楊利艷，李芳，蒲哲，王創(chuàng)云，秦麗霞*

（1.山西師范大學生命科學學院，太原 030031；2.山西農業(yè)大學農學院，太原 030031）

棉花是我國重要的經濟作物之一，在國民經濟中占有重要地位。陸地棉（Gossypium hirsutum）是棉花的主要栽培種[1-2]。棉花在整個生育期經常遭到各種蟲害的威脅，導致棉花產量和纖維品質嚴重下降。我國棉田害蟲有300 多種，主要蟲害有30 余種[3]，其中棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）是蕾鈴期的主要害蟲，加強棉鈴蟲的防治對確保棉花豐收至關重要[4]。我國科研工作者已成功利用基因工程手段創(chuàng)制了多個轉蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis,Bt）基因抗蟲棉品種（系），大大降低了棉鈴蟲對棉花的危害。但長期使用單一或少數幾個抗蟲基因必然會加速害蟲產生抗性。近年來，為有效防治蟲害，減輕農業(yè)生產經濟損失，化學農藥的投入和使用量不斷增加，造成嚴重的田間污染，同時導致害蟲產生更強的耐藥性，進一步提高了蟲害防治工作的難度并且增加了投入費用。因此，挖掘更多的抗蟲基因對于提高作物的抗蟲性及延緩害蟲抗性的產生具有重要意義。

在植物體內，S- 腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase, SAMS）作為輔助因子參與細胞內的多種生理生化反應。SAMS是主要的甲基供體，參與蛋白質、核酸、多糖和脂肪酸的轉甲基反應；SAMS 參與植物細胞專一性的代謝途徑，是植物激素乙烯生物合成的前體物質[5]，也是細胞壁成分相關的苯丙烷合成代謝所必需的。植物體內存在多個SAMS 編碼基因[6]。前人研究表明，陸地棉SAMS基因家族有16 個成員，其啟動子區(qū)存在多種參與防御和應激反應的順式作用元件[7]。因此，陸地棉SAMS基因可能在多種脅迫響應中發(fā)揮重要作用。石蒜（Lycoris radiata）SAMS基因的轉錄水平在鹽脅迫下明顯提高，過表達SAMS基因可提高大腸桿菌（Escherichia coli）的耐鹽性[8]。大豆（Glycine max）SAMS家族基因在澇害脅迫的早期表達量降低，在干旱脅迫的后期則上調表達[9]。陸地棉在接種黃萎病菌后，SAMS基因的表達量逐漸增加，表明其可能在抗黃萎病防衛(wèi)反應中發(fā)揮重要作用[10]。利馬豆（Phaseolus lunatus）在受到二斑葉蛾侵襲或茉莉酸處理后，葉片中SAMS的表達量均增加，推測SAMS可能通過茉莉酸途徑在蟲害響應中發(fā)揮作用[11]。斜紋夜蛾（Spodoptera litura）幼蟲取食轉GmSAMS1煙草葉片后，幼蟲的相對生長率顯著降低，表明大豆GmSAMS1基因增強了轉基因煙草對斜紋夜蛾的抗性[12]。

活性氧（reactive oxygen species,ROS）是植物代謝的副產物。在正常情況下，植物體內ROS 的產生和清除受抗氧化系統(tǒng)的精細調控而處于動態(tài)平衡。當植物遇到非生物或生物脅迫時，植物體內ROS 的動態(tài)平衡被打破，導致植物體內積累大量的ROS。研究表明，以H2O2為代表的ROS在植物對非生物及生物脅迫的響應中起著重要作用[13-14]。

本課題組前期研究發(fā)現，大芻草（Zea maysssp.parviglumis）被粘蟲 （Mythimna separateWalker）取食后，葉片中BtSAMS1的表達量較取食前增加了12.17 倍，由此我們推測BtSAMS1基因可能參與植物的抗蟲防御響應[15-16]。基于此，本研究以陸地棉品種R15 為材料，分析了Bt SAMS1的同源基因GhSAMS在棉鈴蟲取食后的表達模式，并利用病毒誘導的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）技術抑制GhSAMS的表達，分析了沉默植株在受到棉鈴蟲取食后的表現，探究GhSAMS基因的抗蟲功能，為提高棉花對棉鈴蟲的抗性提供候選基因資源，為延緩棉鈴蟲抗性的發(fā)生奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料及生長條件。供試棉花材料為常規(guī)陸地棉品系R15，由棉花生物育種與綜合利用全國重點實驗室 （原棉花生物學國家重點實驗室）郝福順教授提供。將棉花種子用98%（質量分數）的濃硫酸脫絨，在清水中多次洗滌，用清水浸泡催芽12 h 后，種植于人工氣候室，培養(yǎng)條件為：溫度（26±1）℃，光周期為16 h 光照/8 h 黑暗，相對濕度為70%。待子葉完全展平，挑選長勢一致的植株用于后續(xù)實驗。

1.1.2載體和菌株。pTRV1 輔助質粒由山西師范大學李柯老師惠贈，pNC:TRV2 質粒由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所言普老師提供，pTRV2::GhCLA1重組質粒由棉花生物育種與綜合利用全國重點實驗室郝福順教授提供。大腸桿菌DH5α 和農桿菌GV3101 為本實驗室保存。

1.1.3棉鈴蟲。本研究所用棉鈴蟲為購自河南全應商貿有限公司（河南鄭州）的人工飼養(yǎng)品系。將棉鈴蟲在人工氣候培養(yǎng)室培養(yǎng)至2 齡初期用于試驗。飼養(yǎng)條件同1.1.1。

1.2 GhSAMS 的表達模式

當棉花幼苗長出2 片真葉時，選取長勢一致的12 株棉花，每株放3 頭2 齡初期的棉鈴蟲，取食24 h、48 h、72 h 后，對有明顯蟲食痕跡的棉花葉片進行取材，以未取食葉片為對照（取食0 h），置于液氮中速凍，于—80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗。

提取棉花葉片總RNA，并反轉錄合成第一鏈cDNA。棉花總RNA 提取試劑盒及反轉錄試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司，具體操作步驟參考試劑盒說明書。采用Perfect-StartTMGreen qPCR SuperMix（＋DyeⅠ/＋DyeⅡ）試劑盒（北京全式金生物技術有限公司），以棉花GhUBQ7為內參基因，進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）。引物序列見表1。每個樣本進行3 次重復。使用2—ΔΔCt 法計算目的基因的相對表達量。

表1 本研究中所使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3 pTRV2::GhSAMS 載體構建

以實驗室前期篩選到的對粘蟲取食強烈響應的BtSAMS1基因（基因ID:MK894430.1）為查詢序列，在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）中進行Blastp 比對。在Conserved Domain（CDD）[17]數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）中查詢鑒定棉花SAMS 蛋白保守結構域，去除無SAMS 典型保守結構域的蛋白序列，獲得陸地棉SAMS基因204 bp 的保守序列。

提取棉花幼苗葉片總RNA，并反轉錄合成第一鏈cDNA，方法同1.2。根據SAMS基因保守序列，使用SnapGene 軟件設計引物，并在上下游引物的5’端分別加上通用接頭序列，引物序列見表1。以cDNA 為模板，進行PCR 擴增，獲得目的片段，所用試劑盒為2×TransStartFastPfu PCR SuperMix（北京全式金生物技術有限公司）。PCR 反應體系為：cDNA 模板1 μL、2×TransTartFastPfu PCR SuperMix 25 μL、上下游引物各1 μL，ddH2O 補足到50 μL。PCR 反應程序為：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸15 s；72 ℃延伸5 min。將純化后的目的片段插入沉默載體pNC:TRV2 中，并轉化至DH5α 菌株，經測序驗證后得到重組載體pTRV2::GhSAMS。

1.4 重組載體的轉化和農桿菌侵染

將pTRV1、pNC:TRV2 空載體、重組載體pTRV2::GhSAMS和pTRV2::GhCLA1通過凍融法分別轉化至農桿菌GV3101。挑取單菌落進行PCR 檢測，將陽性單克隆在LB 液體培養(yǎng)基（含50 μg·mL—1卡那霉素和20 μg·mL—1利福平）中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28 ℃、200 r·min—1，待OD600為1.5 時收集菌體。使用農桿菌侵染液（含10 mmol·L—1MgCl2、10mmol·L—12-嗎啉乙磺酸和200μmol·L—1乙酰丁香酮）進行重懸至菌液OD600為1.5 左右，于室溫下黑暗靜置4 h 后，將pTRV1 的農桿菌重懸液分別與pTRV2 空載體（CK）、pTRV2::GhSAMS和pTRV2::GhCLA1的農桿菌重懸液按照1∶1 體積比混勻[18]。選取子葉完全展開、真葉還未長出的棉花幼苗，使用無針頭的注射器，在棉花子葉背面按壓注射，葉片的浸染面積需達到70%以上。2 周后觀察pTRV2::GhCLA1植株的白化現象。

1.5 GhSAMS 基因沉默效率檢測

以棉花內參基因GhUBQ7為參照，分別提取侵染2 周后的CK 植株、pTRV2::GhSAMS植株和同一時期未進行侵染處理的野生型（wild type,WT）植株的葉片總RNA。以反轉錄后的cDNA為模板，采用半定量反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）檢測GhSAMS基因的沉默效率。

1.6 棉鈴蟲生長發(fā)育測定

將2 齡初期的棉鈴蟲饑餓處理12 h，記錄饑餓處理后棉鈴蟲的體重（W0）和體長（L0）。選取長勢一致的WT、CK、pTRV2::GhSAMS棉花葉片，分別放入做好標記的帶有雙層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，每組設置3 個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿放入1片葉和1 頭饑餓處理的棉鈴蟲，將培養(yǎng)皿放置在溫度為28 ℃、光周期為16 h 光照/8 h 黑暗條件下，每天更換新鮮葉片。喂食5 d 后，測量棉鈴蟲的體重（W1）和體長（L1）。體重變化量（mg）＝W1—W0，取3 次重復的平均值；體長變化量（mm）＝L1—L0，取3 次重復的平均值。

1.7 棉鈴蟲取食偏好性觀察

在同一個培養(yǎng)盒中放入長勢一致的WT、CK、pTRV2::GhSAMS棉花葉片各3 片，在3 種葉片等距的位置放置20 頭2 齡初期棉鈴蟲使其自由取食，于24 h 和48 h 后觀察棉鈴蟲對3 種材料葉片的取食情況。共設置3 次生物學重復。

1.8 棉花葉片受害等級

選取長勢一致的WT、CK、pTRV2::GhSAMS棉花葉片，分別放入鋪有雙層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在每個培養(yǎng)皿中放入1 片葉和1 頭饑餓處理12 h 的2 齡初期棉鈴蟲，然后將培養(yǎng)皿放置在溫度28 ℃、光周期為16 h 光照/8 h 黑暗條件下培養(yǎng)5 d，每個處理進行3 次生物學重復。5 d 后觀察葉片被取食狀況，分析棉花葉片受害等級[19]。

1.9 葉片染色

細胞中的過氧化氫（hydrogen peroxide,H2O2）與二氨基聯苯胺（3,3’-diaminobenzidine,DAB）反應，形成黃褐色沉淀，通過觀察染色情況可分析組織細胞中H2O2的積累情況。分別取WT 和pTRV2::GhSAMS植株的葉片，每5 片葉放入一個燒杯中，加DAB 染液浸沒棉花葉片，用錫箔紙包裹燒杯，于室溫條件下在水平搖床上緩慢振蕩（80～100 r·min—1）過夜。將葉片取出加入無水乙醇于沸水中煮5～10 min 后，待葉綠素完全脫去，置于無水乙醇中待后續(xù)觀察[20]。

1.10 數據處理與分析

采用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析。采用鄧肯氏新復極差法（Duncan’s）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 棉鈴蟲取食下GhSAMS 的表達模式分析

為了解棉鈴蟲取食后GhSAMS基因的表達模式，對棉花植株進行蟲食脅迫處理，并利用qRT-PCR 分析目的基因的相對表達量。結果表明，GhSAMS基因受到棉鈴蟲的誘導表達。與處理0 h 相比，葉片被取食24 h、48 h 和72 h后，GhSAMS的表達量均顯著增加。其中，取食24 h 后GhSAMS的表達量最高，取食48 h 后GhSAMS的表達量較24 h 顯著降低，取食72 h 后該基因的表達量較48 h 顯著升高（圖1）。表明GhSAMS的表達受棉鈴蟲取食誘導，可能與棉花對棉鈴蟲的抗性響應有關。

圖1 GhSAMS 基因在棉鈴蟲脅迫下的表達分析Fig.1 Expression analysis of GhSAMS gene under the stress of H.armigera

2.2 GhSAMS 沉默植株的獲得

pTRV2::GhCLA1棉花植株在侵染7 d 后真葉葉脈及邊緣部分出現白化現象，到第14 天左右白化現象擴散至整個葉片，此時沉默效果最佳（圖2A）。侵染后第14 天，利用半定量RT-PCR方法檢測pTRV2::GhSAMS棉花葉片中GhSAMS基因的表達量，結果表明其表達受到明顯抑制（圖2B），說明成功獲得了GhSAMS沉默植株，可用于后續(xù)的表型鑒定。

圖2 pTRV2::GhSAMS 棉花植株表型及沉默效率檢測Fig.2 Phenotype and silencing efficiency detection of pTRV2::GhSAMS plants

2.3 GhSAMS 沉默對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響

取食5 d 后，取食WT 葉片的棉鈴蟲體重變化量顯著高于CK，二者的體長變化量無顯著差異；取食pTRV2::GhSAMS葉片的棉鈴蟲體重變化量顯著高于WT 和CK，其體長變化量較CK 顯著增加，與WT 差異不顯著（圖3）。說明棉鈴蟲在GhSAMS沉默棉株上發(fā)育更好，即抑制GhSAMS基因的表達有利于棉鈴蟲的生長發(fā)育。

圖3 不同棉花葉片對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響Fig.3 Effects of different cotton leaves on the growth and development of H.armigera

2.4 棉鈴蟲取食偏好性觀察

觀察棉鈴蟲對不同類型棉花葉片的取食偏好，24 h 后75%的棉鈴蟲（15 頭）趨向于pTRV2::GhSAMS棉花葉片，20%的棉鈴蟲（4頭）趨向于WT 棉花葉片，5%的棉鈴蟲（1 頭）趨向于CK 棉花葉片；48 h 后再觀察，pTRV2::GhSAMS棉花葉片被取食程度最大（圖4），以上結果表明棉鈴蟲更喜食GhSAMS沉默棉株葉片。

圖4 棉鈴蟲對不同葉片的取食偏好性Fig.4 Feeding preference of H.armigera to differentcotton leaves

2.5 棉花葉片受害等級分析

觀察WT、CK 和pTRV2::GhSAMS葉片被棉鈴蟲取食狀況，進行葉片受害等級分析[19]。棉鈴蟲取食5 d 后，WT、CK 和pTRV2::GhSAMS葉片的受害等級分別為2 級、3 級和4 級，說明沉默棉花GhSAMS基因后，棉花葉片受棉鈴蟲的危害程度更大（圖5）。

圖5 棉鈴蟲取食后不同棉花葉片的受害情況Fig.5 Damage profile of different cotton leaves after H.armigera attack

2.6 葉片DAB 染色分析

為探究GhSAMS基因是否通過影響ROS的產生而參與提高對棉鈴蟲的抗性，通過DAB染色觀察比較棉鈴蟲取食0 h 和24 h 的棉花葉片中的H2O2含量，結果表明，棉鈴蟲取食24 h后，與WT 相比，pTRV2::GhSAMS棉花葉片DAB 染色更深（圖6）。表明沉默GhSAMS基因會導致棉花葉片中積累更多的H2O2。此外，我們還發(fā)現，H2O2在葉柄即葉脈交匯處積累量較多。

圖6 DAB 染色分析棉花葉片的H2O2 含量Fig.6 H2O2 content in cotton leaves analyzed by DAB staining

3 討論

SAMS 催化甲硫氨酸和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）合成S- 腺苷甲硫氨酸，是植物合成乙烯和多胺等過程中的關鍵酶，與許多抗逆反應相關的次生代謝物質的合成密切相關，在植物脅迫應答中扮演著重要角色。

目前諸多研究發(fā)現SAMS基因受多種生物及非生物脅迫誘導表達。余濤等[21]在煙草中克隆了一個SAMS基因，發(fā)現其受氧化脅迫、鹽脅迫及高溫脅迫誘導表達。Gupta 等[22]研究表明白楊樹SAMS基因受高濃度CO2和O3的誘導表達。宋修鵬等[23]發(fā)現甘蔗ScSAM在黑穗病菌脅迫下上調表達。擬南芥、水稻SAMS基因在干旱脅迫下表達量升高[24]。番茄SAMl和SAM3受鹽、甘露醇和脫落酸的誘導表達[25]。本研究發(fā)現陸地棉GhSAMS基因在棉鈴蟲取食后表達量明顯升高，因此推測GhSAMS基因可能參與了抗棉鈴蟲響應。利用VIGS 技術沉默GhSAMS基因，發(fā)現基因沉默棉花植株更易受到棉鈴蟲的侵害，具體表現為：棉鈴蟲取食GhSAMS沉默棉株葉片后，其體重與體長的變化量均大于WT 和CK，棉鈴蟲更喜食GhSAMS沉默棉株葉片；GhSAMS沉默棉花葉片受棉鈴蟲的危害程度更大。綜合分析表明GhSAMS基因對棉鈴蟲的抗性起正調控作用，未來可通過轉基因過表達或基因編輯技術等進一步驗證該基因的功能。本研究僅分析了離體棉花葉片對棉鈴蟲的抗性，后續(xù)可對棉花的蕾鈴及整個植株對棉鈴蟲的抗性進行研究。此外，棉花的害蟲并非只有棉鈴蟲，還有棉花蚜蟲、煙粉虱、棉盲蝽等，GhSAMS基因是否參與對不同類型害蟲的抗性響應，后續(xù)可進行系統(tǒng)研究。

前人研究表明，H2O2信號轉導途徑除了在植物的抗病反應中起著重要作用外[26-28]，在植物抗蟲響應中亦發(fā)揮著重要作用[29]。本研究中，對棉鈴蟲取食24 h 的棉花葉片進行DAB 染色，觀察到pTRV2::GhSAMS棉花葉片組織中積累了更多的H2O2。表明沉默GhSAMS基因后，棉鈴蟲取食會誘導植株產生更多的H2O2，而H2O2的過量增加會破壞植株體內ROS 的動態(tài)平衡，從而對植物細胞的結構功能造成氧化損傷，導致pTRV2::GhSAMS棉花植株更易受到棉鈴蟲的取食侵害。

4 結論

GhSAMS基因受棉鈴蟲取食的誘導表達。利用VIGS 技術瞬時沉默GhSAMS基因導致棉花植株對棉鈴蟲的抗性降低，推測GhSAMS基因對棉鈴蟲的抗性起正調控作用。GhSAMS可作為提高棉花棉鈴蟲抗性的候選基因。