王喜英　趙輝　盧志宏　譚智勇　宋希娟

摘要：汞（Hg）是一種廣泛存在于土壤環(huán)境中的全球污染物之一，土壤微生物對(duì)汞脅迫的敏感性強(qiáng)于動(dòng)植物，可從微生物角度為蔬菜土壤汞污染生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。采用盆栽試驗(yàn)，應(yīng)用熒光定量PCR和高通量測(cè)序（Illumina HiSeq）技術(shù)，分析對(duì)照（CK）、低濃度汞（T1）、中濃度汞（T2）和高濃度汞（T3）脅迫處理下蔬菜土壤hgcA基因數(shù)量、細(xì)菌數(shù)量、真菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)變化特征。結(jié)果表明，T1處理增加細(xì)菌和hgcA基因數(shù)量，分別比CK、T2和T3提高了37.48%和 12.01%、57.31%和 19.37%、88.85%和14.82%。汞脅迫降低了真菌數(shù)量，其中T2處理降低最顯著。T3處理降低了土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)（豐富度和多樣性），T1處理降低了土壤真菌群落α多樣性指數(shù)（豐富度和多樣性）。土壤細(xì)菌門水平上，共獲得18個(gè)類群，其中放線菌門、變形菌門和綠彎菌門為優(yōu)勢(shì)類群，且在不同處理間差異極顯著。T2和T3處理分別顯著增加了變形菌門和放線菌門相對(duì)豐度。綠彎菌門相對(duì)豐度均表現(xiàn)隨汞濃度增加逐漸遞減的趨勢(shì)。土壤真菌門水平上，共獲得9個(gè)類群，其中子囊菌門、被孢菌門和擔(dān)子菌門為優(yōu)勢(shì)類群，其相對(duì)豐度共占真菌群落的94.64%。隨著汞濃度增加，子囊菌門相對(duì)豐度遞增，被孢菌門相對(duì)豐度遞減。擔(dān)子菌門在 T1 處理中最高（5.40%）。土壤pH值、銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量和全汞含量與土壤細(xì)菌數(shù)量、細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著關(guān)系。綜上，汞脅迫對(duì)蔬菜土壤hgcA基因、細(xì)菌和真菌數(shù)量有顯著影響，高汞脅迫造成了土壤細(xì)菌多樣性減少，細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生變化，而細(xì)菌群落對(duì)汞脅迫的敏感性強(qiáng)于真菌。

關(guān)鍵詞：汞；蔬菜土壤；hgcA基因；細(xì)菌；真菌；高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）14-0229-11

汞是一種危險(xiǎn)和持久性的環(huán)境污染物，可在大氣中轉(zhuǎn)化和長距離運(yùn)輸，最終在食物鏈中積累，危害人類身體健康。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，施用的化肥、石灰、污泥、肥料、除草劑和殺菌劑等，已經(jīng)成為土壤汞的重要來源之一［1］。汞在土壤中的毒性高度依賴于其化學(xué)種類，甲基汞化合物被認(rèn)為是毒性最大的物種［2］。土壤汞的甲基化主要通過環(huán)境中微生物轉(zhuǎn)化而成，hgcA作為汞甲基化生物標(biāo)志物，常用來評(píng)估土壤中潛在汞甲基化微生物［3］。土壤微生物可以快速響應(yīng)土壤環(huán)境脅迫變化，對(duì)土壤污染程度具有重要的指示作用［4-5］。研究表明，微生物對(duì)重金屬脅迫比植物更敏感［4］。關(guān)于汞對(duì)土壤微生物影響的研究很少，且更多集中在細(xì)菌群落［6-9］。在重金屬污染物脅迫下，微生物數(shù)量減少甚至死亡，或變成抗性優(yōu)勢(shì)群［10］。在重金屬污染土壤中，強(qiáng)耐受性微生物相對(duì)豐度增加，敏感微生物逐漸減少，土壤生態(tài)系統(tǒng)逐漸退化，并出現(xiàn)新物種［11］。Harris-Hellal等研究表明，在低汞濃度（0.1 mg/kg）條件下，土壤微生物群落變化不明顯，在高汞濃度（20 mg/kg）下土壤微生物群落功能多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［12］。Xie等研究發(fā)現(xiàn)，隨著汞濃度的增加，土壤中革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌比例逐漸增加［13］。Frossard等通過研究不同汞濃度（0.32、3.2、32 μg/g）對(duì)森林土壤細(xì)菌和真菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)最高汞濃度造成微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化［14］。Wang等研究表明，在高濃度汞處理下，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，微生物群落豐富度逐漸下降，而低濃度汞和中低濃度汞對(duì)土壤微生物群落均勻性影響不大［11］。Liu等評(píng)估汞污染對(duì)水稻土壤細(xì)菌多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)在中等汞濃度下細(xì)菌多樣性最高，表明中等干擾下生物多樣性達(dá)到峰值［15］。Rajapaksha等研究認(rèn)為真菌通常比細(xì)菌對(duì)重金屬更耐受［16］。然而，關(guān)于汞對(duì)土壤真菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的影響及其驅(qū)動(dòng)因素，尚缺乏深入的研究。

蔬菜已經(jīng)成為人們飲食必不可少的食物之一。汞成為菜地污染最嚴(yán)重的重金屬之一［17］。白菜在我國種植面積廣泛，對(duì)金屬富集作用強(qiáng)于其他非葉蔬菜，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類構(gòu)成了更大威脅［18］。目前，汞對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響更多集中在水稻和森林等植物［15，19］，同時(shí)，關(guān)于hgcA基因豐度的研究更多的是在厭氧環(huán)境［20-22］，但在蔬菜土壤等非厭氧環(huán)境中研究較少。因此，本研究采用盆栽試驗(yàn)，應(yīng)用熒光定量PCR和Miseq高通量測(cè)序，研究汞脅迫下蔬菜（白菜）土壤hgcA基因數(shù)量、細(xì)菌和真菌數(shù)量、群落組成及其環(huán)境驅(qū)動(dòng)因素，揭示土壤微生物對(duì)汞脅迫的響應(yīng)機(jī)制，從微生物角度為蔬菜汞脅迫的生態(tài)評(píng)估及生物預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

土壤樣品采集于貴州省銅仁市碧江區(qū)（109°13′12″E，27°47′30″N）典型菜地黃壤土。從表層0～20 cm收集新鮮土壤去除植物殘?bào)w礫石等，風(fēng)干后過2 mm篩用作盆栽試驗(yàn)。土壤基本理化性質(zhì)：pH值為6.56，有機(jī)碳含量為17.05 g/kg，全氮含量為1.63 g/kg，速效鉀含量為46.59 mg/kg，速效磷含量為16.92 mg/kg和全汞含量為0.331 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以HgCl2為汞源，設(shè)置4個(gè)汞濃度組（0、1、10、50 mg/kg），分別代表對(duì)照（CK）、低汞（T1）、中汞（T3）和高汞（T3）濃度污染土壤。每個(gè)處理重復(fù)3次，共計(jì)12個(gè)處理，將土壤樣品混合均勻后，裝入高21 cm、上口直徑21 cm 塑料盆中，盆栽用土 5 kg。為保持添加的汞趨于均勻穩(wěn)定且被土壤充分吸附，土壤老化時(shí)間為90 d，同時(shí)保持土壤含水量在60%。老化結(jié)束后，栽種試驗(yàn)于2021年4月在銅仁學(xué)院溫棚進(jìn)行，供試小白菜品種購自天津市宏豐蔬菜研究有限公司。每盆栽種10粒，白菜出苗后，每盆留苗4株。白菜生長期間管理水平一致，為避免水中汞進(jìn)入，均采用蒸餾水澆灌，同時(shí)保持土壤田間持水量為60%。在白菜生長60 d時(shí)，進(jìn)行植株和土壤樣品采集。白菜測(cè)量鮮質(zhì)量、株高和根長等指標(biāo)（表1）。土樣采集后，去除植物根系并過2 mm篩后，分為2份，1份用于土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量測(cè)定，其余風(fēng)干土壤用于全汞含量和理化指標(biāo)分析；1份-20? ℃冰箱保存用于土壤微生物分析。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 土壤全汞含量和理化指標(biāo)測(cè)定

土壤全汞（THg）含量采用王水水浴消化，原子熒光光度計(jì)測(cè)定［23］。參照鮑士旦的《土壤農(nóng)化分析》對(duì)土壤理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定［24］：采用電位法測(cè)定pH值；采用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定有機(jī)碳（SOC）含量；采用凱氏定氮法測(cè)定全氮（TN）含量；采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定銨態(tài)氮（NH+4-N）含量；采用酚二磺酸比色法測(cè)定硝態(tài)氮（NO-3-N）含量；采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定速效磷（AP）含量；采用乙酸銨提取-火焰光度法測(cè)定速效鉀（AK）含量。

1.3.2 土壤DNA提取

采用DNA提取試劑盒（Omega，GA，USA），按照試劑盒步驟進(jìn)行提取。用核酸定量儀（NanoDrop ND-2000）對(duì)DNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 土壤細(xì)菌、真菌、hgcA基因熒光定量PCR

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)對(duì)細(xì)菌（16S rRNA）、真菌（ITS）、hgcA基因豐度進(jìn)行分析，細(xì)菌16S rRNA基因的 V3-V4區(qū)擴(kuò)增引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAC-3′）與519R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）［19］。真菌ITS擴(kuò)增引物為ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）［25］；hgcAF（5′-GCCAACTACAAGMTGASCTWC-3′）與hgcAR（5′-CCSGCNGCRCACCAGACRTT-3′）［26］。每個(gè)PCR擴(kuò)增樣品重復(fù)3次，通過Minipre Kit獲得樣品質(zhì)粒，根據(jù)樣品質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算基因拷貝數(shù)。

1.3.4 高通量測(cè)序

采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。利用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)細(xì)菌16S rRNA、真菌ITS進(jìn)行測(cè)序（上海派森諾生物科技有限公司）。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后，在97%相似度水平下進(jìn)行OTU劃分和歸并。應(yīng)用RDP-classifier分別在16S rRNA和真菌ITS數(shù)據(jù)庫中對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類注釋。使用Mothur軟件分別對(duì)細(xì)菌和真菌群落的α多樣性指數(shù)進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)土壤全汞含量和理化性質(zhì)、hgcA基因數(shù)量、細(xì)菌和真菌數(shù)量、群落α多樣性指數(shù)、群落組成相對(duì)豐度進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)（P<0.05）；使用SPSS 21.0和R軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。使用R軟件進(jìn)行土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)聚類分析、主坐標(biāo)分析和冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤全汞含量和理化性質(zhì)

隨汞濃度增加，土壤全氮和銨態(tài)氮含量總體呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，其中CK處理的全氮含量分別與T1、T2和T3差異顯著；CK處理的銨態(tài)氮含量分別與T2和T3差異顯著。汞濃度增加，導(dǎo)致土壤pH值趨于中性且T3處理顯著高于其他處理。土壤有機(jī)碳含量在T1和T2處理均小于CK，但T3處理顯著增加。硝態(tài)氮含量隨汞濃度增加呈遞減趨勢(shì)，且CK分別與T2和T3之間差異顯著。土壤速效磷、速效鉀含量和C/N 比均是CK處理最高。土壤全汞含量大小順序?yàn)門3>T2>T1>CK，且T2和T3分別與T1和CK之間差異顯著（表2）。

2.2 土壤細(xì)菌、真菌和hgcA基因豐度

由圖1可知，細(xì)菌16S rRNA基因豐度在不同處理中差異顯著。不同汞濃度下細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)為1.35×109～2.54×109/g干土，且相互之間差異顯著。T1處理顯著增加了細(xì)菌數(shù)量，比CK提高了37.48%。T2和T3處理顯著低于CK，分別比CK降低了12.61%和19.79%。真菌ITS基因拷貝數(shù)為0.83×108～1.99×108/g干土。汞添加降低了真菌數(shù)量，CK處理中真菌ITS基因拷貝數(shù)高于其他處理，與T1處理差異不顯著，分別是T2和T3處理的2.39倍和1.48倍。各處理土壤中均檢測(cè)出hgcA基因，范圍為6.9×105～8.24×105/g干土。hgcA基因拷貝數(shù)隨汞濃度增加而有所不同，在T1處理最高，與CK差異不顯著，與T2和T3差異顯著。

為明確汞污染下蔬菜土壤細(xì)菌16S rRNA、真菌ITS和hgcA基因拷貝數(shù)差異的影響因素，分別與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析（圖2）。細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)分別與土壤pH值、銨態(tài)氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；與有機(jī)碳、速效磷和總汞含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；與硝態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。真菌ITS基因拷貝數(shù)與全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；與碳氮比呈顯著正相關(guān)。hgcA基因拷貝數(shù)與土壤pH值呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.3 土壤細(xì)菌和真菌測(cè)序結(jié)果及其α多樣性指數(shù)

由表3可知，土壤細(xì)菌和真菌覆蓋度均在0.98以上，測(cè)序結(jié)果可以真實(shí)反映各處理土壤微生物群落特征。土壤細(xì)菌和真菌中CK、T1、T2和T3獲得質(zhì)控后序列數(shù)分別為88 856（116 967）、83 655（110 772）、84 090（112 434）和88 335（113 698）。土壤細(xì)菌OTUs隨汞濃度增加逐漸減少。CK處理土壤細(xì)菌和真菌OTUs均最多，分別為3 781、622個(gè)；土壤細(xì)菌CK處理與T3之間差異顯著；土壤真菌CK處理分別與T1、T2和T3之間差異顯著。說明汞濃度增加改變了蔬菜土壤細(xì)菌和真菌OTUs水平上的物種組成，且土壤真菌變化更加明顯。

土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)均大于真菌。隨汞濃度增加，土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均表現(xiàn)出先增加后降低趨勢(shì)，表明低汞濃度有利于土壤細(xì)菌群落豐富度增加。 T3處理Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均顯著低于其他處理，說明土壤細(xì)菌豐富度受到高濃度汞污染的影響嚴(yán)重。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)變化趨勢(shì)相同，隨汞濃度增加逐漸降低；其中，CK、T1和T2處理之間變化不明顯，T3處理顯著低于其他處理。土壤真菌α多樣性指數(shù)均是T2處理最高，其中Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)是T1處理最小，且T2與CK和T3之間差異不明顯，T2與T1差異顯著。Simpson指數(shù)隨汞濃度增加表現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，且T2與CK差異顯著。可知，低汞脅迫對(duì)土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度有促進(jìn)作用，對(duì)土壤真菌群落的多樣性和豐富度有抑制作用。

相關(guān)性分析結(jié)果（圖2）表明，土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別與土壤pH值、銨態(tài)氮和總汞含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與硝態(tài)氮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與速效鉀含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)與有機(jī)碳含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。Chao1指數(shù)與速效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別與有機(jī)碳含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。土壤真菌Chao1指數(shù)與速效磷含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Simpson指數(shù)與碳氮比呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.4 土壤細(xì)菌和真菌群落組成

通過對(duì)汞脅迫下蔬菜土壤樣品OTUs進(jìn)行歸類，土壤細(xì)菌得到18個(gè)門、50個(gè)綱、114個(gè)目、172個(gè)科和262個(gè)屬。土壤真菌得到9個(gè)門、20個(gè)綱、47個(gè)目、91個(gè)科和139個(gè)屬。在細(xì)菌門水平上，將平均相對(duì)豐度<1%類群歸類為其他，得到6個(gè)類群（圖3-a），分別為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和厚壁菌門（Firmicutes），其中放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門在不同處理之間有極顯著差異（P<0.01）。放線菌門（59.56%～68.99%）、變形菌門（16.67%～19.43%）和綠彎菌門（3.95%～7.22%）為優(yōu)勢(shì)菌門，占細(xì)菌總類群相對(duì)豐度的84.96%～89.62%。放線菌門相對(duì)豐度在T3處理中最高，分別是CK、T1和T2的1.13倍、1.16倍和1.15倍。變形菌門相對(duì)豐度隨汞濃度增加表現(xiàn)先增加后減少，在T2處理最高（19.43%），T3處理最低（16.67%）。綠彎菌門和酸桿菌門相對(duì)豐度均表現(xiàn)出隨汞濃度增加逐漸遞減，在T3處理最低（3.95%和3.01%），分別比CK降低了45.21%和50.2%。芽單胞菌門在T1處理最高（4.43%），T3處理最低（2.92%）。厚壁菌門相對(duì)豐度在不同處理中差異不顯著，CK最低（1.91%），T2處理最高（2.51%）。在屬水平上，得到相對(duì)豐度在1%以上的10個(gè)類群（圖3-c），分別為鏈絲菌屬（Streptomyces）、小單孢菌屬（Micromonospora）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）、Subgroup_6、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、67-14、KD4-96、Gaiella、濱田氏菌屬（Hamadaea）和Marmoricola。其中，鏈絲菌屬、小單孢菌屬和類諾卡氏菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度分別為2.42%～27.42%、5.72%～8.17%和4%～6.6%。隨汞濃度增加，鏈絲菌屬相對(duì)豐度顯著增加，T1、T2和T3分別是CK的1.31倍、3.85倍和11.44倍。小單孢菌屬相對(duì)豐度在T3處理顯著高于其他處理，比CK增加了20.86%。汞添加降低了類諾卡氏菌屬相對(duì)豐度，其中T3處理降低幅度最大，且與其他處理之間差異極顯著。

在門水平上，真菌群落相對(duì)豐度達(dá)到1%以上的類群有3個(gè)，分別為子囊菌門（Ascomycota，平均相對(duì)豐度80.94%）、被孢菌門（Mortierellomycota，平均相對(duì)豐度10.33%）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota，平均相對(duì)豐度3.37%）（圖3-b）。隨汞濃度增加，子囊菌門相對(duì)豐度遞增，被孢菌門相對(duì)豐度遞減。子囊菌門和被孢菌門在不同汞濃度處理中差異極顯著，子囊菌門相對(duì)豐度在T3處理最高（91.92%），分別比CK、T1和T2增加了28.7%、17.22%和12.09%。被孢菌門相對(duì)豐度在T1、T2和T3處理中，分別比CK減少了30.37%、42.04%和98.51%。擔(dān)子菌門相對(duì)豐度隨汞濃度增加表現(xiàn)為先增加后減少趨勢(shì)，大小順序?yàn)門1>CK>T2>T3。屬水平上，相對(duì)豐度大于1%的類群為鐮刀菌屬（Fusarium）、被孢霉屬（Mortierella）、扁孔腔菌屬（Lophiostoma）、螺旋聚孢霉屬（Clonostachys）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）和圓孢霉屬（Staphylotrichum），且不同處理間差異顯著（圖3-d）。其中，鐮刀菌屬和被孢霉屬為優(yōu)勢(shì)類群，相對(duì)豐度分別為12.78%～33.26%和0.27%～18.94%。鐮刀菌屬相對(duì)豐度隨汞濃度增加顯著遞增，T1、T2和T3分別比CK增加了30.75%、46.32%和162.25%。被孢霉屬相對(duì)豐度在汞添加處理中均小于CK（18.94%），T3處理最低（0.27%）。汞添加顯著增加了扁孔腔菌屬和螺旋聚孢霉屬相對(duì)豐度，其中扁孔腔菌屬相對(duì)豐度在T2處理最高（6.33%），螺旋聚孢霉屬在T3處理最高（7.31%）。汞添加降低了小不整球殼屬和圓孢霉屬相對(duì)豐度，汞濃度越高抑制作用越強(qiáng)。

2.5 土壤細(xì)菌和真菌群落的層次聚類和PCoA分析

汞脅迫下土壤細(xì)菌和真菌的層次聚類樹如圖4所示。不同處理土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。土壤細(xì)菌和真菌除T1外，其他處理3個(gè)重復(fù)聚類在一起。其中，CK和T1處理之間距離較近。T3與CK和T1處理之間距離較遠(yuǎn)。PCoA分析進(jìn)一步證實(shí)了汞脅迫處理土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。PCoA1和PCoA2對(duì)細(xì)菌和真菌群落分別解釋了總變異的43.5%（24.8%）和14.3%（23.5%）（圖5）。CK、T1和T2距離較近，說明土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。T3和其他處理在不同象限內(nèi)，T3與CK、T1和T2相距較遠(yuǎn)，說明高濃度汞脅迫對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落影響最大。

2.6 土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

本研究在土壤細(xì)菌和真菌屬水平上與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行了冗余分析（圖6）。RDA1和RDA2分別解釋了土壤細(xì)菌群落變異的93.52%和3.09%，前兩軸解釋了總變異的96.61%。RDA1和RDA2分別解釋了土壤真菌群落變異的82.13%和7.55%，前兩軸解釋了總變異的89.68%。由表4可知，土壤pH值、銨態(tài)氮含量、硝態(tài)氮含量和全汞含量對(duì)細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)有極顯著影響，有機(jī)碳含量對(duì)細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，全氮含量對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)有極顯著影響， 速效鉀含量對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。

3 討論與結(jié)論

3.1 汞脅迫對(duì)蔬菜土壤細(xì)菌、真菌和hgcA基因豐度的影響

重金屬污染由于降解性低，給土壤帶來了嚴(yán)重的環(huán)境惡化問題，通過功能干擾、蛋白質(zhì)變性或細(xì)胞膜破壞影響微生物生長和代謝，抑制微生物活性，導(dǎo)致土壤微生物總量下降［8］。

本研究土壤細(xì)菌數(shù)量（CK除外）隨汞濃度增加表現(xiàn)遞減趨勢(shì)，與Zheng等研究結(jié)果［19］一致。T1處理土壤細(xì)菌數(shù)量顯著高于其他處理，可能由于低濃度汞處理蔬菜土壤pH值較低，降低了汞的生物利用度和甲基化，對(duì)土壤鉀和磷的釋放有促進(jìn)作用，有利于植物生長［27-28］。植物長勢(shì)好，根系分泌物多，可以促進(jìn)細(xì)菌數(shù)量增加［29］。Frossard等研究也認(rèn)為，小于3.2 mg/kg的汞濃度對(duì)土壤細(xì)菌數(shù)量沒有顯著抑制作用［14］。本研究T1處理的汞濃度較低，對(duì)植物生長和土壤細(xì)菌還未起到抑制作用，說明該汞濃度未超過閾值。相關(guān)性分析表明，土壤細(xì)菌數(shù)量與總汞含量呈負(fù)相關(guān)，Hg污染抑制微生物生長，與Liu等研究結(jié)果［30］一致。然而，Liu等研究認(rèn)為，長期來看，水稻土壤細(xì)菌數(shù)量與總汞含量沒有顯著相關(guān)性［15］，這可能與本研究開展的是短期汞脅迫試驗(yàn)有關(guān)。本研究中，隨汞濃度增加土壤真菌數(shù)量下降，這與許多重金污染下所得結(jié)果［14，31］一致。汞污染下細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)高于真菌，有可能細(xì)菌與真菌競爭營養(yǎng)，從而對(duì)真菌群落產(chǎn)生更大生存壓力［31］。T3處理真菌數(shù)量高于T2，說明真菌對(duì)高濃度汞污染具有更大抵抗力。Zheng等研究也認(rèn)為，許多真菌可以忍受高濃度汞污染，通過排出有機(jī)酸與土壤中金屬形成復(fù)合物，從而降低重金屬毒性［19］。

本研究hgcA基因基因拷貝數(shù)為 6.9×105～8.24×105/g干土，遠(yuǎn)低于周心勸等關(guān)于水稻田的研究結(jié)果［20］，可能與hgcA基因主要是在厭氧條件下形成有關(guān)?？偣颗chgcA豐度沒有顯著相關(guān)，與Liu等研究結(jié)果［32］一致，但與Vishnivetskaya等研究結(jié)果［33］不一致，這可能與取樣環(huán)境、植物類型和土壤類型等因素有關(guān)。T1處理hgcA基因數(shù)量高于其他處理，可能與土壤pH值有關(guān)，由于pH值直接影響汞在土壤中的溶解度。Liu等研究認(rèn)為，在堿性環(huán)境中可能不適合含汞甲基化hgcA基因的微生物存活，當(dāng)土壤處于酸性條件下時(shí)，汞的甲基化程度增強(qiáng)，導(dǎo)致汞的生物利用度增加，然而，當(dāng)pH值過低時(shí)，大量腐殖酸會(huì)影響汞的生物利用度或甲基供體轉(zhuǎn)移，降低汞的甲基化［3］。

3.2 汞脅迫對(duì)蔬菜土壤細(xì)菌和真菌多樣性的影響

微生物多樣性是評(píng)估土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)［27］。本研究土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)（CK除外）均隨汞含量增加而減少，與Vishnivetskaya等研究結(jié)果［33］一致。Crognale等研究認(rèn)為，短期重金屬污染對(duì)土壤微生物數(shù)量、豐富度和多樣性產(chǎn)生負(fù)面影響［34］。土壤細(xì)菌Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在低汞濃度中最高，然后隨汞濃度增加逐漸下降，表明土壤微生物群落豐富度逐漸下降，豐富度受到高汞濃度影響嚴(yán)重。這種趨勢(shì)很可能是由于低濃度汞的存在刺激抗金屬物種生長，汞濃度增加導(dǎo)致許多敏感物種死亡，最終導(dǎo)致微生物遺傳多樣性下降［35］。土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在對(duì)照、低汞濃度和中汞濃度下變化不顯著，但高汞濃度下明顯改變了Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，與Liu等研究結(jié)果［15］相似。這種原因可能是隨汞濃度增加，不能適應(yīng)高汞濃度的微生物數(shù)量逐漸減少甚至死亡。

Rieder等研究表明，真菌比細(xì)菌對(duì)長期重金屬污染更有抵抗力，真菌對(duì)汞的反應(yīng)不如細(xì)菌強(qiáng)烈［36］。本研究中，隨汞濃度增加，真菌Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)表現(xiàn)先增后減少趨勢(shì)，與Frossard等研究結(jié)果［37］一致。該結(jié)果也支持了中度干擾假說，表明中等汞濃度可提高真菌多樣性［38］。前人研究認(rèn)為，汞污染通過影響土壤理化性質(zhì)間接影響真菌多樣性，土壤理化性質(zhì)是土壤微生物多樣性的重要驅(qū)動(dòng)因素，汞在調(diào)節(jié)土壤真菌豐度和多樣性方面具有重要性［39］。Durand等研究表明，在受汞污染脅迫的礦區(qū)，土壤真菌多樣性與汞濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［40］。然而，本研究中沒有發(fā)現(xiàn)汞對(duì)真菌多樣性有顯著影響，與Frossard等研究結(jié)果［37］一致。目前，關(guān)于這一現(xiàn)象的原因尚未明確，可能是由于土壤真菌群落對(duì)汞的預(yù)適應(yīng)性，真菌耐汞類群的改變或者低汞生物利用導(dǎo)致缺乏汞毒性［41］。

3.3 汞脅迫對(duì)蔬菜土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

Wang等研究認(rèn)為，重金屬汞進(jìn)入土壤將對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響［11］。本研究結(jié)果也表明，汞導(dǎo)致土壤細(xì)菌和真菌群落組成發(fā)生變化，存在劑量相關(guān)效應(yīng)，這與之前研究結(jié)果［19，42］一致。土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可能因重金屬汞添加引起土壤金屬敏感生物數(shù)量減少，耐抗微生物數(shù)量增加，導(dǎo)致微生物群落組成發(fā)生變化［43］。

本研究中，細(xì)菌群落中放線菌門、變形菌門和綠彎菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，與前人研究結(jié)果［19，44］一致。放線菌門在動(dòng)植物殘?bào)w分解過程中起著重要作用，有利于土壤氮轉(zhuǎn)化，可產(chǎn)生抗生素減少病原微生物侵害［45］。放線菌門相對(duì)豐度在高汞濃度下顯著增加，說明放線菌門對(duì)汞污染具有耐受性。相關(guān)研究已經(jīng)證明放線菌門對(duì)重金屬污染具有耐受性［46］，可能與阻力機(jī)制及沉淀-溶解平衡有關(guān)，限制了土壤游離金屬離子的動(dòng)態(tài)變化［47］。Barkay等研究認(rèn)為，放線菌門對(duì)汞具有耐受性，主要與其含有耐汞基因（merA）有關(guān)［48］。變形菌門具有固氮、代謝和利用光合作用存儲(chǔ)能量的作用［49］。本研究中，變形菌門相對(duì)豐度在中等汞濃度最高，高汞濃度最低，可能與中度干擾或應(yīng)激假說有關(guān)［15］。由此可知，變形菌門對(duì)汞具有一定耐受性，當(dāng)汞濃度超過一定閾值，將導(dǎo)致其數(shù)量減少或者死亡。變形菌門的耐受能力可能有3個(gè)方面原因，一是汞可以被吸附在微生物活細(xì)胞或死細(xì)胞中，從而降低有效汞對(duì)其影響［43］；二是變形菌門含有merA基因，merA編碼汞還原酶，可將汞離子還原為元素汞［50］；三是通過外排系統(tǒng)擠出重金屬離子、通過含硫醇分子進(jìn)行分離以及還原為具有降低毒性的氧化狀態(tài)［51］。綠彎菌門含有綠色色素，具有降解纖維素作用，與地上生物量呈顯著正相關(guān)關(guān)系［52］。本研究綠彎菌門相對(duì)豐度隨汞濃度增加顯著降低，一方面可能由于地上蔬菜生物量總體隨汞濃度增加逐漸減少，土壤中纖維素減少，不利于綠彎菌門生長。另一方面，綠彎菌門中沒有脂質(zhì)外膜和專門的分泌系統(tǒng)，對(duì)汞較敏感，其生長易受汞抑制［53］。

op de Beeck等研究表明，重金屬污染對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化具有重要影響［54］。本研究子囊菌門、被孢菌門和擔(dān)子菌門為優(yōu)勢(shì)類群，與Zhang等研究結(jié)果［55］相似。子囊菌門被認(rèn)為是降解木質(zhì)纖維素的重要真菌，廣泛存在于農(nóng)田土壤。子囊菌門相對(duì)豐富隨汞脅迫加劇呈增加趨勢(shì)，說明對(duì)高濃度汞污染具有更大耐受性，可能由于子囊菌為腐生菌，能降解土壤有機(jī)質(zhì)［56］，在高汞濃度脅迫下土壤有機(jī)碳最多，從而有利于子囊菌門相對(duì)豐度增加。目前，關(guān)于子囊菌門對(duì)重金屬污染的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制研究較少。隨汞濃度增加，被孢菌門和擔(dān)子菌門相對(duì)豐度總體表現(xiàn)遞減趨勢(shì)。擔(dān)子菌門能適應(yīng)較低養(yǎng)分環(huán)境，具有降解纖維素和木質(zhì)素的能力［57］。汞濃度增加，土壤全氮和銨態(tài)氮等養(yǎng)分增加，蔬菜生物量減少，蔬菜殘?bào)w及木質(zhì)素較少，不利于擔(dān)子菌門生長。在重金屬脅迫下，擔(dān)子菌群酶活性受到抑制［58］，也導(dǎo)致?lián)泳T相對(duì)豐度減少。

本研究通過RDA分析探討了土壤細(xì)菌和真菌群落與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性，揭示了微生物群落受特定土壤理化性質(zhì)的影響。土壤細(xì)菌和真菌群落與土壤pH值、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和總汞含量有顯著相關(guān)性。許多研究也表明，土壤pH值和重金屬含量對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響［31，59］。土壤pH值通過影響金屬離子溶解度和流動(dòng)性在土壤重金屬的積累中起著重要作用，決定土壤養(yǎng)分的生物有效性，同時(shí)H+與溶解金屬之間的配體競爭，導(dǎo)致重金屬遷移率和生物利用度增加［45］。Wen等研究表明，模擬酸雨可增加土壤溶液中重金屬可溶性含量，增加重金屬的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)［60］。一些敏感和耐受性菌群豐度隨土壤pH值增加而變化，土壤pH值通過影響重金屬形態(tài)和可用性，從而導(dǎo)致生態(tài)毒性的變化［61］。

低汞濃度處理提高了土壤細(xì)菌和hgcA基因數(shù)量。高汞濃度脅迫顯著降低了土壤細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)。汞濃度越高，對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響越大，真菌對(duì)汞的敏感性弱于細(xì)菌。放線菌門和子囊菌門對(duì)汞污染具有耐受性，綠彎菌門和被孢菌門對(duì)汞污染敏感。低汞濃度對(duì)擔(dān)子菌門有促進(jìn)作用，中等汞濃度對(duì)變形菌門有促進(jìn)作用。土壤pH值、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和汞含量是影響土壤細(xì)菌和真菌群落變化的主要因素。然而，關(guān)于汞對(duì)蔬菜土壤細(xì)菌和真菌群落的影響機(jī)制需開展長期的定點(diǎn)和多蔬菜種類研究。

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收稿日期：2022-07-20

基金項(xiàng)目：貴州省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目（編號(hào)：黔教合KY字［2020］163）；銅仁學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金（編號(hào)：tyxyDH2002、tyxyDH1603）；綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（編號(hào)：黔教合KY字［2019］036）；銅仁學(xué)院碩士點(diǎn)及學(xué)科建設(shè)研究子項(xiàng)目（編號(hào)：trxyxwdxm-027）；貴州省科技項(xiàng)目（編號(hào)：黔科合SY字［2014］3035）。

作者簡介：王喜英（1981—），女，河南汝南人，碩士，講師，主要從事生物化學(xué)及生物信息學(xué)分析。E-mail：810315971@qq.com。

通信作者：趙 輝，博士，教授，主要從事土壤微生態(tài)及作物栽培研究。E-mail：yancao504@163.com。