bna0280620和Bna049040基因更密切,且在159-6中的相關性普遍低于灃油520和159-6×灃油520。BnaC08g46180D基因在159-6×灃油520中的表達量與鮮質(zhì)量呈顯著正相關、與干質(zhì)量、葉綠素含量呈顯著正相關,與可溶性蛋白含量呈顯著負相關,其中與可溶性蛋白的相關性最大;在灃油520中的表達量與各個生理指標均呈負相關,其中與葉綠素的相關性最大;在159-6中的表達量與干質(zhì)量呈顯著負相關,與葉綠素呈顯著負相關,其中與葉綠素的相關性最大。

表2 光合作用相關基因表達量與生理指標之間的相關性分析

2.4.2 污染土環(huán)境下油菜重金屬脅迫相關基因表達量與酶活性的相關性分析 對污染土環(huán)境下不同油菜葉片的基因表達量與酶活性進行相關性分析,結果如表3所示?；虮磉_量與CAT和MDA的關系最密切,BnPri-miR167a基因在3個油菜中的表達量均與CAT和MDA有較高的相關性,其余基因在159-6×灃油520和159-6中的表達量也與CAT和MDA有較高的相關性。另外,各個基因的表達量與灃油520中的SOD關系最密切,其中BnNRAMP1基因的相關性最大;與灃油520×159中的POD關系最密切,其中BnPri-miR167a基因的相關性最高。

表3 重金屬脅迫相關基因表達量與酶活性之間的相關性分析

3 結論與討論

土壤中重金屬元素在進入植物體后,極易在體內(nèi)富集,會影響植物的各項生理指標,延緩植物生長,甚至會使植物死亡[25]。甘藍型油菜較其余植物相比具有更高的生物量,更能耐受土壤中的重金屬脅迫[26],但不同類型的油菜對重金屬脅迫的適應能力不同[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn),3種甘藍型油菜在不同配比重金屬污染土環(huán)境下均能正常生長發(fā)育,表明油菜對重金屬具有較強的耐性;其中,三交油菜159-6×灃油520的干鮮質(zhì)量最高,且均顯著高于對照組Ⅰ,說明其生長力更強,對重金屬具有更高的耐性,適合種植在重金屬污染的土壤中。

葉綠素含量的高低可反映出光合能力的強弱,葉綠素含量的增加,可以明顯提高植物的光合能力[29]。而過量的重金屬離子會影響葉綠素的合成和光合相關基因的表達水平,抑制植物的光合作用,破壞生理過程,阻礙植物的生長和發(fā)育[30-32]。本研究發(fā)現(xiàn)Bna0280620和Bna049040基因在不同污染土配比環(huán)境下的油菜葉片中的表達量均受到抑制,而在高濃度的重金屬污染土環(huán)境下,誘導了BnaC08g46180D基因的表達。此外,通過相關分析發(fā)現(xiàn)光合相關基因表達量與可溶性蛋白和葉綠素含量有較高相關性,在含50%和75%污染土環(huán)境下,159-6×灃油520的葉綠素含量最高,在含50%污染土環(huán)境下,BnaC08g46180D基因在159-6×灃油520葉片中的表達量最高,在含75%污染土環(huán)境下,Bna0280620和Bna049040基因在159-6×灃油520葉片中的表達量最高。結果表明,在含50%和75%污染土環(huán)境下,159-6×灃油520的光合能力更強,有助于積累更多的干物質(zhì),從而提高對重金屬的耐受性。

植物在重金屬脅迫下會產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),為了免受ROS的侵害,油菜會采取防御機制,產(chǎn)生大量的SOD、POD和CAT,來幫助清除活性氧物質(zhì),減少重金屬對機體的損傷,提高對重金屬的適應能力[33]。張敏[34]發(fā)現(xiàn),在Cd脅迫下CAT和SOD活性均隨脅迫濃度增加呈先增后降趨勢,本研究結果與其一致,且在50%和75%污染土配比環(huán)境下,159-6×灃油520的SOD活性最高。MDA含量是評估抗氧化劑對重金屬脅迫的破壞程度的重要指標,重金屬脅迫下,當油菜膜脂過氧化產(chǎn)生的MDA含量逐漸增多,說明膜脂過氧化作用逐漸增強,膜受害程度逐漸加重,給油菜組織細胞帶來極大的損傷[35]。本研究中MDA含量隨著重金屬污染土比例的增加而升高,說明重金屬使油菜機體受到了損傷,但是159-6×灃油520的MDA含量最低,說明受到的損傷更小。此外,通過相關性分析發(fā)現(xiàn)?？怪亟饘傧嚓P基因表達量與抗氧化酶活性和MDA具有較高的相關性,且在50%和75%污染土配比環(huán)境下,4個抗重金屬基因在159-6×灃油520葉片中的表達量最高,說明159-6×灃油520對重金屬的適應能力更強。

以上結果表明,3種不同雜交類型的油菜在重金屬污染土環(huán)境下均能正常生長,且具有一定的適應能力,其中,159-6×灃油520在重金屬土壤中的抗逆能力最強,可能更適合作為土壤修復植物。

在不同污染土配比環(huán)境下,159-6×灃油520鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均高于對照組Ⅰ,159-6鮮質(zhì)量均高于對照組Ⅰ,灃油520鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均低于對照組Ⅰ;且159-6×灃油520鮮質(zhì)量和干質(zhì)量均顯著高于159-6和灃油520。除含25%污染土環(huán)境下159-6葉綠素含量最高外,其余159-6×灃油520的葉綠素含量均最高。除含50%污染土環(huán)境下灃油520可溶性蛋白含量最高外,其余159-6×灃油520的可溶性蛋白含量均最高。在50%和75%污染土環(huán)境下,159-6×灃油520的SOD活性均最高,MDA含量均低于159-6和灃油520;4個抗重金屬相關基因(BnaA08g04000D、BnaA09g24330D、BnNRAMP1和BnPri-miR167a)在159-6×灃油520葉片中的表達量均高于159-6和灃油520;在75%污染土環(huán)境下Bna0280620和Bna049040基因在159-6×灃油520葉片中的表達量也高于159-6和灃油520。