李溢真 ，陳 勉 ，袁丹丹 ，牛林林 ，袁嘉麗，陳 磊 ， 馬學(xué)彬 ，王傳金 ，孔令斌 ，尉 茜 ，劉 飛 *

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 博士后科研工作站，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東省生物醫(yī)藥科學(xué)院有限公司，山東濟(jì)南 250101；3. 云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南省中醫(yī)藥分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500）

核桃（Juglansmandshurica）原產(chǎn)于東亞、北美和歐洲東南部，在我國種植廣泛[1]。核桃富含不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、多酚和礦物質(zhì)[2]，具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、降低膽固醇[6]、降低血壓和心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的作用[7]。核桃仁的脂質(zhì)含量高達(dá)74 %，可加工成核桃油，但下腳料核桃粕卻未被合理利用。據(jù)報(bào)道，核桃粕中約45 %為蛋白質(zhì)，含有18種氨基酸，其中8種必需氨基酸的含量能滿足人體需要[8]。生物活性多肽由2～20個(gè)氨基酸通過肽鍵連接而成，主要由動物或植物的食物蛋白，通過酶解、發(fā)酵或體內(nèi)體外消化獲得[9]。近年，有研究利用不同技術(shù)由核桃粕（蛋白質(zhì)）制備并分離純化具有抗氧化、抗高血壓、免疫活性和神經(jīng)活性的核桃肽。核桃肽作為一種新型核桃粕深加工產(chǎn)品，具有廣闊的應(yīng)用前景和市場潛力。

1 核桃肽的制備

從植物中制備活性多肽的方法有酶法、發(fā)酵法和化學(xué)法等。化學(xué)法通過酸或堿催化水解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生活性肽。反應(yīng)過程較難控制，環(huán)境友好性低，不適合產(chǎn)業(yè)化。目前，制備核桃肽主要采用酶法和發(fā)酵法。

1.1 酶法制備

常用的核桃蛋白水解酶有胃蛋白酶[10]、胰蛋白酶[11]、堿性蛋白酶[12]、木瓜蛋白酶[13]、中性蛋白酶[14]、復(fù)合蛋白酶（胰酶）[15]等。酶具有特異性、高效性、專一性等特點(diǎn)，酶的種類、pH、溫度、酶解時(shí)間、酶活性、料液比和酶底物比等條件對于酶法制備核桃肽至關(guān)重要。

利用堿性蛋白酶酶解核桃肽，酶解工藝不同，制備的效果也不同。弘子姍等[16]通過四因素三水平正交試驗(yàn)，加酶量為300 U/ml、pH 10、酶解溫度50 ℃、酶解3.5 h，多肽得率為80.34 %。張研彥等[17]酶解工藝條件為溫度50 ℃、pH 9、加酶量3.0 %、酶解時(shí)間5.0 h，水解度達(dá)22.63 %，多肽得率為88.24 %。張慶[18]等通過Box-Behnken中心組合試驗(yàn)表明，酶解最佳工藝條件為酶解溫度50.24 ℃、加酶量2.03 %、pH 7.13、酶解時(shí)間4.2 h，得到多肽質(zhì)量濃度為2.55 mg/ml。馬開創(chuàng)[19]利用酶水解結(jié)合堿溶酸沉法，酶解溫度50.0 ℃、pH 9、加酶量3.0 %、酶解時(shí)間5.0 h；在此條件下，水解度為22.63 %，多肽得率為88.24 %。木瓜蛋白酶、胃蛋白酶也常用來制備核桃肽。王攀等[13]研究表明，當(dāng)木瓜蛋白酶酶解溫度為60 ℃、酶解時(shí)間為3.5 h、底物濃度為2.5 g/100 ml、加酶量為6500 U/g、pH為6.5時(shí)，酶解物的抗氧化活性較好。侯雅坤[20]研究表明，木瓜蛋白酶酶解溫度50 ℃、料液比1:25、pH 6.0、加酶量3 %、酶解時(shí)間4 h，最終得水解度15.63 %酶解液；胃蛋白酶酶解溫度55 ℃、料液比1:20、pH 3.0、加酶量4 %、酶解時(shí)間4 h，最終得水解度15.72 %酶解液。

1.2 發(fā)酵法制備

通過發(fā)酵生產(chǎn)生物活性肽，不僅降低生產(chǎn)成本，還能在發(fā)酵過程中對蛋白質(zhì)原料起到解毒去苦作用。目前發(fā)酵方法有兩種：固體發(fā)酵和液體發(fā)酵。

劉瀟等[21]對比枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis10160）和黑曲霉（GIM3.452）固態(tài)發(fā)酵制備核桃粕多肽的生產(chǎn)性能，篩選最優(yōu)發(fā)酵條件參數(shù)，相對分子質(zhì)量（Mr）分布測定結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵制備核桃粕多肽產(chǎn)量高于黑曲霉。許典等[22]將核桃粕烘干脫脂制成核桃粕粉末后，用黑曲霉液態(tài)發(fā)酵制備核桃肽液，過濾去雜質(zhì)，冷凍干燥制得核桃肽粉。高瑞雄等[23]用納豆芽孢桿菌（Bacillussubtilsnatto）進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間84 h、底物質(zhì)量濃度0.08 g/ml、起始pH 8.0、接種量11 %、發(fā)酵溫度33 ℃時(shí)，核桃肽質(zhì)量濃度2.58 mg/ml，水解度37.5 %，均達(dá)最大值。賀瑩等[24]用乳酸菌液態(tài)發(fā)酵，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面綜合分析，得最優(yōu)工藝參數(shù)：超聲功率156 W、發(fā)酵溫度42.3 ℃、發(fā)酵時(shí)間9.9 h；在此條件下，核桃肽質(zhì)量濃度為2.88 mg/ml。王瑞珍[25]利用納豆芽孢桿菌分別與戴爾凱氏有孢圓酵母（Torlaspora delbrueckii）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）混合固態(tài)發(fā)酵核桃粕，發(fā)酵60 h后，多肽含量分別達(dá)到了2.49 %和4.03 %。

2 核桃肽的分離純化

通過酶法或發(fā)酵法制得的核桃蛋白水解物由不同Mr的活性肽、大分子蛋白、固體雜質(zhì)和可溶性雜質(zhì)組成。在研究和生產(chǎn)中，通過對目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化獲得活性成分含量更高、純度更高的核桃肽。膜分離技術(shù)（超濾法）和色譜技術(shù)廣泛用于核桃肽的分離和純化。

2.1 超濾法

核桃肽分離純化的第一步通常是超濾。 核桃蛋白水解液在壓力驅(qū)動下通過一定孔徑的超濾膜，核桃肽因其粒徑較小而能順利通過超濾膜，而Mr較大的不溶物、酶和蛋白質(zhì)則留在膜外，從而達(dá)到初步純化的目的[26]。 初步純化的核桃肽可依次通過不同孔徑的超濾膜，完成不同范圍Mr多肽的分離[27]。 然而，用超濾技術(shù)很難有效分離Mr很小或相似的多肽。 因此，在實(shí)際研究中，常與色譜技術(shù)相結(jié)合。

2.2 色譜法

核桃肽分離純化的第二步為色譜法，較常用的色譜方法有凝膠滲透色譜 （GPC）、離子交換色譜 （IEC）、高效液相色譜 （HPLC）、反相高效液相色譜法 （RP-HPLC）和金屬親和色譜法（MAC）[28]。

上述方法各有優(yōu)缺點(diǎn)， 單一的技術(shù)無法完全、高效的分離純化核桃肽。 因此，在實(shí)際操作過程中，需綜合考慮核桃肽的多種性質(zhì)，采用多種方法組合技術(shù)對其進(jìn)行分離純化，以達(dá)到更好的分離純化效果 。

3 核桃肽的生物活性

3.1 抗氧化活性

人體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基與人體衰老和多種疾病有關(guān)[29]。丁基羥基茴香醚（BHA）、二丁基羥基甲苯（BHT）等化學(xué)合成的抗氧化劑因其毒副作用，不利于人體健康[30]。李敏等[31]用超聲輔助提取核桃蛋白，用中性蛋白酶酶解核桃蛋白后制備的核桃肽提取液，對超氧陰離子自由基的清除率達(dá)58.27 %，對羥基自由基的清除率達(dá)71.92 %，對DPPH自由基的清除率達(dá)68.93 %，抗氧化效果顯著。王魯黔[32]利用堿性蛋白酶制備的核桃肽，其DPPH和ABTS自由基清除能力與維生素C相當(dāng)，具有較強(qiáng)的自由基清除能力。安傳相等[33]研究核桃肽清除·OH和DPPH自由基的IC50值分別為15.43和18.38 mg/ml，具有良好的抗氧化能力。慈傲特[34]制備的的核桃肽經(jīng)超濾分級，Mr＜3000的多肽有較好的體外抗氧化活性和體內(nèi)抗氧化活性，可提高小鼠血清、肝臟和脾臟中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性，降低氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量。該多肽進(jìn)一步分離純化后得到抗氧化肽LAYLQYTDFETR，其濃度為0.1 mg/ml時(shí)，DPPH自由基清除能力、·OH清除能力和ABTS自由基清除能力分別為56.25 %，47.42 %和67.67 %。

3.2 降血壓活性

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）是一種二肽基羧肽酶，在腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中起作用，導(dǎo)致血壓升高。ACE抑制肽可抑制ACE的活性，降低血管的張力、血容量和血壓，對調(diào)節(jié)人體血壓起重要作用。從食物蛋白中提取的ACE抑制肽可有效降低高血壓，但對正常血壓無影響，與降壓藥相比沒有副作用[36]。核桃粕酶解液中Mr小于10000的核桃肽對ACE抑制率較高，各組分IC50值表明，堿性蛋白酶酶解液和胃蛋白酶酶解液中Mr小于5000組分對ACE 抑制效果較突出[20]。以Alcalase酶酶解得到的核桃肽，色譜純化后ACE抑制率最高可達(dá)90.35 %，IC50值為0.158 mg/ml；通過液質(zhì)聯(lián)用（UPLC-MALDITOF/MS）鑒定出兩種ACE抑制肽：Leu-Tyr（LY）和Tyr-Leu-Ala（YLA），其化學(xué)合成肽IC50值分別為42和396 μmol/L，均有較強(qiáng)的ACE抑制效果[12]。利用胃蛋白酶酶解核桃粕，并分離制備抑制肽粗品，高效液相色譜篩選活性較高的ACE抑制肽粗品，其IC50達(dá)0.2633 mg/ml[37]。經(jīng)測序后，人工合成ACE抑制肽YVPHWNL，利用體外模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)檢測其活性，得到消化前后ACE抑制肽的IC50值分別是0.1357和0.1732 μmol/ml。賈靖霖[38]通用堿溶酸沉法提取蛋白質(zhì)，當(dāng)酶解液的濃度達(dá)到0.081 g/10 g時(shí)，對ACE的抑制作用最強(qiáng)，表明核桃蛋白酶解物有降血壓活性。周慧江[39]用Alcalase 2.4L制備核桃蛋白酶解物，ACE抑制率為76.58 %，成分研究表明，疏水性氨基酸含量較高，對ACE抑制率有重要作用；超濾分離得到MWCO組分為Mr1000透過液組分，ACE抑制活性最高達(dá)78.43 % ，IC50為2.055 mg/ml；對MWCO進(jìn)行脫鹽純化，ACE抑制率為80.73 %，IC50為1.65 mg/ml，降血壓活性顯著增強(qiáng)。

3.3 抗高尿酸活性

高尿酸血癥與高血壓、動脈粥樣硬化、胰島素抵抗和腎臟疾病密切相關(guān)，其發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量[40]。通常用于治療高尿酸血癥的藥物有一定副作用。近年，一些食物源性具有優(yōu)異黃嘌呤氧化酶抑制劑（XOI）活性的生物活性肽被廣泛關(guān)注。核桃粕水解物和脫酚核桃粕水解物（DWMH）均具有較好的XOI活性[41]，可有效降低高尿酸血癥大鼠的血清尿酸水平。從 DWMH 中成功分離純化出兩種新型抗高尿酸肽 WEPKDEX 和ADIYTE，Mr分別為 640.8和 710.7，IC50值分別為17.75和 19.01 mg/ml。Li 等[42]進(jìn)一步研究核桃活性肽在體外的XOI活性和作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)含色氨酸的活性肽能有效抑制黃嘌呤氧化酶，且隨色氨酸量增加，含色氨酸多肽的XOI活性也顯著增強(qiáng)。與別嘌呤醇類似，色氨酸與黃嘌呤氧化酶的關(guān)鍵殘基如Glu802、Leu873等有正向相互作用，從而有效抑制黃嘌呤氧化酶的活性。蘇國萬等[43]公開了一種從核桃粕中制備具有降尿酸作用的生物活性肽的方法，此法制得的靶標(biāo)生物活性肽可顯著降低大鼠血清肌酐水平，對大鼠腎功能有一定的保護(hù)作用，有顯著的降尿酸作用。

3.4 健腦益智活性

腦外傷、應(yīng)激創(chuàng)傷、精神發(fā)育遲滯、柯薩可夫綜合征、阿爾茨海默病和一氧化碳中毒等疾病，可誘發(fā)學(xué)習(xí)和記憶功能障礙?，F(xiàn)階段改善該障礙的藥物如多奈哌齊、鹽酸美金剛等均有明顯的副作用。核桃自古便有健腦益智作用的記載，近年大量研究表明，核桃肽能提高學(xué)習(xí)與記憶功能，有優(yōu)越的健腦益智活性。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[44]，核桃肽YVLLPSPK通過減輕氧化應(yīng)激緩解認(rèn)知缺陷。透射電鏡觀察小鼠海馬組織線粒體形態(tài)并進(jìn)行Western blot和免疫熒光分析，結(jié)果表明，YVLLPSPK通過NRF2/KEAP1/HO-1通路與PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬相關(guān)，改善了東莨菪堿所致認(rèn)知功能障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。核桃肽顯著提高學(xué)習(xí)記憶損傷小鼠模型血清中抗氧化酶（SOD 和 GSH-Px）含量，抑制腦組織中一氧化氮合酶（NOS）生成，顯著降低氧化產(chǎn)物（MDA 和 NO）含量，有效改善了小鼠對空間和有害刺激的學(xué)習(xí)記憶能力[45]。其中PW5 肽的抗 Aβ蛋白聚集活性最佳，具有預(yù)防阿爾茨海默病的潛質(zhì)。核桃肽MWHP（Mr＜3000）對記憶障礙的抑制作用研究表明[46]，小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮測試中，MWHP縮短東莨菪堿誘導(dǎo)小鼠到達(dá)終點(diǎn)時(shí)間，減少錯誤次數(shù)，增加到達(dá)終點(diǎn)的動物數(shù)量。 MWHP 還延長了被動回避響應(yīng)測試中的潛伏期，并減少錯誤率。結(jié)果表明，MWHP（Mr＜3000）可抑制東莨菪堿引起的記憶障礙；在機(jī)制研究中，MWHP（Mr＜3000）通過減少氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)功能、維持海馬CA3 錐體神經(jīng)元和增加腦組織中鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶 II 水平，改善記憶。核桃肽對過氧化氫（H2O2）與β淀粉樣多肽蛋白（Aβ25-35）誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12）細(xì)胞的損傷有良好的保護(hù)作用，其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制與提高PC12細(xì)胞的抗氧化能力有關(guān)；Morris水迷宮及電跳臺實(shí)驗(yàn)證實(shí)了核桃肽顯著改善Aβ25-35小鼠的認(rèn)知障礙和長期記憶的能力，具有健腦益智活性[47]。

4 結(jié)論與展望

核桃油作為優(yōu)質(zhì)功能油其年消費(fèi)量逐年增加，其副產(chǎn)品核桃粕的產(chǎn)量也在逐年增加。核桃粕是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，卻被視為廢物或低價(jià)值飼料、肥料等材料。核桃粕的經(jīng)濟(jì)利用不足在一定程度上阻礙了核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。有效利用核桃粕蛋白開發(fā)核桃蛋白產(chǎn)品，對于實(shí)現(xiàn)核桃綜合利用、提高副產(chǎn)品附加值、改變利用率低的現(xiàn)狀具有重要意義。