汪慧華, 鄒映雪

(1. 天津醫(yī)科大學(xué) 研究生院, 天津, 300350; 2. 天津市兒童醫(yī)院 呼吸科, 天津, 300350)

肺炎支原體(MP)是兒童呼吸道感染最常見的病原體之一, MP肺炎占住院兒童社區(qū)獲得性肺炎(CAP)的10%～40%, 每3～7年出現(xiàn)周期性爆發(fā)現(xiàn)象[1-3]。MP是能夠進(jìn)行自我復(fù)制且能夠在體外不依靠活體細(xì)胞生存的最小微生物[4], 缺乏細(xì)胞壁使得MP對作用于細(xì)胞壁的青霉素類、頭孢菌類抗生素天然耐藥,目前兒童MP感染首選大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療[5]。近年來, MP感染率逐年升高,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素臨床使用頻繁,世界范圍內(nèi)MP耐藥情況嚴(yán)重,中國的MP耐藥率亦高達(dá)90%以上[6-7],故臨床重癥和難治性MP感染隨之增多。MP感染可導(dǎo)致多系統(tǒng)受累,其中以呼吸系統(tǒng)損傷最為常見,輕癥患者多數(shù)表現(xiàn)為自限性,但MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥會造成治療效果欠佳。與對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感的MP菌株相比,耐藥菌株會引起更為嚴(yán)重的肺外并發(fā)癥[8], 甚至導(dǎo)致不可逆的遠(yuǎn)期損傷[9-10]。鑒于此,探討MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制具有重要的臨床意義,現(xiàn)將MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制綜述如下。

1 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的作用機(jī)制

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是具有大環(huán)內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的一類藥物,其中紅霉素是最早被發(fā)現(xiàn)的天然大環(huán)內(nèi)酯類抗生素; 第2代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為紅霉素的半合成衍生物,包括阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素等; 第3代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是酮內(nèi)酯類藥物,以泰利霉素為代表[11]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的作用機(jī)制包括抗菌作用和非抗菌作用。

1.1 抗菌作用

對于每一個細(xì)胞而言,蛋白質(zhì)的合成都是不可或缺的。核糖體是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的場所,由30S小亞基與50S大亞基組成,其中30S小亞基介導(dǎo)信使核糖核酸(mRNA)密碼子與轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)反密碼子之間的相互作用,決定了翻譯的保真性; 50S大亞基有助于蛋白質(zhì)合成的起始、延長和終止,由23S rRNA、5S rRNA和蛋白質(zhì)組成; 23S rRNA又可以分為6個結(jié)構(gòu)域[12-13], 其中結(jié)構(gòu)域V與肽基轉(zhuǎn)移酶活性密切相關(guān)。核糖體通過啟動、延伸、終止和核糖體循環(huán)4個步驟引導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可以靶向作用于細(xì)菌核糖體的23S rRNA,干擾核糖體的功能,阻斷蛋白質(zhì)的合成,抑制細(xì)菌的生長,從而起到抗菌作用[14]。

氨基酸在核糖體50S大亞基的肽基轉(zhuǎn)移酶中心(PTC)處形成肽鍵,合成多肽鏈,再通過新生多肽的出口隧道(NPET)離開[11, 13]。既往研究[13, 15-16]認(rèn)為,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可以結(jié)合在NPET處,縮短隧道直徑,阻礙新生多肽的延長,對核糖體合成的所有蛋白質(zhì)均有抑制作用,但后期越來越多的研究[17-18]發(fā)現(xiàn),大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不是翻譯的全局抑制劑,而是翻譯的調(diào)節(jié)劑,可以防止特定氨基酸序列聚集,抑制肽鍵形成,選擇性地干擾蛋白質(zhì)的合成,這被稱為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的“上下文特異性”。此外有研究[19]認(rèn)為,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素還能夠誘導(dǎo)編碼錯誤,影響翻譯結(jié)果。

1.2 非抗菌作用

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的非抗菌作用主要包括抑制炎癥反應(yīng)、減少氣道黏液分泌和調(diào)節(jié)免疫平衡等。

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可以通過影響炎癥細(xì)胞、炎性因子、氣道上皮等而抑制過度和有害的炎癥反應(yīng)。中性粒細(xì)胞是主要的抗菌效應(yīng)細(xì)胞,也是炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié),通過脫顆粒、吞噬、產(chǎn)生活性氧以及釋放中性粒細(xì)胞胞外陷阱(NETs)殺滅病原菌,但嗜中性粒細(xì)胞在持續(xù)炎癥時可能會釋放過量的NETs,對宿主產(chǎn)生損傷[20-22]。研究[23]發(fā)現(xiàn),大環(huán)內(nèi)酯類藥物對中性粒細(xì)胞具有抑制或穩(wěn)定作用,可影響NETs釋放,表現(xiàn)為濃度依賴性。粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)等為促炎因子,對炎癥反應(yīng)的發(fā)生具有重要促進(jìn)作用,而大環(huán)內(nèi)酯類藥物可以抑制這些炎癥因子的表達(dá)[24-25]。阿奇霉素可以抑制多種促炎途徑,但并非完全抑制,而是以調(diào)節(jié)為主要特征。研究[26]發(fā)現(xiàn),阿奇霉素還可以保護(hù)呼吸道黏膜上皮,減輕氣道炎癥反應(yīng)所致?lián)p傷。

慢性氣道炎癥的重要特點之一是氣道黏液高分泌,大環(huán)內(nèi)酯類藥物可以通過調(diào)節(jié)氯離子通道、抑制杯狀細(xì)胞增生肥大與抑制黏液分泌基因表達(dá)而減輕氣道水分和黏液的高分泌狀態(tài)[27-28]。也有研究[29]認(rèn)為,大環(huán)內(nèi)酯類藥物是通過抑制鈉離子通道而減少氣道黏液分泌。

目前,關(guān)于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對肺部疾病(例如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張癥和肺囊性纖維化等[25, 30])免疫調(diào)節(jié)作用的研究已廣泛開展,其作用方式主要表現(xiàn)為抑制微生物黏附、阻斷毒性因子、抑制生物膜形成以及抑制細(xì)胞群體感應(yīng)[31],例如阿奇霉素能夠抑制銅綠假單胞菌對上皮細(xì)胞的黏附以及調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的pH值[32]。雖然大環(huán)內(nèi)酯類藥物似乎可以加快恢復(fù)免疫平衡的速度,并且可能對增強(qiáng)抗菌能力具有一定作用,但是長期使用可能導(dǎo)致耐藥以及其他損害。

2 MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制

2.1 藥物作用靶點的基因突變

轉(zhuǎn)肽酶環(huán)的突變: 自紅霉素被應(yīng)用于臨床后,相關(guān)耐藥菌株亦在臨床中相繼出現(xiàn),研究人員發(fā)現(xiàn)對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的細(xì)菌核糖體50S大亞基23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)的中心環(huán)上出現(xiàn)了特定位置的點突變。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素與核糖體的結(jié)合僅發(fā)生于50S大亞基23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)[33],因此當(dāng)該處某些結(jié)合位點發(fā)生突變時,可能會使大環(huán)內(nèi)酯類抗生素與細(xì)菌核糖體結(jié)合困難,無法有效阻止細(xì)菌蛋白合成,從而導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。1995年LUCIER T S等[34]對耐藥MP菌株進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),耐藥菌株的23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)中存在A2063G和A2064G突變位點,分別表現(xiàn)為對14元環(huán)和16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性,由此提出藥物作用靶點的基因突變可能是出現(xiàn)耐藥的原因。此后日本的一項研究[35]證實, 23S rRNA的基因突變與耐藥有關(guān),主要為2063和2064位點發(fā)生A到G的突變,少許菌株存在A到C的突變。目前研究[35-37]已發(fā)現(xiàn)的位點包括2062、2063、2064、2067、2611和2617位點,其中存在2063、2064位點突變的MP菌株對14元環(huán)、15元環(huán)和16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均有耐藥性,存在2067位點突變的菌株主要對16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥,而存在2611、2617位點突變的菌株更傾向于對14元環(huán)和15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥。23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)A2063和A2064位點的突變頻率最高,其產(chǎn)生的耐藥性也是最強(qiáng)的[7, 38], 是MP耐藥的主要標(biāo)志,亦是目前的研究重點。

核糖體蛋白的突變: 該突變主要表現(xiàn)為核糖體50S大亞基上L4蛋白和L22蛋白的突變。L22蛋白是50S大亞基的核心蛋白,可以與23S rRNA所有結(jié)構(gòu)域的RNA序列發(fā)生相互作用[12]。L4蛋白和L22蛋白共同成為50S大亞基的“支架”,參與NPET收縮位點的構(gòu)成,形成隧道的最窄部分,并對其具有調(diào)節(jié)作用[39]。兩者發(fā)生突變會引起隧道的變化,一方面使大環(huán)內(nèi)酯類藥物的結(jié)合位點遠(yuǎn)離該通道而表現(xiàn)為大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥,另一方面會影響新生多肽的延伸,使核糖體的翻譯率降低[40]。核糖體L4蛋白發(fā)生的突變主要表現(xiàn)為H70R、H70L的替換,在60～62位點處插入1～3個甘氨酸; L22蛋白出現(xiàn)連續(xù)3次的突變,最終導(dǎo)致泰利霉素的活性完全喪失,而其他大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、鏈霉素類抗生素和酮內(nèi)酯類抗生素的活性不變[36]。研究[41]發(fā)現(xiàn),臨床分離出的MP耐藥菌株與紅霉素體外誘導(dǎo)產(chǎn)生的MP耐藥菌株在核糖體蛋白L22處存在相同的基因突變,提示使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生MP耐藥菌株的可能性。中國學(xué)者[42]發(fā)現(xiàn),大多數(shù)耐藥菌株的L4蛋白和L22蛋白基因中存在C162A、A430G、T279C和T508C突變,但未能明確該突變與MP對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的相關(guān)性。也有研究[43-44]認(rèn)為L4蛋白和L22蛋白突變與MP對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性無關(guān),但會引起其他病原菌的耐藥,例如肺炎鏈球菌[45]、大腸桿菌[46]。因此,關(guān)于L4蛋白和L22蛋白對MP產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性的影響有待進(jìn)一步研究。

核糖體靶點的修飾: 該過程也稱為RNA的甲基化修飾,由Erm編碼的rRNA-甲基轉(zhuǎn)移酶可通過催化23S rRNA上A2058(大腸桿菌編號,對應(yīng)MP的A2063位點)位點發(fā)生二甲基化而引起核糖體靶點的變化,進(jìn)而使大環(huán)內(nèi)酯類藥物失去對MP的抑制作用[47-48]。ErmB是常見的引起甲基化的基因[49]。14元環(huán)和15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可誘導(dǎo)大多數(shù)Erm基因改變,但目前的研究對該基因的檢測樣本較少,未來需擴(kuò)大檢測量深入探討。

2.2 藥物主動外排增加

藥物的主動外排是耐藥的常見原因之一, MP可通過改變細(xì)胞膜的成分形成一種特殊的膜蛋白,并通過各種外排泵將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出,以降低胞內(nèi)藥物濃度,阻止其作用于靶部位,影響抗生素發(fā)揮抑菌作用。這種外排機(jī)制并非作用于特定藥物,而是對多種抗生素、多種作用機(jī)制均有效,在介導(dǎo)多藥耐藥方面具有重要意義。

對于原核生物而言,外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族主要有5個,分別為ATP結(jié)合盒(ABC)家族、主要易化因子超家族(MFS)、小多耐藥家族(SMR)、多重藥物與有毒化合物外排家族(MATE)和耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族(RND)[50]。其中, ABC家族依賴ATP水解供能,其余家族則依賴質(zhì)子泵功能。與支原體耐藥高度相關(guān)的是ABC家族,但目前相關(guān)研究較少。

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族是目前發(fā)現(xiàn)的最大的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族之一,幾乎存在于所有生物體中,依靠水解ATP提供能量,可將底物進(jìn)行跨膜運(yùn)輸,在多種生理過程中發(fā)揮重要作用,當(dāng)其底物為藥物時,會導(dǎo)致耐藥,因而也被稱為多藥耐藥蛋白。迄今為止,臨床已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,目前結(jié)構(gòu)已知的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均屬于Ⅳ型和Ⅴ型,Ⅳ型按基因型可分為ABCA～ABCH 8個亞家族,其中ABCB、ABCC亞家族與耐藥高度相關(guān)[51]。有研究[52]將利血平作為外排泵抑制劑,基于體外藥代動力學(xué)/藥效學(xué)分析探究托拉霉素對豬MP的抗菌作用,發(fā)現(xiàn)豬MP可通過調(diào)節(jié)不同的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)而達(dá)到降低藥物敏感性的目的。

由于在抗生素耐藥中具有重要作用,外排泵被作為有效的抗菌靶點,相關(guān)外排泵抑制劑的的開發(fā)將有助于改善微生物的耐藥情況。

2.3 藥物失活(抗生素酶解)

病原體能夠合成某些酶來修飾或降解抗生素,通過改變其結(jié)構(gòu)使其失去活性,這些酶包括β-內(nèi)酰胺酶、四環(huán)素羥化酶、酯酶、乙?；D(zhuǎn)移酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶等[53]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可被病原體合成的磷酸轉(zhuǎn)移酶、酯酶、甲酰還原酶和糖基轉(zhuǎn)移酶滅活。

對大環(huán)內(nèi)酯磷酸轉(zhuǎn)移酶(MPHs)的研究始于1989年, MPHs能夠?qū)TP或GTP的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至大環(huán)內(nèi)酯類底物上,取代大環(huán)內(nèi)酯的羥基,從而使藥物喪失活性。已被報道的MPHs類型包括MPH(A)～MPH(O)共15種亞型,其中MPH(A)編碼的磷酸基團(tuán)以GTP為磷酸基團(tuán)供體,會導(dǎo)致細(xì)菌對14元環(huán)和15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)生耐藥, MPH(B)編碼的磷酸基團(tuán)也偏向于以GTP作為供體,對14元環(huán)、15元環(huán)、16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均耐藥[54]。

紅霉素酯酶(EREs)能夠作用于大環(huán)內(nèi)酯酯鍵,切斷大環(huán)內(nèi)酯環(huán)。ERE(A)是EREs中最常見也是最早被發(fā)現(xiàn)的,ERE(C)是其同源相似物,兩者具有高度序列同源性和相似性,作用方式亦類似。研究[55]發(fā)現(xiàn),紅霉素能夠緊密結(jié)合在ERE(C)的活性中心上,兩者結(jié)合時該活性中心關(guān)閉,反應(yīng)結(jié)束后打開,為下一次催化反應(yīng)做準(zhǔn)備。ERE(A)和ERE(C)對14元環(huán)酮內(nèi)酯、15元環(huán)阿奇霉素和16元環(huán)交沙霉素、麥迪霉素發(fā)揮開環(huán)作用,而ERE(B)、ERE(D)對14元環(huán)非酮內(nèi)酯類抗生素和15元環(huán)阿奇霉素起效。

3 小結(jié)與展望

在MP對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥機(jī)制相關(guān)研究中, 23S rRNA結(jié)構(gòu)域V區(qū)基因突變是目前的研究熱點,眾多研究發(fā)現(xiàn)2063位點和2064位點突變率最高,被廣泛用于MP耐藥檢測,但耐藥基因突變與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性尚有待進(jìn)一步研究。研究[37]認(rèn)為,大環(huán)內(nèi)酯類藥物的使用可能誘導(dǎo)體內(nèi)MP耐藥性的出現(xiàn),但也可能機(jī)體本身感染的是耐藥菌株,只是由于數(shù)量少未被檢測出,此后使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物促進(jìn)了耐藥菌株的增殖,耐藥菌株成為優(yōu)勢菌株后才被檢測出。值得注意的是,體外耐藥性試驗與體內(nèi)實際耐藥情況存在一定差異,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣,目前尚未完全闡明,未來需要進(jìn)一步深入研究?？傊?耐藥菌株的出現(xiàn)會大大增加臨床治療的難度,在日常工作中,醫(yī)務(wù)人員應(yīng)規(guī)范化使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,以減少耐藥情況的發(fā)生,還應(yīng)盡早識別耐藥情況并及時調(diào)整與優(yōu)化治療方案,從而有效提高兒童MP感染的臨床療效。