杜 艷， 梁 鋒， 李婷玉， 周文菊， 陳正行，涂兆鑫， 楊 靜， 樊梅香， 李 娟*

（1. 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫 214122；2. 青海天佑德科技投資管理集團有限公司， 青海 西寧 810016；3. 青海省青稞資源綜合利用工程技術(shù)研究中心， 青海 西寧 810016；4. 江南大學(xué)江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫 214122）

青稞為禾本科大麥屬的禾谷類作物，是青藏地區(qū)最主要的農(nóng)作物之一， 也是青藏地區(qū)人民的主糧。 青稞營養(yǎng)豐富，具有“三高兩低”的特點，即高蛋白質(zhì)、高纖維素、高維生素、低脂肪和低糖[1]。 高血壓是最常見的心腦血管疾病之一，嚴(yán)重危害人類的健康與生活。 我國現(xiàn)有高血壓患者2.5~2.7 億，且每年增加1 000 萬人[2]。 研究表明，長期食用青稞及其產(chǎn)品，具有預(yù)防高血糖、高血脂、高血壓、癌癥等作用[3]。

谷物萌發(fā)是一種有效改善和增強谷物營養(yǎng)價值的方法。 在萌發(fā)過程中，β-葡聚糖酶、淀粉酶和谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）等酶被激活， 使γ-氨基丁酸 （γ-aminobutyric acid，GABA）、多酚、黃酮等生物活性成分大量富集[4-5]。 研究表明，GABA 可用于預(yù)防和輔助治療高血壓[6-7]。此外，有研究報道，多酚、黃酮也具有良好的降血壓作用[8-9]。 作者以瓦藍(lán)青稞為原料，以β-葡聚糖、GABA、蛋白質(zhì)、淀粉、游離氨基酸、總多酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及相關(guān)酶的活力為指標(biāo)，探究萌發(fā)對青稞營養(yǎng)品質(zhì)的影響；并以心率、收縮壓、血管緊張素等為指標(biāo)考察經(jīng)過萌發(fā)處理的青稞對高血壓大鼠血壓的影響，為探求具有一定營養(yǎng)性和降血壓功效的食源性物質(zhì)提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓦藍(lán)青稞：青海天佑德科技投資管理集團有限公司產(chǎn)品；β-葡聚糖混聯(lián)檢測試劑盒： 愛爾蘭Megazyme 公司產(chǎn)品；SPF 級雄性11 周齡原發(fā)性高血壓大鼠 （spontaneously hypertensive rats，SHR，共60 只）：江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供（許可證號：SCXK （京）2018-0008）； 血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，ANGⅡ）、血管舒緩激肽（bradykinin，BK）、前列環(huán)素（prostacyclin 2，PGI2）、血管生成素2（angiogenin 2，Ang2）、一氧化 氮（nitric oxide，NO）、內(nèi)皮源性超極化因子 （endothelium -derived hyperpolarizing factor，EDHF）：南京森貝伽生物科技有限公司產(chǎn)品；蘆?。╮utin，RU）和沒食子酸（gallic acid，GA）（純度>95%），分析純試劑四氫呋喃、三乙胺、鹽酸、結(jié)晶乙酸鈉等：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-250 型恒溫恒濕箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；UV-3200 型紫外分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；KENT scientific CODA 無創(chuàng)血壓儀：美國Kent 公司產(chǎn)品；微孔分光光度計：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 青稞萌發(fā)處理 篩選適量飽滿、 完整的青稞， 用體積分?jǐn)?shù)0.5%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，然后用去離子水清洗3~4 次。 再用2 倍體積去離子水在15 ℃下浸泡10 h。 在托盤（40 cm×30 cm）底部鋪2 層紗布，均勻鋪放青稞200 g，再在上面蓋2 層濕紗布。 在15 ℃、相對濕度95%的條件下萌發(fā)培養(yǎng)，每隔6 h 噴灑去離子水100 mL[10]。 分別在萌發(fā)12、24、36、48、60、72、84、96 h 取樣，并用去離子水洗滌3 次，50 ℃滅酶處理15 min，50 ℃干燥12 h， 粉碎，過50 目篩。

1.3.2 青稞中β-葡聚糖、蛋白質(zhì)、淀粉及胚乳酶活力的測定 β-葡聚糖：按照NY/T2006—2001《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定》 中的方法測定；蛋白質(zhì)：按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)含量的測定》 中凱氏定氮法測定； 淀粉： 按照GB 5009.9—2016《食品中淀粉含量的測定》中酸水解法測定；β-葡聚糖酶： 采用β-葡聚糖酶活性測定試劑盒（K-MBGL）測定；GAD：參照白青云的方法[11]測定；α-淀粉酶：采用試劑盒法（T-AMZ200）并依據(jù)Ceralpha 方法測定；β-淀粉酶： 采用試劑盒法 （KBETA）并依據(jù)Betamyl-3 方法測定；蛋白酶：按照GB 28715—2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活性的測定》中分光光度法測定。

1.3.3 GABA 和游離氨基酸測定 供試品溶液制備[10]：稱取青稞粉1.0 g，加入適量體積分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸混勻， 再加適量體積分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸定容至25 mL， 室溫超聲提取40 min，10 000 r/min 離心10 min。 取上清液即得供試品溶液。

高效液相色譜條件[10]：色譜柱為Agilent Hypersil ODS 柱（4.0 mm×250 mm×5 μm）。流動相A（pH 7.2）為27.6 mmol/L 乙酸鈉-三乙胺-四氫呋喃溶液（體積比500.00∶0.11∶2.50）， 流動相B （pH 7.2） 為80.9 mmol/L 乙酸鈉-甲醇-乙腈溶液 （體積比1∶2∶2），流量為1.0 mL/min。 柱溫為40 ℃，檢測波長為338 nm。 梯度洗脫：0 min，體積分?jǐn)?shù)8% B；17.0 min，體積分?jǐn)?shù)50% B；20.1 min， 體積分?jǐn)?shù)100% B；24.0 min，體積分?jǐn)?shù)100% A。

衍生條件：將400 μL 供試品溶液和800 μL 衍生劑在自動衍生裝置中反應(yīng)2 min。 GABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)以干基質(zhì)量計。

1.3.4 總多酚和總黃酮測定 供試品溶液的制備：稱取青稞粉2.0 g， 加入25 mL 體積分?jǐn)?shù)70%丙酮溶液，混勻，超聲提取120 min，4 000 r/min 離心10 min，取上清液即得供試品溶液。

總多酚測定： 吸取供試品溶液25 μL 于96 孔板中，加入體積分?jǐn)?shù)10%福林酚試劑125 μL，靜置10 min， 再加入125 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5% Na2CO3溶液， 避光反應(yīng)30 min， 于波長760 nm 處測定吸光度。 以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果以mg/hg 表示[12]。

總黃酮測定： 吸取供試品溶液50 μL 于96 孔板中， 加入20 μL 0.5 mol/L NaNO2溶液， 靜置5 min， 再加入20 μL 0.3 mol/L AlCl3溶液， 靜置6 min，再加入200 μL 0.5 mol/L NaOH 溶液，混合均勻，靜置15 min，于波長510 nm 處測定其吸光度。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果以mg/hg 表示[13]。

1.3.5 輔助降血壓活性測定

1）實驗分組及飼養(yǎng)條件 根據(jù)青稞粉中GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)及人體推薦攝入量，發(fā)芽青稞（萌發(fā)48 h）的低、 中、 高劑量設(shè)為人體推薦食用量的5 倍、10倍、20 倍， 青稞組設(shè)為人體推薦攝入量的10 倍，同時設(shè)置維持飼料為對照組。 將青稞和發(fā)芽青稞添加到維持飼料中飼喂大鼠，大鼠自由采食，每2~3 d 對飼料進(jìn)行稱量。 實驗周期為30 d。 飼料添加情況見表1。

表1 實驗分組信息Table 1 Experimental grouping information

動物飼養(yǎng)管理條件： 實驗動物在溫度為20~26℃、相對濕度為40%~70%的江南大學(xué)實驗動物中心屏障設(shè)施SYXK（蘇）2016-0045 飼養(yǎng)。 飼料（輻照滅菌）由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供。

2）血壓、心率測定 SHR（180~200 g）適應(yīng)飼養(yǎng)5 d 后，多次測量其血壓，使其適應(yīng)測壓環(huán)境。 根據(jù)測壓儀的說明測定大鼠清醒和安靜狀態(tài)下的血壓和心率。 實驗開始后每周測壓1 次，每次對同一只大鼠測壓10~15 次，停止給予受試樣品之后，持續(xù)觀察7 d。3）其他指標(biāo)測定 參照試劑盒說明書測定高血 壓 大 鼠 血 清 中ANG Ⅱ、BK、PGI2、Ang2、NO 和EDHF 的質(zhì)量濃度。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 22.0 和Excel 2019 分析處理數(shù)據(jù)并用Origin 8.5 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-葡聚糖、GABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)及β-葡聚糖酶、GAD 活力變化

由圖1 可知，青稞中β-葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨萌發(fā)時間的延長而下降，其中β-葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12~48 h 降解較慢（降解量在15%內(nèi)），48 h 后降解速率加快。這可能與青稞萌發(fā)過程中胚乳糊粉層和β-葡聚糖酶合成的速度和活力有關(guān)[14]。 萌發(fā)0~60 h，β-葡聚糖酶的活力呈平緩的上升趨勢，萌發(fā)72~96 h，β-葡聚糖酶的活力急劇上升。 隨萌發(fā)時間的延長，青稞中GABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先增加后減少的趨勢，其中萌發(fā)48 h 時，GABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。 青稞在萌發(fā)期間，蛋白酶被激活，蛋白質(zhì)水解生成了谷氨酸，谷氨酸在GAD 作用下轉(zhuǎn)化為GABA[15]，故而青稞中GABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。此外，GABA 生成與消解是一個動態(tài)平衡的過程[16]，隨著GABA 的積累，GAD 活力被抑制，而GABA 轉(zhuǎn)氨酶的活力增強，使GABA轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛，最終導(dǎo)致GABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降[17-18]。 GAD 活力變化與萌發(fā)過程中GABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢一致， 表明青稞中GABA 的增加與GAD 活力呈正相關(guān)。萌發(fā)48 h 時，青稞中β-葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.46%， 降解量為11.68%，GABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.18 mg/hg， 是原料的3.47 倍， 因此，48 h較適合于青稞的萌發(fā)。

圖1 萌發(fā)過程中青稞β-葡聚糖、GABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)和β-葡聚糖酶、GAD 活力變化Fig. 1 Changes of the mass fraction of β-glucan and GABA and enzyme activities of β-glucanase and GAD during germination of highland barley

2.2 淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和淀粉酶活力變化

由圖2 可知，青稞中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨萌發(fā)時間的延長而下降。 萌發(fā)12~36 h 下降趨勢較小，48~96 h 降幅較大。 種子在萌發(fā)初期優(yōu)先利用小分子糖[19]，隨萌發(fā)時間的延長，淀粉酶相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，受到胚中赤霉素的刺激在幼胚和糊粉層中產(chǎn)生大量淀粉酶，特別是α-淀粉酶，從而將淀粉水解成可溶性糖為萌發(fā)提供能量[20-21]。 萌發(fā)前期因青稞處于休眠期，α-淀粉酶活力很小（0.53 CU/g），萌發(fā)60 h 后，α-淀粉酶的活力急劇增大。 β-淀粉酶在萌發(fā)前存在一定的活力，在萌發(fā)12~36 h 時，酶活力未發(fā)生顯著變化，36 h 后酶活力顯著增加。 可能與結(jié)合態(tài)的β-淀粉酶通過蛋白酶切割變?yōu)橛坞x態(tài)而釋放出來有關(guān)[22]。 谷物中α-淀粉酶主要在萌發(fā)期間合成，在種子萌發(fā)過程中起著關(guān)鍵作用[22]。 因此，α-淀粉酶和β-淀粉酶的活力增加均有利于促進(jìn)淀粉的降解。 為確保青稞中的淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，萌發(fā)時間不宜過長，根據(jù)β-葡聚糖和GABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)，萌發(fā)48 h 較為適宜。

圖2 萌發(fā)過程中青稞淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和淀粉酶活力的變化Fig. 2 Changes of the mass fraction of starch and enzyme activities of amylase during germination of highland barley

2.3 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蛋白酶活力的變化

由圖3 可知，青稞中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨萌發(fā)時間增加而降低，蛋白酶活力逐漸上升。 在萌發(fā)過程中蛋白質(zhì)不斷分解和合成， 在蛋白酶的激活作用下，儲存蛋白質(zhì)分解為小分子肽類和氨基酸，這些小分子肽類和氨基酸再供胚胎形成新的結(jié)構(gòu)蛋白[23]。

圖3 萌發(fā)過程中青稞蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蛋白酶活力的變化Fig. 3 Changes of the mass fraction of protein and enzyme activities of protease during germination of highland barley

2.4 游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

由表2 可知，青稞在萌發(fā)過程中，總游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨萌發(fā)時間的延長而顯著增加。 萌發(fā)后總游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加是由于萌發(fā)后蛋白酶的活力增加，降解蛋白質(zhì)和合成新酶，這些酶有助于游離氨基酸的釋放[23]。 在萌發(fā)12~96 h，除天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸外，其余氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢基本一致，在萌發(fā)12~48 h 顯著增加，48 h 后有所下降。 萌發(fā)48 h 時，7 種人體必需氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（蛋氨酸除外），纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和賴氨酸分別是原料的3.59 倍、4.65 倍、6.58 倍、3.41 倍、12.75 倍、3.75 倍和4.59 倍。 非必需氨基酸中脯氨酸、丙氨酸和酪氨酸等也顯著升高。 脯氨酸等為合成賴氨酸和其他必需氨基酸提供氮源[24]，促使必需氨基酸賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，改善了青稞的蛋白質(zhì)質(zhì)量。 各種游離氨基酸均具有特殊的營養(yǎng)功能，青稞萌發(fā)后各種游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升，表明萌發(fā)可使青稞功能性成分增加，營養(yǎng)品質(zhì)得到極大提高。

表2 青稞萌發(fā)過程中游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Table 2 Changes of the mass fraction of free amino acid during germination of highland barley

2.5 總多酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

由圖4 可知，總多酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨萌發(fā)時間的增加呈上升趨勢。 研究發(fā)現(xiàn)，種子萌發(fā)過程中水解酶的激活會降解其細(xì)胞壁，釋放游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的酚類化合物，從而使總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加[25]。 此外，在萌發(fā)過程中，可通過激活莽草酸和苯丙烷途徑重新合成酚類化合物[26]，即隨萌發(fā)時間延長，多酚氧化酶的活力降低，而蒽酰胺合成酶的活力升高，促進(jìn)了多酚類物質(zhì)的合成[26]。

圖4 青稞萌發(fā)過程中總多酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化Fig. 4 Changes of the mass fraction of total polyphenol and flavone during germination of highland barley

2.6 發(fā)芽青稞降血壓功效分析

2.6.1 發(fā)芽青稞對SHR 體質(zhì)量影響 由表3 可知，給予受試物前后，SHR 體質(zhì)量均無顯著性變化 （P>0.05）， 表明青稞和發(fā)芽青稞受試樣品對SHR 體質(zhì)量無不良影響。

表3 青稞對SHR 體質(zhì)量的影響Table 3 Effects of highland barley on the body weight of SHR

2.6.2 發(fā)芽青稞對SHR 血壓和心率的影響 由表4可知，實驗前，對照組、青稞組和發(fā)芽青稞組SHR 的收縮壓和舒張壓均無顯著差異。 飼養(yǎng)30 d 后，與對照組相比，發(fā)芽青稞高劑量組SHR 的收縮壓和舒張壓顯著降低（P<0.05），心率無顯著差異。表明高劑量發(fā)芽青稞具有降血壓作用，可能與青稞中GABA、總多酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)[6-9]。 青稞萌發(fā)后GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高， 與青稞組相比， 發(fā)芽青稞對SHR 降壓效果更顯著。

表4 青稞對高血壓模型大鼠血壓的影響Table 4 Effects of highland barley on blood pressure of SHR

2.6.3 發(fā)芽青稞對SHR 血清中ANGⅡ和BK 質(zhì)量濃度的影響 由表5 可知，與對照組相比，發(fā)芽青稞中、 高劑量組的SHR 血清中ANGⅡ質(zhì)量濃度顯著降低（P<0.05），分別下降19.75%、21.22%。 青稞組、發(fā)芽青稞低、中、高劑量組BK 質(zhì)量濃度顯著升高 （P<0.05）， 分別提高11.48%、8.82%、10.66%、12.85%，可能與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶活性降低有關(guān)[8]。ANGⅡ合成減少， 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶對BK 的降解作用減弱，血管擴張均有利于降低血壓[8]。 表明一定劑量的發(fā)芽青稞能緩解大鼠高血壓癥狀。

表5 青稞對SHR 血清中ANGⅡ和BK 質(zhì)量濃度的影響Table 5 Effects of highland barley on the mass concentration of ANGⅡand BK in serum of SHR

2.6.4 發(fā)芽青稞對SHR 血清中Ang2、PGI2、NO 和EDHF 質(zhì)量濃度的影響 Ang2 在炎癥刺激下能迅速從內(nèi)皮細(xì)胞釋放，從而引發(fā)血管效應(yīng)[27]。Fiedler 等報道，原發(fā)性高血壓患者Ang2 水平升高，其值可作為高血壓患者心血管疾病的一個預(yù)測指標(biāo)[28]。 由表6 可知，與對照組相比，發(fā)芽青稞低、中、高劑量組Ang2 水平顯著降低（P<0.05），表明發(fā)芽青稞在一定劑量下能通過降低Ang2 水平來緩解大鼠高血壓癥狀。

表6 青稞對SHR 血清中Ang2、PGI2、NO 和EDHF 質(zhì)量濃度的影響Table 6 Effects of highland barley on the mass concentration of Ang2，PGI2，NO and EDHF in serum of SHR

PGI2 是血管壁中花生四烯酸代謝的主要產(chǎn)物。PGI2 的合成與釋放會引起血管舒張并抑制血小板聚集[29]。由表6 可知，青稞組和發(fā)芽青稞低、中、高劑量組的SHR 血清中PGI2 質(zhì)量濃度顯著高于對照組（P<0.05）， 表明青稞和發(fā)芽青稞在一定劑量下可通過增加PGI2 的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮降壓功效。

NO 是一種強效的內(nèi)源性血管舒張因子， 可誘導(dǎo)血管舒張[30]。 研究報道，內(nèi)源性NO 生成減少可能是高血壓持續(xù)進(jìn)行的原因之一[31]。由表6 可知，青稞組的SHR 血清中NO 質(zhì)量濃度與對照組無明顯差異，發(fā)芽青稞低、中、高劑量組的SHR 血清中NO 質(zhì)量濃度顯著高于對照組，表明發(fā)芽青稞在一定劑量下可通過增加NO 的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮降壓功效。

在某些情況下， 內(nèi)皮功能障礙與舒張過程中EDHF 質(zhì)量濃度的降低相關(guān)，EDHF 的表達(dá)減少可導(dǎo)致血管舒張能力下降[32]。 由表6 可知，發(fā)芽青稞低、中、高劑量組的SHR 血清中EDHF 的表達(dá)顯著高于對照組（P<0.05）， 分別提高11.91%、10.91%、9.15%，血管舒張能力增強，有助于緩解SHR 高血壓癥狀。

3 結(jié) 語

青稞在萌發(fā)過程中，β-葡聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶和GAD 活力的變化， 尤其是酶活力的加強刺激了大量酶促反應(yīng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，使β-葡聚糖、淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，GABA、游離氨基酸、總多酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加， 尤其在發(fā)芽48 h時，青稞中GABA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)33.18 mg/hg，是青稞原料的3.47 倍， 即發(fā)芽提高了青稞的營養(yǎng)價值。此外， 青稞和發(fā)芽青稞都具有一定的降血壓效果，且發(fā)芽青稞的降血壓效果優(yōu)于未發(fā)芽青稞。 因此，發(fā)芽青稞在青稞保健功能食品的研究與開發(fā)方面更具發(fā)展前景。