王冰倩，周瑾欣，魏 星，于 生, 2，張 麗, 2，吳啟南, 2，單鳴秋, 2*

超聲輔助大孔樹脂技術(shù)富集荊芥穗中總黃酮和總酚的工藝研究

王冰倩1，周瑾欣1，魏 星1，于 生1, 2，張 麗1, 2，吳啟南1, 2，單鳴秋1, 2*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023

通過超聲輔助大孔樹脂對荊芥穗水提物中總黃酮和總酚類化合物進(jìn)行富集并對比處理前后化合物含量及活性變化。從7種不同類型樹脂中篩選超聲輔助最佳樹脂型號，在吸附動(dòng)力學(xué)和吸附熱力學(xué)研究下，對超聲溫度、功率、上樣質(zhì)量濃度及解吸溶劑百分比等影響因素進(jìn)行工藝優(yōu)化。測定了優(yōu)化處理前后各成分含量及活性變化。動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)的研究表明，荊芥穗總黃酮適用于Langmuir模型，且吸附過程為自發(fā)吸熱熵增，總酚則為自發(fā)放熱熵減并適用于Freundlich模型，據(jù)此不同的吸附機(jī)制優(yōu)化了2類成分同時(shí)富集的最佳工藝，在超聲輔助AB-8大孔樹脂，溫度25 ℃、時(shí)間2.5 h，功率150 W，上樣質(zhì)量濃度0.1 g/mL，70%乙醇解吸附的過程下，荊芥穗水提物中總黃酮和總酚類化合物含量增加2～3倍，其單體成分的含量及抗氧化和神經(jīng)氨酸酶抑制活性均顯著增加。超聲輔助大孔樹脂技術(shù)為荊芥穗總黃酮和總酚類成分的有效可行富集技術(shù)。

荊芥穗；大孔樹脂；超聲輔助；總黃酮；總酚；吸附動(dòng)力學(xué)；吸附熱力學(xué)；神經(jīng)氨酸酶；橙皮苷；木犀草苷；迷迭香酸；木犀草素-7--葡萄糖醛酸苷

荊芥穗是唇形科荊芥屬植物荊芥Briq.的干燥花穗，具有解表散風(fēng)、透疹、消瘡等功效。臨床應(yīng)用中通常使用荊芥穗的水煎液形式，或者先將荊芥穗揮發(fā)油提取出來，藥渣再經(jīng)水提后制備為水提濃縮物，與其他組分混合后再噴入揮發(fā)油制備成各種劑型[1]以治療感冒、發(fā)燒、過敏性皮炎和濕疹等疾病?？梢钥闯?，除了公認(rèn)的揮發(fā)油外，水提取物也是荊芥穗臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。許多藥理研究表明，荊芥穗水提物具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化等活性[2]。而這些廣泛的生物活性主要?dú)w因于其富含酚類和黃酮類物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，荊芥穗活性物質(zhì)中的木犀草苷、橙皮苷及迷迭香酸等具有顯著抑菌、抗癌、抗病毒和抗氧化作用，在呼吸系統(tǒng)、心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均有不俗的表現(xiàn)[3-5]。盡管用水做提取溶劑時(shí)安全無污染，成本低，但是單一的水提方法，存在黃酮類等活性物質(zhì)提取率較低、雜質(zhì)較多、純度不高的缺點(diǎn)[6]。

近年來，大孔樹脂吸附技術(shù)被引入并應(yīng)用于中藥中活性成分或有效部位和組分的分離富集，具有選擇性佳、機(jī)械強(qiáng)度高、再生方便、吸附速度快等特點(diǎn)[7-8]。另外，超聲輔助萃取技術(shù)具有對植物化學(xué)物質(zhì)活性影響較小、原料利用較好、溶劑和時(shí)間消耗較少、經(jīng)濟(jì)效益顯著等優(yōu)點(diǎn)。目前，很多研究將該方法與大孔樹脂吸附技術(shù)相結(jié)合，可以有效地提高多種生物活性成分[9-10]的純化和富集。

然而，在對荊芥穗活性物質(zhì)純化和富集的研究中，還未見使用到超聲波輔助大孔樹脂的技術(shù)。本研究將應(yīng)用此技術(shù)對荊芥穗總黃酮和總酚類化合物進(jìn)行純化富集，評價(jià)處理前后化合物含量以及活性的變化。期望能為其他研究者更有效地從中藥中富集甚至分離活性組分和成分提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

UV-1600型紫外可見分光光度計(jì)，上海Mapapa設(shè)備有限公司；SB25-12DTD型超聲設(shè)備，南京賽飛生物科技公司；Thermo UItimate 3000型高效液相色譜儀，DAD檢測器，CM7.2色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Waters 2695型高效液相色譜儀，2998型二極管陣列檢測器，美國沃特世公司；Spark 10M型多功能酶標(biāo)儀，帝肯（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；Milli-Q純水儀，美國Millipore公司。

1.2 試藥

荊芥穗購自河北省安國市中草藥市場，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定，為唇形科荊芥屬植物荊芥Briq.的干燥花穗。1,1-二苯-2-吡啶肼自由基（DPPH），購自北京百靈威科技有限公司；福林酚試劑，購自日本化工（南京）有限公司；對照品蘆丁（批號100080-201811，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.2%）、綠原酸（批號110753-201817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.3%）、橙皮苷（批號110721-200211，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.3%），購自中國食品藥品檢定研究院；對照品木犀草苷（批號AF20072618，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.6%）購自成都埃法生物科技公司；對照品迷迭香酸（批號20060201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.1%）購自南京金益柏生物科技公司；對照品木犀草素-7--葡萄糖醛酸苷（批號DSTDM0670，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.7%）購自成都德斯特生物技術(shù)有限公司；神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒（批號P0309），購自上海碧云天生物技術(shù)公司；乙腈和甲醇，HPLC級，購自美國Tedia公司；HPLC級甲酸購自上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析級化學(xué)試劑。

大孔樹脂HPD100、HPD600、HPD826型均購自河北滄州寶恩吸附材料科技有限公司；大孔樹脂HPD300、HP200購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；大孔樹脂AB-8、D101購自上海Macklin生化技術(shù)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物的制備

根據(jù)《中國藥典》2020年版中水蒸氣蒸餾法[11]，取荊芥穗300 g剪碎置于圓底燒瓶中加入10倍量水。經(jīng)電熱套加熱利用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油，待提取器中揮發(fā)油液面不再上升后收集揮發(fā)油并濾過水提液，再加入8倍量水繼續(xù)提取藥渣2 h后濾過并合并2次提取液。將提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮及真空干燥箱干燥制成固體粉末，得到荊芥穗水提物樣品60 g（以生藥量計(jì)算得率為20%）。取5 g水提物樣品經(jīng)超聲輔助大孔樹脂最佳工藝處理后的解吸液進(jìn)行濃縮干燥成固體粉末，得到荊芥穗處理后樣品1 g（以生藥量計(jì)算得率為4%）。

2.2 總黃酮和總酚的測定

稱取適量荊芥穗水提物樣品及處理后樣品，分別加入純水和70%乙醇超聲完全溶解配制成一定質(zhì)量濃度的水提物供試品溶液和處理后供試品溶液。

采用三氯化鋁比色法[12]測定總黃酮的含量。

總酚含量則采用福林酚法測定，具體測定方法在文獻(xiàn)報(bào)道[13]的基礎(chǔ)上略有修改。將0.5 mL樣品溶液加入到0.5 mL 0.25 mol/L的福林酚試劑中混合均勻，靜置3 min后，加入1 mL的10%碳酸鈉溶液，混合均勻后在室溫下靜置30 min，然后在4000 r/min下離心10 min取上清液在760 nm處測定其吸光度。

分別以蘆丁和綠原酸作為總黃酮和總酚的對照品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以質(zhì)量濃度為軸，相應(yīng)的吸光度為軸擬合回歸方程并計(jì)算，結(jié)果擬合方程分別為總黃酮＝0.454 7－0.005 9，＝0.999 5；總酚酸＝16.809 1＋0.027 6，＝0.999 1。

2.3 大孔樹脂預(yù)處理

每個(gè)樹脂在95%乙醇中浸泡24 h后用純水沖洗至無醇味，然后在2% HCl溶液中浸泡4 h，水洗至中性后在4% NaOH溶液中再浸泡4 h。然后水洗至中性后備用。

2.4 大孔樹脂型號篩選

取荊芥穗水提物樣品適量，加純水完全溶解后配制成0.1 g/mL水提物溶液。再取各型號預(yù)處理后樹脂4 g，加入20 mL水提物溶液并在相同條件下進(jìn)行超聲輔助吸附后濾過，用純水清洗樹脂表面去除殘留后，加入20 mL的95%乙醇解吸附。測定總黃酮和總酚含量并計(jì)算吸附能力（1）、吸附率（1）、解吸附能力（2）、解吸率（2）[9]。

1＝(0－1)0/

1＝(0－1)/0

2＝dd/

2＝dd/(0－1)0

0和1為溶液中的初始質(zhì)量濃度和平衡質(zhì)量濃度，0為樣品溶液體積，為所用樹脂的干質(zhì)量，d為解吸溶液中的質(zhì)量濃度，d為解吸劑95%乙醇的體積

結(jié)果如表1所示，AB-8的每個(gè)指標(biāo)均高于其他類型，在富集能力和再生能力中表現(xiàn)最好。根據(jù)“相似相溶”的原理，極性樹脂通常對極性化合物具有較高的吸附率，AB-8屬于弱極性這表明荊芥穗水提液中大多數(shù)黃酮類和酚類物質(zhì)具有弱極性且具有一定極性的范德華力和氫鍵都較低。

表1 不同型號大孔樹脂的篩選

Table 1 Screening of different types of macroporous resin

樹脂型號總黃酮總酚 Q1/(mg?g?1)Q2/(mg?g?1)R1/%R2/%Q1/(mg?g?1)Q2/(mg?g?1)R1/%R2/% D10131.0926.1078.9056.5715.5415.1083.5760.37 HP-2032.6326.8780.2354.5715.4915.2983.2060.67 HPD-30029.9125.3178.6057.0715.2214.7383.3060.43 AB-834.6128.7581.8761.9719.2717.0784.8063.10 HPD-60032.7828.1781.2057.4317.8416.3583.1762.20 S-828.7523.4579.8057.9014.6413.7681.9959.97 HPD-82632.8827.9778.6361.3716.6716.3684.7059.57

2.5 吸附動(dòng)力學(xué)研究

取荊芥穗水提物適量加純水溶解配制成一定質(zhì)量濃度的水提物溶液20 mL，加入到4 g預(yù)處理好的AB-8大孔樹脂中，在功率150 W，溫度25、35、45 ℃下進(jìn)行超聲輔助吸附處理。間隔相同時(shí)間取吸附液檢測吸光度以監(jiān)測總黃酮和總酚含量。采用3種動(dòng)力學(xué)模型（偽一階、偽二階和粒子內(nèi)擴(kuò)散）來描述吸附過程[14]。動(dòng)力學(xué)模型的方程如下。

偽一階動(dòng)力學(xué)模型：ln(e－Q)＝lne－0

偽二階動(dòng)力學(xué)模型：/Q＝1/(1e2)＋/e

粒子內(nèi)擴(kuò)散模型：Q＝21/2＋

0、1和2分別為偽一階模型、偽二階模型、粒子擴(kuò)散模型的速率常數(shù)，Q為單位樹脂在時(shí)刻的吸附量，e為單位樹脂在平衡時(shí)間時(shí)的吸附量

總黃酮和總酚在AB-8大孔樹脂中的吸附動(dòng)力學(xué)曲線如圖1所示。結(jié)果表明，吸附能力隨時(shí)間和溫度的增加而升高。此外，在總黃酮方面，35 ℃下的平衡吸附能力幾乎與45 ℃相同；在總酚方面，35 ℃時(shí)的吸附能力明顯優(yōu)于45 ℃。因此，對于2類化合物來說，35 ℃為最佳吸附溫度。

3種動(dòng)力學(xué)模型如表2所示，可以發(fā)現(xiàn)偽二階模型更適合于總黃酮和總酚的吸附（系數(shù)均＞0.99），則控速步驟為樹脂內(nèi)部的化學(xué)吸附，其力可能來自于吸附質(zhì)和樹脂之間的電子共享或電子轉(zhuǎn)移[17]。另外一般來說吸附過程分為液膜擴(kuò)散、粒子內(nèi)擴(kuò)散和吸附反應(yīng)3個(gè)步驟，結(jié)果如表2所示，粒子內(nèi)擴(kuò)散模型的所有曲線都沒有通過原點(diǎn)，這說明2類化合物的吸附速率的控制不僅僅受到粒子擴(kuò)散的影響，也受到液膜擴(kuò)散的影響。

圖1 不同溫度下總黃酮和總酚在AB-8樹脂上的吸附動(dòng)力曲線

表2 總黃酮和總酚在AB-8樹脂上的吸附動(dòng)力學(xué)方程

Table 2 Adsorption kinetics equations and parameters of total flavonoids and total phenols on AB-8 macroporous resin

物質(zhì)T/℃?zhèn)我浑A模型偽二階模型粒子內(nèi)擴(kuò)散模型 總黃酮25ln(Qe－Qt)＝?0.013 3 t－0.074 2 (R2＝0.939 4)t/Qt＝0.920 4 t＋32.80 (R2＝0.991 5)Qt＝0.072 8 t1/2＋0.061 3 (R2＝0.983 0) 35ln(Qe－Qt)＝?0.030 2 t－0.141 4 (R2＝0.978 3)t/Qt＝1.237 6 t＋40.11 (R2＝0.994 7)Qt＝0.074 6 t1/2－0.105 9 (R2＝0.901 1) 45ln(Qe－Qt)＝?0.031 5 t－0.959 0 (R2＝0.982 3)t/Qt＝0.799 1 t＋48.77 (R2＝0.998 1)Qt＝0.131 6 t1/2－0.450 3 (R2＝0.865 8) 總酚25ln(Qe－Qt)＝?0.014 1 t－0.424 5 (R2＝0.910 2)t/Qt＝1.741 0 t＋68.27 (R2＝0.993 8)Qt＝0.043 2 t1/2－0.001 8 (R2＝0.985 0) 35ln(Qe－Qt)＝?0.042 1 t－0.266 3 (R2＝0.968 5)t/Qt＝1.138 0 t＋16.83 (R2＝0.996 0)Qt＝0.067 5 t1/2－0.062 5 (R2＝0.914 5) 45ln(Qe－Qt)＝?0.033 8 t－0.450 3 (R2＝0.989 8)t/Qt＝1.269 0 t＋83.93 (R2＝0.995 6)Qt＝0.051 0 t1/2－0.025 1 (R2＝0.976 2)

2.6 吸附熱力學(xué)研究

2.6.1 吸附等溫線 總黃酮和總酚在AB-8上的吸附等溫線如圖2所示?？傮w上總黃酮和總酚的吸附能力均隨溫度的升高而增加。而35 ℃時(shí)的總酚的等溫線高于45 ℃，這表明總黃酮的吸附是吸熱，溫度升高有利于吸附，而總酚則是放熱，在一定范圍內(nèi)的低溫有利于吸附。

分別取4 g預(yù)處理好的AB-8樹脂，加入配制好的5種不同質(zhì)量濃度水提物溶液，分別在3種溫度（25、35、45 ℃）下超聲輔助吸附這5種不同質(zhì)量濃度溶液并計(jì)算樹脂平衡吸附量（e）。采用Langmuir/Freundlich方程分析了它們的適應(yīng)度。相關(guān)方程式如下[15]。

L＝1/(1＋L0)

Langmuir模型：e/e＝e/m＋1/(Lm)

Freundlich模型：lne＝lnF＋1/lne

L為平衡參數(shù)，L和F分別為Langmuir常數(shù)和Freundlich常數(shù)，0為初始質(zhì)量濃度，e為平衡質(zhì)量濃度，m為理論最大吸附能力

表3中總結(jié)了等溫方程和相應(yīng)參數(shù)，可以看出總酚更適合于Freundlich模型，而總黃酮?jiǎng)t適合于Langmuir模型。表明了吸附性能[18]，所有的1/值都在0.7～0.9，AB-8樹脂吸附為有利吸附，與分離系數(shù)L一致。m值同樣反應(yīng)了35 ℃作為適合吸附溫度的依據(jù)。

圖2 不同溫度下總黃酮和總酚在AB-8樹脂上的吸附等溫曲線

表3 總黃酮和總酚在AB-8樹脂上的吸附等溫方程

Table 3 Adsorption isotherms of total flavonoids and total phenols on AB-8 macroporous resin

物質(zhì)T/℃Freundlich模型Langmuir模型 方程KF1/nR2方程QmRLR2 總黃酮25lnQe＝0.872 9 lnCe＋4.923137.50.872 60.971 1Ce/Qe＝0.005 200 Ce＋0.002 300192.30.895 1～0.915 40.983 3 35lnQe＝0.821 3 lnCe＋4.895138.60.821 00.980 0Ce/Qe＝0.004 473 Ce＋0.004 889223.60.954 7～0.963 90.987 8 45lnQe＝0.833 7 lnCe＋4.945140.50.833 30.969 3Ce/Qe＝0.004 200 Ce＋0.006 200238.10.973 2～0.978 40.994 3 總酚25lnQe＝0.751 0 lnCe＋4.09059.720.750 80.989 2Ce/Qe＝0.007 300 Ce＋0.014 000137.00.983 9～0.988 70.935 1 35lnQe＝0.765 2 lnCe＋4.24269.510.770 40.994 9Ce/Qe＝0.006 200 Ce＋0.019 000161.30.989 8～0.992 90.991 9 45lnQe＝0.770 4 lnCe＋4.19266.150.765 10.976 4

2.6.2 熱力學(xué)參數(shù) 研究了吉布斯自由能變化（Δ）、焓變（Δ）和熵變（Δ）3個(gè)指標(biāo)[15]，將3個(gè)e值設(shè)為5、10、15 mg/g，相關(guān)e值采用上述方程計(jì)算。1/和lne分別作為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，得到Clapeyron-Clausius方程和Δ。

lne＝Δ/R－ln0

0為常數(shù)，R為氣體常數(shù)［8.314 J/(mol·K)］，為熱力學(xué)溫度，Δ可以由Gibbs方程和Freundlich方程推導(dǎo)出

Δ＝?R

是Freundlich方程中的表觀常數(shù)，Δ由Gibbs Helmholtz方程得到

Δ＝(Δ－Δ)/

結(jié)果如表4所示，列出了AB-8大孔樹脂上總黃酮和總酚的熱力學(xué)參數(shù)。Δ均＜0，吸附為自發(fā)反應(yīng)。Δ＞0，Δ＞0，表明總黃酮的吸附是一個(gè)自發(fā)、吸熱和熵增的過程并隨著吸附量的增加Δ減小，這可能是由于吸附質(zhì)中偶極矩的存在和吸附劑表面吸附中心能量的差異所致。Δ＜0，Δ＜0，表明總酚的吸附是一個(gè)自發(fā)、放熱和熵減的過程。

2.7 超聲波輔助的大孔樹脂富集工藝優(yōu)化

2.7.1 最佳溫度篩選 其他條件相同下分別于25、35、45 ℃的溫度下進(jìn)行超聲輔助吸附處理，吸附過程中間隔相同時(shí)間分別取出一定體積的吸附溶液進(jìn)行吸光度測定評價(jià)總黃酮和總酚的吸附來篩選最佳溫度。如圖3所示，結(jié)果表明了不同溫度下總黃酮和總酚的吸附情況，其現(xiàn)象與熱力學(xué)研究結(jié)果一致，因此，確定35 ℃作為最佳工藝溫度。另外2類成分在最佳溫度下，均能在2.5 h達(dá)到吸附平衡。因此，確定2.5 h為最佳工藝時(shí)間。

2.7.2 最佳功率篩選 在35 ℃下分別于50、100、150、200 W的不同功率下進(jìn)行超聲輔助吸附處理。吸附過程中間隔相同時(shí)間分別取出一定體積的吸附溶液進(jìn)行吸光度測定評價(jià)總黃酮和總酚的吸附來篩選最佳功率。如圖4所示，結(jié)果表明總黃酮和總酚的吸附能力均隨超聲功率的增加而增加。而當(dāng)功率200 W時(shí)，會發(fā)現(xiàn)一些非基因斷裂的樹脂粒子。因此，確定150 W為工藝最佳功率。

2.7.3 最佳上樣質(zhì)量濃度篩選 在35 ℃、150 W下分別加入5種不同質(zhì)量濃度水提物溶液（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/mL）超聲輔助吸附/解吸附處理。分別計(jì)算不同質(zhì)量濃度溶液的吸附率和解吸率篩選出最佳上樣質(zhì)量濃度。結(jié)果如表5所示，顯示了不同的提取物質(zhì)量濃度對吸附率和解吸率的影響。以這2個(gè)比率的乘積值作為回收率進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果表明，在0.1 g/mL時(shí)2類化合物的回收率均最高。因此，確定最佳上樣質(zhì)量濃度為0.1 g/mL。

表4 AB-8樹脂上總黃酮和總酚的熱力學(xué)參數(shù)

Table 4 Adsorption thermodynamics of total flavonoids and total phenols on AB-8 macroporous resin

物質(zhì)Qe/(mg?g?1)ΔH/(kJ?mol?1)ΔG/(J?mol?1)ΔS/(J?mol?1?K) 298 K308 K318 K298 K308 K318 K 總黃酮5851?2838?3118?31713.72812.88613.497 10683 3.21812.34012.120 15575 2.85511.98911.780 總酚5?3983?3299?3324?3455?2.295?2.141?1.661 10?3910 ?2.051?1.904?1.432 15?3857 ?1.873?1.732?1.265

圖3 最佳溫度的篩選

圖4 最佳功率的篩選

表5 最佳上樣質(zhì)量濃度篩選

Table 5 Screening of optimal sample concentration

上樣質(zhì)量濃度/(g?mL?1)總黃酮總酚 吸附率/%解吸附率/%回收率/%吸附率/%解吸附率/%回收率/% 0.0561.2068.8042.1186.9049.7043.19 0.1055.3091.9050.8274.8079.7059.62 0.1550.0091.3045.6570.0080.7056.50 0.2034.0098.6033.5257.0082.5047.03 0.2551.2585.4043.7771.4072.3051.62

2.7.4 最佳解吸乙醇體積分?jǐn)?shù)篩選 在最佳溫度、體積分?jǐn)?shù)濃度和功率下吸附后，分別使用60%、70%、80%、95%乙醇作為解吸溶劑進(jìn)行解吸附。計(jì)算不同百分比解吸附劑的解吸率來篩選出最佳洗脫劑百分比。結(jié)果如表6所示，顯示了不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響。當(dāng)以70%乙醇為解吸溶劑時(shí)，總黃酮和總酚的解吸率均為最高。因此，確定70%乙醇作為最佳解吸附溶劑。

表6 最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)篩選

Table 6 Screening of optimal ethanol concentration

乙醇/%解吸率/%乙醇/%解吸率/% 總黃酮總酚總黃酮總酚 6053.8078.408054.2074.40 7081.9083.909558.7869.30

2.8 HPLC定量分析

2.8.1 色譜條件 色譜柱為Waters X-Select C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；溫度為30 ℃；體積流量為0.8 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL；流動(dòng)相為0.3%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫程序：0～10 min，5%～13%乙腈；10～21 min，13%～17%乙腈；21～38 min，17%～25%乙腈；38～50 min，25%～32%乙腈；50～60 min，32%～45%乙腈；60～70 min，45%～95%乙腈；70～75 min，95%～5%乙腈；檢測波長設(shè)置為270 nm。

2.8.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取橙皮苷、木犀草苷、迷迭香酸和木犀草素-7--葡萄糖醛酸苷對照品適量，加入70%乙醇制成含橙皮苷99.41 μg/mL，木犀草苷100.80 μg/mL，木犀草素-7--葡萄糖醛酸苷105.3 μg/mL和迷迭香酸100.12 μg/mL的混合對照品溶液。

2.8.3 供試品溶液的制備 精確稱取100 mg水提物樣品和100 mg處理后樣品，分別加入50 mL純水和50 mL 70%乙醇溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過后制成水提物供試品溶液和處理后供試品溶液。

2.8.4 方法學(xué)考察 對其定量分析進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，包括線性、精度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率。結(jié)果見表7，4種成分具有良好的線性關(guān)系，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性的RSD值均小于3%，回收率限度符合《中國藥典》2020年版規(guī)定[11]。即分析方法可用于這4種成分的測定。

2.8.5 樣品測定 按照上述優(yōu)化后的工藝制備了處理后樣品。測定其總黃酮和總酚及4個(gè)單體成分（木犀草苷、橙皮苷、迷迭香酸、木犀草素-7--葡萄糖醛酸苷）的含量，結(jié)果見表8，色譜圖見圖5。很容易觀察到超聲輔助大孔樹脂處理顯著使總黃酮和總酚含量增加。

2.9 DPPH自由基清除和神經(jīng)氨酸酶抑制活性評價(jià)

2.9.1 DPPH自由基清除活性測定 取DPPH適量，用甲醇溶解后稀釋為0.1 mg/mL待用，分別配制不同質(zhì)量濃度的水提物供試品溶液和處理后供試品溶液（12.5、25.0、50.0、75.0、100.0 μg/mL）。DPPH自由基清除能力測定參照文獻(xiàn)報(bào)道[16]進(jìn)行。根據(jù)色譜中的DPPH峰面積，計(jì)算自由基清除率，結(jié)果見表9。

表7 4種成分的線性、精密度、重復(fù)性、回收率和穩(wěn)定性

Table 7 Calibration curves, precision, repeatability, stability and recovery of four analytes

成分回歸方程r線性范圍/(μg?mL?1)RSD/%平均回收率/% 精密度重復(fù)性穩(wěn)定性平均值RSD 橙皮苷Y＝0.243 9 X－0.115 20.999 946.213～99.4101.352.171.8097.344.90 木犀草苷Y＝0.448 3 X－0.524 70.999 956.300～100.8002.372.942.6899.663.76 木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷Y＝0.380 5 X－0.297 00.999 876.581～105.3000.561.101.1895.183.25 迷迭香酸Y＝0.196 6 X－0.221 90.999 996.258～100.1002.432.891.7399.254.78

表8 大孔樹脂處理前后荊芥穗提取物中總黃酮、總酚含量與單體成分含量的比較

Table 8 Comparison of total flavonoids, total phenols and monomers in extracts of SS before and after treatment with macroporous resin

樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg?g?1) 橙皮苷木犀草苷木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷迷迭香酸總黃酮總酚 處理前4.97510.8724.8320.780228.901118.918 處理后14.48028.9837.1312.449514.607323.410

1-木犀草苷 2-橙皮苷 3-迷迭香酸 4-木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷

DPPH自由基清除率＝(PA空白－PA樣品)/PA空白

PA空白和PA樣品分別表示空白對照溶液和反應(yīng)溶液的DPPH峰面積

分別以質(zhì)量濃度為軸，以水提物的抑制率及處理后的抑制率為軸擬合方程（處理前＝ 0.559 9＋27.768，2＝0.940 6；處理后＝0.631 3＋36.272，2＝0.945 7）并計(jì)算DPPH清除的半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50），結(jié)果如表10所示。通過計(jì)算可以看出，經(jīng)超聲輔助大孔樹脂處理后的抗氧化活性提高約1.8倍。

2.9.2 神經(jīng)氨酸酶抑制活性測定 神經(jīng)氨酸酶抑制劑（neuraminidase inhibitor，NAI）篩選按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

表9 水提物供試品溶液和處理后供試品溶液色譜中的DPPH峰面積

Table 9 DPPH peak area in chromatography of aqueous extract test solution and treated test solution

質(zhì)量濃度/(μg?mL?1)PA空白處理前水提物處理后水提物 PA樣品抑制率/%PA樣品抑制率/% 12.506.498 24.583 329.474.047 437.72 25.00 3.252 749.952.924 854.99 50.00 3.035 053.291.675 874.21 75.00 2.033 968.700.799 387.71 100.00 1.142 982.410.391 893.97

表10 處理前后抗氧化和神經(jīng)氨酸酶抑制活性比較

Table 10 Comparison of antioxidant and neuraminidase inhibitory activities before and after treatment

樣品IC50/(μg?mL?1) DPPH自由基清除神經(jīng)氨酸酶抑制 處理前39.83315.71 處理后21.8088.24

（1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在96孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入70 μL檢測緩沖液，再分別加入0、1.0、2.0、5.0、7.5、10.0 μL的神經(jīng)氨酸酶，用純水補(bǔ)足至總體積90 μL。得回歸方程＝?610.25＋66 317.0，2＝0.986 9。

（2）樣品測定：在加入神經(jīng)氨酸酶后再加入10 μL樣品后純水補(bǔ)足體積。振動(dòng)混勻1 min后37 ℃孵育2 min使完全反應(yīng)后，每孔加入10 μL熒光底物。再振動(dòng)混勻1 min，37 ℃孵育30 min后進(jìn)行熒光測定。激發(fā)波長為322 nm，發(fā)射波長為450 nm。計(jì)算神經(jīng)氨酸酶抑制率，結(jié)果見表11。

神經(jīng)氨酸酶抑制率＝(0－)/0

0為對照組的吸光度，為樣品溶液的吸光度

處理前后的樣品分別設(shè)置不同的質(zhì)量濃度檢測熒光強(qiáng)度，計(jì)算對應(yīng)的抑制率。以質(zhì)量濃度為軸，抑制率為軸建立曲線，并計(jì)算神經(jīng)氨酸酶抑制的IC50值，結(jié)果如表10所示。通過計(jì)算可以看出，經(jīng)超聲輔助大孔樹脂處理后的神經(jīng)氨酸酶抑制活性增加了約3.5倍。

對于黃酮和酚類成分的抗氧化和抗流感活性[19-21]已有很多報(bào)道，經(jīng)過超聲輔助大孔樹脂處理后的樣品抗氧化和抗流感的活性有明顯提高，這可能是由于處理后的總黃酮和總酚含量的增加以及特定生物活性成分的富集所致。

表11 處理前后供試品溶液的神經(jīng)氨酸酶抑制率

Table 11 Neuraminidase inhibition rate of test solution before and after treatment

水提物質(zhì)量濃度/(μg?mL?1)抑制率/%回歸方程 處理前2 500.0100.00Y＝0.230 6 lnX＋0.766 1， 1 250.078.53R2＝0.986 6 625.065.43 312.551.09 處理后1 250.0103.00Y＝0.219 8 lnX＋1.033 6， 625.099.37R2＝0.916 7 312.583.11 208.363.59 156.361.46

3 結(jié)論

對機(jī)體來說，氧化和抗氧化失衡會導(dǎo)致組織損傷，是引發(fā)各種疾病的因素之一，對健康極為不利。流感病毒則高發(fā)于春冬兩季，傳播速度快且易引起其他嚴(yán)重呼吸道并發(fā)癥。而荊芥穗在許多研究中都表現(xiàn)出明顯的抗氧化和抗病毒作用且大都集中在揮發(fā)油組分的研究上[16,22]，在大健康時(shí)代背景下尋求更多生物活性顯著的植物藥例如荊芥穗，和積極實(shí)現(xiàn)資源利用最大化，擴(kuò)大藥用部位和范圍，對于助力恢復(fù)和保持健康是極為重要的。本研究以荊芥穗水提物為例，對超聲輔助大孔樹脂吸附/解吸對某些中藥中黃酮類和酚類物質(zhì)的富集提供了思路。在吸附過程中，研究了荊芥穗總黃酮和總酚吸附的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)，發(fā)現(xiàn)這2類成分的吸附機(jī)制有所差異，針對此，本實(shí)驗(yàn)合理優(yōu)化了同時(shí)富集2類成分時(shí)的關(guān)鍵因素。在此技術(shù)和條件下，有效提高了荊芥穗水提物中活性物質(zhì)的含量并增強(qiáng)了抗氧化和抗流感的作用，該技術(shù)的使用也可以為擴(kuò)大荊芥穗的應(yīng)用范圍提供幫助。本研究表明，超聲波輔助大孔樹脂處理是一種有效的富集和純化技術(shù)，被認(rèn)為可以促進(jìn)樹脂表面氫鍵的形成和粗糙度的改變，促進(jìn)吸附過程。在此基礎(chǔ)上，也希望為超聲輔助大孔樹脂吸附/解吸富集和純化活性組分和成分提供一些研究證據(jù)和依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 243-244, 543-544, 994-995, 1121-1122, 1403-1404, 1626, 1650.

[2] Wang L X, Wu H W, Liu C,. A review of the botany, traditional uses, phytochemistry and pharmacology of[J]., 2022, 21(3): 835-862.

[3] 管仁偉, 曲永勝, 顧正位, 等. 木犀草苷的藥理作用研究 [J]. 中國野生植物資源, 2014, 33(1): 1-3.

[4] 錢俊臻, 王伯初. 橙皮苷的藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2010, 22(1): 176-180.

[5] Guan H Q, Luo W B, Bao B H,. A comprehensive review of rosmarinic acid: From phytochemistry to pharmacology and its new insight [J]., 2022, 27(10): 3292.

[6] 景聯(lián)鵬, 唐徐禹, 顧麗莉, 等. 植物中黃酮類化合物提取技術(shù)研究進(jìn)展 [J]. 纖維素科學(xué)與技術(shù), 2021, 29(4):60-70.

[7] Lee J, Kim J, Lee Y,. Radiation protection effects ofwater extracts by gender in SD rats [J]. J Korean Soc Radiol, 2021, 15: 313-320.

[8] 劉丹, 吳葉紅, 李瑋桓, 等. 大孔吸附樹脂在天然產(chǎn)物分離純化中的應(yīng)用 [J]. 中草藥, 2016, 47(15): 2764-2770.

[9] Shen D B, Labreche F, Wu C E,. Ultrasound-assisted adsorption/desorption of jujube peel flavonoids using macroporous resins [J]., 2022, 368: 130800.

[10] Wang L, Boussetta N, Lebovka N,. Ultrasound assisted purification of polyphenols of apple skins by adsorption/desorption procedure [J]., 2019, 55: 18-24.

[11] 中國藥典 [S]. 四部. 2022: 233, 480.

[12] 馬雪潔, 程路峰, 楊淑梅, 等. 異葉青蘭總黃酮的含量測定及體外抗氧化活性研究 [J]. 中南藥學(xué), 2021, 19(6): 1130-1133.

[13] Hou M Y, Zhang L B.Adsorption/desorption characteristics and chromatographic purification of polyphenols from(Dryand.) Merr. using macroporous adsorption resin [J]., 2021, 170: 113729.

[14] 譚佳琪, 孫旗, 劉春成, 等. 大孔樹脂吸附樹莓花色苷的吸附性能 [J]. 食品科技, 2018, 43(9): 302-309.

[15] 張媛, 康龍麗, 金天博, 等. 西藏雪蓮總黃酮在大孔吸附樹脂上的吸附動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)研究 [J]. 離子交換與吸附, 2016, 32(4): 358-367.

[16] Guo S C, Yu S, Qian Y,. Correlation of antioxidant activity and volatile oil chemical components fromherbs by chemometric methods [J]., 2017, 20(Sup1): S1082-S1092.

[17] 婁嵩, 劉永峰, 白清清, 等. 大孔吸附樹脂的吸附機(jī)理 [J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2012, 24(8): 1427-1436.

[18] 熊利芝, 王溶, 田偉, 等. 大孔吸附樹脂對杜仲葉總黃酮的吸附熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)研究 [J]. 離子交換與吸附, 2013, 29(06): 526-534.

[19] 趙薪苑, 陳婧, 方建國, 等. 中藥和天然藥物中黃酮抗病毒活性及其機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2018, 37(4): 410-415.

[20] 吳紅偉, 李東輝, 宋沁潔, 等. 黃芪趁鮮切制飲片與傳統(tǒng)飲片化學(xué)成分及體外抗氧化活性比較研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(22): 7039-7047.

[21] Sekizawa H, Ikuta K, Mizuta K,. Relationship between polyphenol content and anti-influenza viral effects of berries [J]., 2013, 93(9): 2239-2241.

[22] 何婷, 湯奇, 曾南, 等. 荊芥揮發(fā)油及其主要成分抗流感病毒作用與機(jī)制研究 [J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(11): 1772-1777.

Research on process of enriching total flavonoids and total phenols inby ultrasound-assisted macroporous resin technology

WANG Bing-qian1, ZHOU Jin-xin1, WEI Xing1, YU Sheng1, 2, ZHANG Li1, 2, WU Qi-nan1, 2, SHAN Ming-qiu1, 2

1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing 210023, China

To enrich the total flavonoids and total phenolic in the aqueous extracts of Jingjiesui (, SS) by ultrasonic-assisted macroporous resin, and compare with the changes of compound content and activity before and after treatment.The best ultrasound-assisted resin model was screened from seven different types of resins, and the influencing factors such as ultrasonic temperature, power, sample concentration and percentage of solvent desorption were optimized under the study of adsorption dynamics and thermodynamics. The changes in content and activity of each compound before and after the enrichment treatment were evaluated in terms of DPPH radical scavenging capacity and neuraminidase inhibition capacity.The study of kinetics and thermodynamics showed that the total flavonoids is suitable for the Langmuir model, the adsorption process is spontaneous endothermic entropy increase, the total phenol is spontaneous exothermic, and the optimal process for the simultaneous enrichment of the two types of components is optimized through this adsorption mechanism. In the process of ultrasound-assisted AB-8 macroporous resin (25 ℃ for temperature, 2.5 h for time, 150 W for power, 0.1 g/mL for sample concentration, 70% ethanol for desorption solvent), the content of total flavonoids and total phenolic compounds in the water extract of SS increased 2—3 times, and the content of monomer components and its antioxidant and neuraminidase inhibitory activities were increased significantly.Ultrasonic- assisted macroporous resin technique is a effective enrichment technique of total flavonoids and total phenolic components in SS.

; macroporous resin; ultrasonic assistance; total flavonoids; total phenols;adsorption kinetics; adsorption thermodynamics; neuroaminidase; hesperidin; luteoloside; rosmarinic acid; luteolin-7--glucuronide

R283.6

A

0253 - 2670(2023)17 - 5541 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.008

2023-02-13

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81973435）；江蘇省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（MS2022005）

王冰倩（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制與分析技術(shù)。E-mail: 20200895@njucm.edu.cn

單鳴秋，副教授。E-mail: shanmingqiu@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]