王可欣,郭昭陽,殷宇航,陳勝忠,宋希云,趙美愛,

(1.青島市主要農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)新與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山東 青島 266109;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 青島 266109)

我國(guó)作為傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)大國(guó),人口基數(shù)大,糧食問題一直備受關(guān)注。玉米(ZeamaysL.)是我國(guó)第一大糧食作物,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全中發(fā)揮重要作用,但在生長(zhǎng)過程中經(jīng)常遭遇干旱、鹽堿、高溫、低溫等非生物脅迫,導(dǎo)致減產(chǎn)和品質(zhì)的降低[1],其中鹽堿地土壤所含的鹽分嚴(yán)重影響作物的正常生長(zhǎng)。我國(guó)鹽堿地的面積約為9 913萬hm2,開發(fā)利用價(jià)值巨大,已被開墾利用的鹽堿地還未達(dá)到其總面積的五分之一[2]。合理利用鹽堿地不僅可以緩解我國(guó)地少人多的局面,還可以在很大程度上緩解糧食供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。鹽堿地治理難度較大,進(jìn)行耐鹽基因的挖掘和耐鹽堿新品種的培育是可行的治理措施之一。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferases,GSTs)是一個(gè)古老且具有多種作用的蛋白質(zhì)超家族[3],可以調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育并在初生代謝、次生代謝、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對(duì)抗生物和非生物脅迫[3]等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[4]。GSTs分為4個(gè)主要的蛋白質(zhì)家族,細(xì)胞質(zhì)GSTs、線粒體GSTs、微粒體GSTs和細(xì)菌磷霉素抗性蛋白,其中細(xì)胞質(zhì)GST家族是最豐富的[5]。在植物中,GST可分為6 類,包括Phi(F)、Tau(U)、Lambda(L)、Theta(T)、Zeta(Z)和脫氫抗壞血酸還原酶(Dehydroascorbate reductases,DHARs),其中Phi(F)和Tau(U)是最大植物特異性和高度應(yīng)激誘導(dǎo)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因種類[6]。根據(jù) GST 蛋白序列構(gòu)建的隱馬爾可夫模型,鑒定出玉米基因組中一共含有37個(gè)ZmGST基因,可分為U、F、Z 3種[7]。U型 GST基因的表達(dá)與細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素等激素有關(guān),對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著調(diào)節(jié)作用[8]。

GST基因在逆境脅迫中扮演著重要角色,包括調(diào)控植物非生物脅迫過程[9]。如AtGSTU17通過作為脅迫介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)成分在干旱和鹽脅迫的適應(yīng)性響應(yīng)中發(fā)揮作用[10],在煙草幼苗中過表達(dá)GST基因,增加了谷胱甘肽依賴性的過氧化物的清除和谷胱甘肽、抗壞血酸代謝的改變,從而減少了氧化損傷[11]。番茄相關(guān)GST基因LeGSTU2在根和花中表達(dá),進(jìn)行擬南芥異源驗(yàn)證獲取的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)NaCl和甘露醇誘導(dǎo)的鹽和滲透脅迫的抵抗力增強(qiáng)[12]。玉米ZmGST23基因的表達(dá)顯著受干旱、鹽、低溫等非生物脅迫的誘導(dǎo)[4]。

GST的作用是通過與谷胱甘肽的結(jié)合來解除有毒物質(zhì),減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[13-14]。鹽脅迫會(huì)導(dǎo)致植物失水使?jié)B透壓改變,體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)紊亂現(xiàn)象,并產(chǎn)生大量活性氧,從而損傷植物質(zhì)膜和其他細(xì)胞組分,進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[15]。GST基因在植物的抗氧化過程中具有十分重要的作用[16],于是推測(cè)鹽脅迫下過量表達(dá)玉米ZmGST基因能在一定程度上減緩對(duì)植物的損傷。GST基因除了抗逆相關(guān)功能,還有一些其他生物作用,主要包括清除體內(nèi)的毒性代謝產(chǎn)物[17-18]并且參與到信號(hào)傳遞中[19]。功能多樣化的GST在研究基因家族進(jìn)化方面具有重要意義,并為研究其在植物發(fā)育和對(duì)環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)中的作用開辟了途徑[20]。

本試驗(yàn)對(duì)ZmGST進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR探究ZmGST組織特異性表達(dá)以及干旱和鹽脅迫下的基因表達(dá)量。ZmGST轉(zhuǎn)入原核載體pET28a并通過pET28a-ZmGST大腸桿菌研究該基因?qū)}脅迫、干旱非生物脅迫的作用,為該基因轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)使用的玉米自交系CA66由玉米分子育種實(shí)驗(yàn)室提供。選取飽滿的玉米種子種植于營(yíng)養(yǎng)土中,三葉期時(shí)取樣。

脅迫處理:使用0.2 mol/L的NaCl以及20% PEG6000處理CA66三葉期玉米,并對(duì)根進(jìn)行分時(shí)段取樣,分別是0,12,24,36 h,于-80 ℃保存。每個(gè)試驗(yàn)組3個(gè)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1ZmGST的克隆和原核表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)NCBI(National Center for Biotechnology Information (nih.gov))中參考序列的CDS全長(zhǎng)進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì),見表1引物1。以根的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后連接中間載體pMD19-T,將菌液PCR以及雙酶切驗(yàn)證后檢測(cè)得到的陽性克隆送青島擎科生物公司測(cè)序,測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒pMD19-T-ZmGST后存于-80 ℃。pET28a菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存,使用pMD19-T-ZmGST質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物見表1引物2,使用T4連接酶配置pET28a-ZmGST連接體系。將菌液PCR驗(yàn)證后檢測(cè)得到的陽性克隆送青島擎科生物公司測(cè)序。具體步驟參照參考文獻(xiàn)[21]。

表1 玉米ZmGST基因所用引物

1.2.2 ZmGST蛋白特性分析 通過NCBI網(wǎng)站的Blast功能,分析該基因的CD-Search保守區(qū)。ProtParam軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析,ProtScale在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行親水性、疏水性的預(yù)測(cè)分析,TMHMM 2.0對(duì)蛋白質(zhì)序列跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析,NetPhos 3.1軟件分析ZmGST蛋白的磷酸化位點(diǎn),SingalP 4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽,Psort Prediction進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),SoPMA分析ZmGST蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),SWISS-MODEL分析三級(jí)結(jié)構(gòu),PlantCARE分析啟動(dòng)子區(qū)域元件。

1.2.3ZmGST基因的組織特異性表達(dá)分析 玉米自交系CA66正常生長(zhǎng)至三葉期,取根、莖、葉樣品至液氮中保存,根據(jù)TaKaRa試劑盒提取RNA,利用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析。引物設(shè)計(jì)見表1引物3,以玉米Actin作為內(nèi)參基因,基因號(hào)為L(zhǎng)OC100282267。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將0.2 mol/L的NaCl以及20% PEG6000處理后的玉米取樣后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性95 ℃ 3 min;變性95 ℃ 10 s,退火55 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,循環(huán)數(shù)35。釆用2-ΔΔCt相對(duì)定量的分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析。

1.2.5 pET28a-ZmGST重組大腸桿菌的鹽、干旱脅迫處理 鹽脅迫:配置NaCl濃度為0.6,0.8,1.0 mol/L的LB液體培養(yǎng)基并在高溫滅菌后,將pET28a空載和pET28a-ZmGST的大腸桿菌分別在超凈工作臺(tái)中接種至上述3種濃度的NaCl培養(yǎng)基中,37 ℃搖床中200 r/min振蕩培養(yǎng),每隔1 h取樣測(cè)定吸光度并進(jìn)行處理與分析。

干旱脅迫:本試驗(yàn)使用PEG6000模擬植物干旱條件,配置PEG6000濃度為5%,10%,15%的LB液體培養(yǎng)基,后續(xù)試驗(yàn)步驟同鹽脅迫。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶ZmGST的克隆

以玉米CA66根、莖、葉cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增可知,ZmGST在根、莖、葉中均能擴(kuò)增(圖1-A),條帶大小為384 bp。連接PMD19-T載體后進(jìn)行菌液PCR鑒定(圖1-B),菌液擴(kuò)增片段大小為384 bp,雙酶切驗(yàn)證在指定位置出現(xiàn)線性化DNA條帶(圖1-C)。測(cè)序結(jié)果與已公布B73序列堿基相似性為99.65%,氨基酸序列相似度為98.43%。pMD19-T-ZmGST連接pET28a原核表達(dá)載體進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證得到正確條帶(圖1-D),測(cè)序與克隆序列比對(duì)相似度為100%。

2.2 ZmGST蛋白質(zhì)特性分析

2.2.1 ZmGST蛋白質(zhì)的理化特性ZmGST堿基序列以及蛋白質(zhì)如圖2-A所示,編碼384 個(gè)核苷酸,127 個(gè)氨基酸。使用ProtParam軟件進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析,表明ZmGST編碼的蛋白質(zhì)分子式為C654H1003N175O189S4,相對(duì)分子量為14.47 ku,理論等電點(diǎn)5.06,總負(fù)電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)為20,正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為16,不穩(wěn)定指數(shù)為46.75,屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。通過NCBI網(wǎng)站的Blast功能,進(jìn)行該基因的CD-Search保守區(qū)分析(圖2-B),發(fā)現(xiàn)克隆的CDS蛋白內(nèi)存在一個(gè)GST_C結(jié)構(gòu)域,屬于Tau(U)這一分支,是植物抗氧化系統(tǒng)的重要成員,可能在逆境響應(yīng)等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[3],該基因包含2個(gè)外顯子(圖2-C)。

A.核苷酸及氨基酸序列;B.保守域分析;C.ZmGST基因結(jié)構(gòu)分析。

利用 ProtScale在線軟件對(duì)ZmGST蛋白質(zhì)序列進(jìn)行親水性、疏水性預(yù)測(cè)分析,親水性蛋白多于疏水性蛋白,該蛋白屬于親水性蛋白(圖3-A)。TMHMM 2.0對(duì)蛋白質(zhì)序列跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析,其氨基酸序列中不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖3-B),可直接進(jìn)行原核表達(dá)的驗(yàn)證。采用NetPhos 3.1修飾位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),ZmGST存在12 個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)(圖3-C),其中Thr(蘇氨酸)有4 個(gè)、Ser(絲氨酸)4 個(gè)、Tyr(酪氨酸)4 個(gè),磷酸化修飾位點(diǎn)較為均等,可能與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育等有關(guān)。使用SignalP 4.1對(duì)ZmGST蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析(圖3-D),未發(fā)現(xiàn)有信號(hào)肽,為非分泌型蛋白。Psort Prediction進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),定位在細(xì)胞核里的可能性最大為34.8%,胞質(zhì)為30.4%,線粒體為21.7%,最小的是細(xì)胞外(包括細(xì)胞壁)是4.3%。

A.疏水親水分析;B.跨膜結(jié)構(gòu)分析;C.磷酸化預(yù)測(cè);D.信號(hào)肽預(yù)測(cè)。

2.2.2 ZmGST蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過SoPMA分析ZmGST蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),如圖4-A所示,二級(jí)結(jié)構(gòu)依次為α螺旋(藍(lán)色)占62.2%、β-折疊(綠色)占7.09%、無規(guī)則卷曲(紫色)占17.32%和延伸鏈(紅色)占13.39%。再通過SWISS-MODEL進(jìn)一步分析三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖4-B所示,發(fā)現(xiàn)同樣存在多個(gè)α螺旋與無規(guī)則卷曲,與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析一致,α螺旋為主要元件。

圖4 ZmGST蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)直觀圖與空間結(jié)構(gòu)

2.2.3ZmGST以及玉米GST家族系統(tǒng)進(jìn)化樹 為了解ZmGST蛋白與不同物種的親緣關(guān)系,將獲得的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行Protein Blast,得到的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖5),該基因ZmGST與高粱(Sorghumbicolor)的親緣關(guān)系最近。對(duì)玉米GST基因家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,利用李曉玉等[7]對(duì)玉米GST家族的建立隱馬爾可夫模型(Hidden markov model,HMM)的方法分析,將玉米GST基因根據(jù)序列相似性分為U型(藍(lán)色區(qū)域)、F型(紫色區(qū)域)、Z型(橙色區(qū)域)三類(圖6)。利用DNAMAN與這些序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)ZmGSTU14與克隆的ZmGST基因的全長(zhǎng)氨基酸相似度最高為82.46%(紅色),屬于U型。

圖5 ZmGST的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 玉米GST家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2.4ZmGST基因啟動(dòng)子分析 利用PlantCARE對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行元件分析,ZmGST基因啟動(dòng)子區(qū)(圖7)含有多個(gè)響應(yīng)逆境及植物激素的作用元件,包括LTR參與低溫反應(yīng)原件、TC-rich repeats參與防御和應(yīng)激反應(yīng)元件、ABRE與脫落酸反應(yīng)相關(guān)元件以及G-box光響應(yīng)元件,推測(cè)基因被鹽脅迫誘導(dǎo)可能與TC-rich repeats元件相關(guān)。

圖7 ZmGST啟動(dòng)子元件分析

2.3 ZmGST的組織特異性表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)玉米不同組織(根、莖、葉)中的基因表達(dá)特異性分析結(jié)果顯示,ZmGST在不同組織中均有表達(dá),相對(duì)表達(dá)量在根中最高,其次為葉和莖(圖8-A)。根部表達(dá)量約為莖的5 倍,葉的2.5倍,說明ZmGST主要在根中發(fā)揮作用。脅迫處理后的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果顯示(圖8-B),在模擬干旱條件下ZmGST基因下調(diào)表達(dá),12～36 h表達(dá)量降低,在24 h最低。鹽處理后該基因的表達(dá)量呈上升趨勢(shì),在24 h的基因表達(dá)量是0 h的3倍。因此,推測(cè)ZmGST在干旱脅迫時(shí)受到抑制,在鹽脅迫處理時(shí)被誘導(dǎo),表明該基因可能對(duì)這兩個(gè)逆境脅迫存在不同作用。

A.ZmGST的組織特異性分析;B.ZmGST 受到脅迫后的表達(dá)量分析(0,12,24,36 h)。不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)。

2.4 ZmGST基因耐鹽功能分析

成功構(gòu)建重組大腸桿菌DH5α(pET28a-ZmGST)后,對(duì)pET28a-ZmGST以及pET28a進(jìn)行不同濃度鹽脅迫,測(cè)得平均OD600如圖9所示,轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒pET28a-ZmGST的菌體生長(zhǎng)情況高于轉(zhuǎn)入空載體pET28a的菌體,說明對(duì)照菌體pET28a在0.6,0.8,1.0 mol/L鹽濃度培養(yǎng)基中菌體的生長(zhǎng)明顯受到了抑制,而轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pET28a-ZmGST的大腸桿菌菌體在0.6,0.8,1.0 mol/L鹽濃度的培養(yǎng)基中均能正常生長(zhǎng),ZmGST基因在原核水平內(nèi)可能對(duì)鹽脅迫有一定的抗性,與鹽脅迫玉米后該基因上調(diào)表達(dá)結(jié)果一致。

圖9 鹽處理后pET28a-ZmGST菌株、pET28a菌株生長(zhǎng)曲線圖

2.5 ZmGST基因耐旱功能分析

成功構(gòu)建重組大腸桿菌DH5α(pET28a-ZmGST)后,對(duì)pET28a-ZmGST以及pET28a進(jìn)行PEG6000的不同濃度干旱脅迫,測(cè)得平均OD600如圖10所示,轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒pET28a-ZmGST的菌體在5%,10%中與空載體pET28a的菌體生長(zhǎng)情況一致,均明顯受到抑制,在15%PEG6000中高于空載菌體生長(zhǎng)狀況,但趨勢(shì)較為相似,推測(cè)該基因?qū)Ω珊得舾小?/p>

圖10 干旱處理后的pET28a-ZmGST菌株、pET28a菌株生長(zhǎng)曲線圖

3 結(jié)論與討論

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶家族成員眾多,存在于各種植物中,在擬南芥[10]、水稻[22]、小麥[23]、玉米[24]等均有研究。在GST家族中,植物特有的是Phi、Tau、Lambda和DHAR類,其中U型是二聚體的,可以催化各種生物的結(jié)合,在除草劑中具有選擇性解毒的作用[25]。U型是玉米谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶成員最多的一類。同樣地,本試驗(yàn)克隆了U型的玉米GST類基因中的一種,通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),ZmGST蛋白相對(duì)分子量是14.47 ku,為不穩(wěn)定的親水蛋白,未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽,不存在跨膜結(jié)構(gòu)域,同樣符合該基因在細(xì)胞核的預(yù)測(cè)。通過分析其表達(dá)量,利用ePlant網(wǎng)站得到該基因在根中表達(dá)水平最大值約是在葉中表達(dá)水平最大值的100 倍且表達(dá)最大值在根毛附近,無根毛區(qū)域表達(dá)量較根毛區(qū)域表達(dá)量相差較大。表達(dá)差異結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果相符,在根中表達(dá)量最大。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析與高粱的親緣關(guān)系最近,在玉米GST家族中與ZmGSTU14相似度最高。

U類GST基因在逆境脅迫中發(fā)揮作用。水稻GST基因OsGSTU3和OsGSTU4編碼Tau類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶,響應(yīng)水稻根系缺氧脅迫誘導(dǎo)以及鹽脅迫[16]。GST還通過在各種生物或非生物脅迫下過量表達(dá),來增強(qiáng)植物對(duì)逆境的抵抗力,是抗氧化防御系統(tǒng)中重要的酶系[26-28]。如大豆GmGSTU2是Tau類谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶家族基因,通過增強(qiáng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的活性介導(dǎo)活性氧和谷胱甘肽的清除,從而增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的耐受性[29]。柳樹ThGSTZ1的過表達(dá)通過增強(qiáng)清除活性氧的能力來改善干旱和耐鹽性[30]。這些與ZmGST響應(yīng)鹽脅迫的功能類似,但是其作用機(jī)理仍需探究,可見GST基因研究具有重要意義。

玉米在生長(zhǎng)過程經(jīng)常會(huì)遇到干旱、鹽、低溫等非生物脅迫,可引起玉米不同程度的脫水,從而引起滲透脅迫,使得ABA濃度急劇上升,從而誘發(fā)大量的活性氧(ROS)的生成。ROS還可以起到誘導(dǎo)植物抵抗逆境的作用,但過量的ROS會(huì)使生物大分子如膜脂、核酸、蛋白質(zhì)等發(fā)生一定損傷,從而引起二次脅迫[31]。GST的主要功能是通過促進(jìn)親電性底物與GSH發(fā)生反應(yīng),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)活性氧和外來物質(zhì)的清除,谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)酶能使GSH的巰基與某些親電子性化合物相結(jié)合,對(duì)DNA和某些蛋白的損害有一定的保護(hù)作用,GST能將疏水性較強(qiáng)的外源性與內(nèi)源性的代謝物進(jìn)行代謝并提高它們的極性,最后排出體外[27],從而保證植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。因此推斷GST作為一類與活性氧有關(guān)的酶,可能與ROS相關(guān)。

為了研究ZmGST基因是否對(duì)脅迫產(chǎn)生響應(yīng),熒光定量結(jié)果顯示在鹽脅迫條件下該基因表達(dá)上調(diào)。通過原核表達(dá)試驗(yàn)證明,重組質(zhì)粒pET28a-ZmGST的大腸桿菌菌體在不同鹽濃度的培養(yǎng)基中均能正常生長(zhǎng),因此,推測(cè)該基因可能與耐鹽作用相關(guān),也可能與ROS相關(guān)。進(jìn)一步探究干旱敏感作用機(jī)理對(duì)于深入研究ZmGST基因功能和真核生物中的作用具有參考價(jià)值,同時(shí)也揭示了該基因在玉米逆境脅迫下反應(yīng)機(jī)制至關(guān)重要。