馬紅梅， 馬臣杰， 岳 苑，3， 馬玲玲， 馬嘉琦， 曾 瑾*

（1. 寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；3. 寧夏回族自治區(qū)食品檢測研究院，寧夏 銀川 750002）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM），簡稱單增李斯特菌，是一種常見的革蘭氏陽性胞內(nèi)寄生菌。 該菌為短桿菌，大小為0.5 μm×（1.0~2.0） μm，兼性厭氧、嗜冷、不含芽孢，不形成莢膜，廣泛存在于周圍環(huán)境中[1-3]。 LM 是一種人畜共患致病菌，主要由污染的食物傳播，是世界衛(wèi)生組織列舉的四大食源性病原菌之一[4-7]。 據(jù)國家衛(wèi)健委報(bào)道，LM 導(dǎo)致的食源性疾病病例數(shù)在全國食源性病例數(shù)中占很大比例。 LM 是李斯特菌眾多類型中唯一能引起人類李斯特菌?。↙isteriosis）的主要病原體[8]，尤其容易感染孕婦、新生兒等免疫力低下的人群[9-11]。即使是低水平的食物污染也有可能導(dǎo)致局灶性感染、 細(xì)菌性敗血癥和腦膜炎以及胎兒感染，導(dǎo)致流產(chǎn)或妊娠并發(fā)癥[12-13]，甚至引起危及生命的疾病[14-15]。 據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心報(bào)道，美國每年患有李斯特菌病的人數(shù)多達(dá)2 000 人，死亡率高達(dá)30%，其致死率甚至高過其他流行性致病菌，如沙門氏菌及肉毒桿菌[16]。據(jù)報(bào)道，惡性腫瘤或器官移植患者更易患侵襲性李斯特菌病， 人類免疫缺陷病毒（HIV）陽性患者侵襲性李斯特菌病的發(fā)病率是普通人群的500~1 000 倍[17]。目前，由于其高病死率[18-19]以及高耐藥性，李斯特菌病仍是許多國家關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問題和面臨的主要挑戰(zhàn)[20-24]。

目前關(guān)于LM 的研究主要在LM 的檢測以及應(yīng)用上， 但關(guān)于LM 對(duì)機(jī)體的致病機(jī)制研究尚不明確[25-26]。 因此作者對(duì)LM（ATCC 19115）感染前后 的受體細(xì)胞RAW264.7 進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析[27]，期望從LM 感染前后的受體細(xì)胞中找到差異表達(dá)的基因和代表性的差異表達(dá)通路，從而為進(jìn)一步研究LM 的致病機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

小鼠單核巨噬白血病細(xì)胞（RAW264.7）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（ATCC 19115）：均為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 單核細(xì)胞增生李斯特菌的培養(yǎng)

將保有LM 的磁珠在腦心浸液 （brain heart infusion，BHI）固體培養(yǎng)基上劃線接種，37 ℃恒溫培養(yǎng)16~18 h 后挑單菌接至10 mL BHI 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6~0.8。吸取細(xì)菌培養(yǎng)液至無菌的1.5 mL 離心管，12 000 r/min 離心30 s 收集細(xì)菌，無菌PBS 洗滌3 次，用1 mL DMEM 完全培養(yǎng)基重懸混勻后， 測定OD600，根據(jù)需要調(diào)整菌液的濃度。

1.3 RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)及感染

RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)在由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和體積分?jǐn)?shù)10%新生小牛血清（newborn calf serum，NBCS）組成的DMEM 完全培養(yǎng)基中， 取對(duì)數(shù)期RAW264.7細(xì)胞鋪于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 每孔細(xì)胞數(shù)量為1×106個(gè)， 在37 ℃和體積分?jǐn)?shù)5%的CO2條件下過夜培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到約80%時(shí)進(jìn)行處理。 本實(shí)驗(yàn)主要分為2 組，每組進(jìn)行3 次重復(fù)，LM 感染組（MOI=10）命名為NL1、NL2 和NL3，感染時(shí)間為6 h；另外一組未處理的細(xì)胞作為對(duì)照組， 命名為NC1、NC2 和NC3。

1.4 總RNA 提取

使用Trizol 試劑（TIANGEN）提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop8000 測定RNA 濃度。 OD260/OD280在1.8~2.2 為合格樣本。

1.5 文庫構(gòu)建及測序

RNA-seq 實(shí)驗(yàn)過程涉及樣本檢測、 富集mRNA、 合成cDNA 第一條鏈和第二條鏈、 末端修復(fù)、 加A 尾和接頭、 篩選cDNA、 PCR 擴(kuò)增、 純化PCR 產(chǎn)物、建庫。文庫質(zhì)檢合格后測序，流程見圖1。

1.6 數(shù)據(jù)質(zhì)控

測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過一系列過濾、篩選以及錯(cuò)誤率檢查、GC 含量分布檢查，最后獲得clean reads[28]。 后續(xù)所有分析均為對(duì)clean reads 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析所得[29]。

1.7 差異基因篩選

使用DESeq2（Anders et al，2014）軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，分析方法基于負(fù)二項(xiàng)分布。 以P<0.05 以及|lb F|≥1.5（其中F 為fold change）為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）[30]。

1.8 差異基因富集分析

對(duì)篩選后符合標(biāo)準(zhǔn)的DEGs 進(jìn)行GO（Gene Ontology，GO） 和 KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析[31]。利用GO 對(duì)注釋到的基因功能進(jìn)行分析，利用KEGG 根據(jù)參與的通路或功能對(duì)DEGs 進(jìn)行分類和統(tǒng)計(jì)。 富集分析標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

1.9 RT-qPCR 驗(yàn)證

作者選取了11 個(gè)DEGs 對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行RTqPCR 驗(yàn)證。 對(duì)各基因擴(kuò)增結(jié)果計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，并與RNA-Seq 結(jié)果進(jìn)行比較。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)計(jì)算結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 繪圖軟件為GraphPad Prism 8， 數(shù)據(jù)結(jié)果表示為Mean±SD （P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

對(duì)LM 感染組和對(duì)照組獲得的clean reads 進(jìn)行匯總，見表1。Q20 大于95%，Q30 大于90%，表明經(jīng)LM 感染后的RAW264.7 細(xì)胞所提取的RNA 質(zhì)量良好，轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可信。

表1 樣本測序數(shù)據(jù)質(zhì)量匯總Table 1 Summary of sample sequencing data quality

2.2 樣本間相關(guān)性分析

相關(guān)性分析可用于檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)可靠性和樣本合理性， 相關(guān)系數(shù)值越接近1 代表樣本的相似度越高。 生物學(xué)重復(fù)樣品間R2一般要求大于0.8。 由圖2 可知，本研究中的3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)所收獲的細(xì)胞RNA 樣品經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序后， 樣本間相關(guān)性系數(shù)均大于0.8， 證明3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的樣本間差異不顯著，因此后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果差異分析可靠。

圖2 樣本間相關(guān)性分析熱圖Fig. 2 Heat map of correlation between samples

2.3 差異基因篩選

edgeR 軟件篩選出P<0.05 以 及| lb F |≥1.5 的DEGs（其中F 為基因表達(dá)倍數(shù)變化）。圖3 顯示，LM感染RAW264.7 細(xì)胞后，DEGs 為1 782 個(gè)，其中上調(diào)的DEGs 為989，下調(diào)的DEGs 為793，篩選結(jié)果見火山圖。 另外將DEGs 取并集后進(jìn)行分析[28]，表達(dá)相似基因均可聚類在一起，見圖4。

圖3 差異基因火山圖Fig. 3 Differential gene volcano map

圖4 差異表達(dá)基因聚類熱圖Fig.4 Clustering heat map of differentially expressed genes

2.4 差異基因GO 功能富集分析

對(duì)聚類后的DEGs 進(jìn)行GO 功能富集分析，共得到617 條GO 注釋，其中51.05%（315 條）涉及生物學(xué)過程 （BP），36.79%（227 條） 涉及分子功能（MF），12.16%（75 條） 涉及細(xì)胞組分（CC）。 圖5 為前30 條注釋結(jié)果，BP 中DEGs 顯著集中在免疫系統(tǒng)過程（immune system process）、免疫反應(yīng)（immune response）、G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通 路 （G-protein coupled receptor signaling pathway）、 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（intracellular signal transduction）、細(xì)胞程序性死亡的調(diào)控（regulation of programmed cell death）等；CC 中DEGs 顯著集中在胞外區(qū)（extracellular region） 中；MF 中DEGs 顯著集中在細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、 細(xì) 胞 因 子 受 體 結(jié) 合（cytokine receptor binding）、信號(hào)受體結(jié)合（signaling receptor binding）、 分 子 功 能 調(diào) 節(jié) （molecular function regulator）、受體調(diào)節(jié)活性（receptor regulator activity）和受體配體活性（receptor ligand activity）等。在所有注釋中，細(xì)胞因子活性最顯著。

圖5 GO 富集分析柱狀圖Fig. 5 Histogram of GO enrichment analysis

2.5 差異基因KEGG 富集分析

對(duì)DEGs 進(jìn)行KEGG 分析，DEGs 富集到了304條信號(hào)通路中，顯著性變化的有44 條（P<0.05）。 圖6 為富集的前19 條KEGG 通路[28]，DEGs 在腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、甲型流感（Influenza A）、IL-17 信 號(hào) 通 路 （IL-17 signaling pathway）、NF-κB 信號(hào)通路 （NF-kappa B signaling pathway）等信號(hào)通路顯著富集。 對(duì)顯著富集的前幾條信號(hào)通路的差異基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)， 結(jié)果見表2。KEGG 通路分析表明， 上調(diào)的基因主要集中在促炎細(xì)胞因子、趨化因子等免疫調(diào)控方面的基因，例如白介素IL-6、IL-1β、TNF、NLRP3、CC 基序趨化因子CCL2 和CCL22 等。

表2 顯著富集信號(hào)通路及其差異表達(dá)基因Table 2 Significantly enriched signaling pathways and their differentially expressed genes

圖6 前19 條富集的KEGG 信號(hào)通路散點(diǎn)圖Fig. 6 Scatter diagram of the first 19 enriched KEGG signaling pathways

2.6 RT-qPCR 驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確性，從表2 列出的通路中篩選出11 個(gè)基因（5 個(gè)上調(diào)，6 個(gè)下調(diào)）進(jìn)行驗(yàn)證，RT-qPCR 引物序列見表3，對(duì)比結(jié)果見圖7。 由圖7 可知，RT-qPCR 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序一致， 表明數(shù)據(jù)可靠。

表3 RT-qPCR 引物序列Table 3 RT-qPCR primer sequence

圖7 RT-qPCR 數(shù)據(jù)與RNA-Seq 數(shù)據(jù)比較Fig. 7 Comparison of RT-qPCR data and RNA-Seq data

3 討 論

李斯特菌病是許多國家關(guān)注的重大公共衛(wèi)生安全問題，在2017 年6 月中旬，南非曾出現(xiàn)李斯特菌病病例爆發(fā)的案例。 據(jù)美國國家傳染病研究所（NICD）報(bào)告，在1 060 個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測確認(rèn)的李斯特菌病病例中死亡人數(shù)多達(dá)216 人，通過流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 爆發(fā)的主要原因是食用了被LM 污染的即食肉制品。 通過對(duì)患者的不同分離株進(jìn)行MLST（multilocus sequence typing，MLST）分析[32]，發(fā) 現(xiàn) 來自患者的分離株中很大一部分（91%）的序列類型為6 型 （ST6）[33-35]。 Zhang 等使用脈沖場凝膠電泳（PFGE）和全基因組測序（WGS）對(duì)上海市即食肉類加工廠中的單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示在48 個(gè)送檢樣本中，有12 個(gè)樣本存在單核細(xì)胞增生李斯特菌分離株，其中ST5（1/2b）分離株占主導(dǎo)地位（83.3%，10/12）[20]。 另外，有研究團(tuán)隊(duì)對(duì)2008—2019 年來自29 個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的144 例李斯特菌病病例進(jìn)行了分析，其中包括96 例母嬰感染，33例菌血癥，13 例神經(jīng)性李斯特菌病和2 例皮膚性李斯特菌病。這些病例中，52 例感染孕婦有31 例胎兒流產(chǎn) （占59.6%），41 例新生兒患者中有4 例死亡（占9.8%），通過MLST 分析將144 株臨床分離菌株區(qū)分為23 個(gè)單獨(dú)的ST 序列類型。 分析結(jié)果顯示，最流行的ST 是ST87（49 株，占34.0%）。 此外，該研究發(fā)現(xiàn)所有單核細(xì)胞增生李斯特氏菌分離株對(duì)青霉素、氨芐青霉素和美羅培南均敏感,這也說明，導(dǎo)致臨床李斯特菌病的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌株具有基因多態(tài)性， 同時(shí)應(yīng)該警惕ST87 和ST1 型所引起的高患病率[36]。

單增李斯特菌是一種胞內(nèi)寄生菌，是動(dòng)物和人類胃腸道的暫時(shí)性寄居者[37-38]。 它能穿越包括胎盤屏障、血腦屏障、腸上皮緊密連接在內(nèi)的多種生理性屏障，能廣泛定植于各種組織器官。 LM 細(xì)胞膜表面存在2 種重要的毒力因子InlA 和InIB，在LM 中通過腸上皮屏障和胎盤屏障發(fā)揮關(guān)鍵作用[39]。 溶血素O（listeriolysinO，LLO）是LM 分泌的成孔毒素，在LM 從囊泡逃逸進(jìn)入胞漿內(nèi)的過程中發(fā)揮重要作用[40-42]。 ActA 也是LM 的胞膜表面蛋白質(zhì)，介導(dǎo)LM 在細(xì)胞內(nèi)的遷移以及在相鄰細(xì)胞和組織間的傳播[43-44]。

在胃腸道內(nèi)，先天免疫受體起著抵抗侵入性病原體的直接防御機(jī)制作用，而細(xì)菌建立感染的第一步，也是最重要的一步，就是微生物病原體可能通過毒素、RNA、DNA 作用于宿主細(xì)胞，觸發(fā)宿主細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起細(xì)胞生理和生化變化，同時(shí)宿主細(xì)胞也通過分泌某些蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫調(diào)控[45-46]。這種細(xì)菌與宿主的相互作用不僅決定了疾病的轉(zhuǎn)歸，而且對(duì)理解病原微生物的早期感染機(jī)制也具有重要意義[47-49]。

轉(zhuǎn)錄組分析在真菌及細(xì)菌的致病機(jī)理研究中應(yīng)用廣泛。 唐光甫等人利用轉(zhuǎn)錄組分析，對(duì)紅曲中桔霉素導(dǎo)致毒性的內(nèi)在機(jī)理進(jìn)行了探究[50]，發(fā)現(xiàn)桔霉素可能通過TP53、CASP3、MAPK3 和ALB 等關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)致肝腎毒性，揭示了桔霉素導(dǎo)致肝腎毒性的潛在作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為進(jìn)一步研究桔霉素致毒機(jī)理和健康防護(hù)提供理論參考。 目前還未有LM感染RAW264.7 細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜差異分析的報(bào)道。 RAW264.7 細(xì)胞是研究細(xì)菌感染的經(jīng)典細(xì)胞系[51]。為了探討RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)LM 處理后基因表達(dá)譜的變化， 用LM 感染RAW264.7 細(xì)胞6 h 后提取感染組和對(duì)照組細(xì)胞總RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。 結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，差異表達(dá)基因有1 782 個(gè)，其中上調(diào)為989， 下調(diào)為793。 對(duì)DEGs 進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析， 測序分析的結(jié)果表明DEGs 大多富集在與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路中，如腫瘤壞死因子信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、 凋亡通路和IL-17 信號(hào)通路等。 對(duì)上述通路中高表達(dá)的基因進(jìn)行研究，基因NLRP3 在LM 感染后顯著上調(diào)。 NLRP3 也稱NOD 樣受體蛋白質(zhì)3 （Nod-like receptor protein 3，NLRP3），它能結(jié)合凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）形成NLRP3 （NLR family pyrin domain containing 3，NLRP3）炎性小體。 研究表明，NLRP3 在心血管疾?。–VD）[52]、動(dòng)脈粥樣硬化[53-55]、敗血癥[56]、糖尿病腎病[57-58]、帕金森病[59]、缺血性肌肉損傷[60]等多種疾病中發(fā)揮重要作用。本課題組也對(duì)NLRP3 進(jìn)行了相關(guān)研究[61]，NLRP3 炎性小體可由雙信號(hào)模式激活，微生物或內(nèi)源性細(xì)胞因子刺激細(xì)胞， 導(dǎo)致核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的激活，NF-κB 激活后則會(huì)介導(dǎo)IL-1β 和IL-18 等重要的細(xì)胞炎性因子前體的產(chǎn)生，同時(shí)NF-κB 激活NLRP3 mRNA 的轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行翻譯及翻譯后修飾等， 此過程即稱為NLRP3 priming， 也被認(rèn)為是經(jīng)典的NLRP3 炎性小體活化中的第一信號(hào)[62-63]。 第二信號(hào)可由ATP、毒素、病毒、ROS 等識(shí)別位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的模式識(shí)別受體NLRs 激活[64-65]。 2 種信號(hào)也會(huì)共同作用，導(dǎo)致一系列嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[66-67]。 總之，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析及以上研究數(shù)據(jù)表明， 在LM 感染RAW264.7 細(xì)胞中，NLRP3 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能發(fā)揮了極其關(guān)鍵的作用。

4 結(jié) 語

通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，RAW264.7 細(xì)胞在感染LM 6 h 后差異表達(dá)基因有1 782 個(gè)， 其中上調(diào)為989，下調(diào)為793。 通過對(duì)基因注釋發(fā)現(xiàn)，DEGs 主要集中在免疫系統(tǒng)過程、免疫反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞程序性死亡的調(diào)控、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、信號(hào)受體結(jié)合、分子功能調(diào)節(jié)、受體調(diào)節(jié)活性和受體配體活性等生物學(xué)功能。 除此之外，DEGs 大多富集在與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路中， 如腫瘤壞死因子信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、凋亡通路和IL-17 信號(hào)通路等。 通過對(duì)功能基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)NLRP3 基因在LM 感染后顯著上調(diào)，這為單增李斯特菌感染RAW264.7 細(xì)胞后介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)提供了新思路， 也為進(jìn)一步研究LM 的致病機(jī)理提供思路和研究基礎(chǔ)。