車 瑩，褚彥鈞，田 笑，呂 瑩，智秀娟，仝其根

（1 北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 北京 102206 2 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室 北京 100022 3 蛋品安全生產(chǎn)與加工北京市工程研究中心 北京 100094）

醬油是我國傳統(tǒng)的釀造調(diào)味品，營養(yǎng)豐富且風(fēng)味獨(dú)特，目前釀造醬油多以大豆或者豆粕等植物蛋白為主要原料，以淀粉質(zhì)原料為輔料，經(jīng)米曲霉制曲、發(fā)酵制成[1]。原料熟制是醬油原料處理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，制曲是醬油生產(chǎn)的基礎(chǔ)[2]。成曲的品質(zhì)可以通過顏色、曲味等感官因素評定，中性蛋白酶是米曲霉生長過程中主要分泌的蛋白酶，其活力受米曲霉所利用的曲料及生長環(huán)境等影響，可作為成曲質(zhì)量評定的主要理化指標(biāo)[3]。

雞蛋主要化學(xué)組成為蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，與大豆和豆粕的主要成分相似。目前傳統(tǒng)蛋制品依然占據(jù)絕大部分市場，而發(fā)酵型蛋制品的品種相對較少，蛋制品深加工產(chǎn)業(yè)仍具有相當(dāng)大的發(fā)展空間。仿照大豆醬油的制曲工藝，以雞蛋、全蛋粉和麥麩為原料接種米曲霉進(jìn)行制曲，優(yōu)化原料熟制和制曲的工藝條件，以期為后續(xù)制作雞蛋醬油奠定基礎(chǔ)，擴(kuò)充蛋制品和醬油的種類，進(jìn)一步開拓蛋制品市場。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮雞蛋，北京德青源農(nóng)業(yè)科技股份有限公司；食用鹽，中鹽上海市鹽業(yè)有限公司；麩皮，大連正升食品有限公司；米曲霉菌粉（Aspergillus oryzae）滬釀3.042、生香酵母菌粉（Aroma-producing yeast），康源生物科技有限公司；甲醛溶液（37%）、氫氧化鈉、葡萄糖、酚酞、無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；干酪素，北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司。

研究組出院后的隨訪依從率達(dá)到了93.18%，高于常規(guī)組81.82%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳情見表3。

以此可見，“意象”范疇淵源于“易象”，“易象”與“道”相關(guān)，既有形上性和神秘性又有直觀性，所以意象也并非如通常所理解的那樣僅僅只與物象與情感相關(guān)，而同時也是與道相聯(lián)系的。這種道，在作者是一種關(guān)于世界的形上之思，在作品就是文本所呈現(xiàn)的形而上質(zhì)。作這樣的理解，才可以進(jìn)一步理解文學(xué)意象的豐富性和深邃性，以及意象作為意境構(gòu)成的基本元素這一事實(shí)。

1.2 儀器與設(shè)備

VD-650-U 潔凈工作臺，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LHS-50CL 恒溫恒濕箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；美的電炒鍋MCXZ25X2-101，廣東美的生活電器制造有限公司；QZK28-A01 嵌入式蒸汽烤箱，佛山市雷哲電器有限公司；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；LDZM-80KCS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；FlavourSpec氣相色譜離子遷移譜儀，德國G.A.S 儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熟制 新鮮雞蛋去殼均質(zhì)得到全蛋液，將全蛋液、全蛋粉和麥麩按一定比例混合均勻，采用不粘鍋低檔翻炒的方式進(jìn)行預(yù)熟制，直至原料呈固態(tài)且不黏連成坨，倒入不銹鋼烤盤中，蓋上鋁箔紙，放入蒸箱中進(jìn)行熟制。

1.3.2 制曲 將熟制后的熟料取出，冷卻至室溫，在無菌條件下接種醬油曲精，充分?jǐn)嚢枋蛊浠旌暇鶆?，蓋上2 層濕潤的無菌紗布，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，于29 ℃和一定濕度下培養(yǎng)一定時間，在制曲12 h 和制曲24 h 分別翻曲[4]1 次，即得到雞蛋曲。

1.3.3 熟制工藝的單因素實(shí)驗(yàn) 熟制的目的是使原料中的蛋白質(zhì)適當(dāng)變性、淀粉適度糊化、糖類得以分解，促使米曲霉生長，有助于提高米曲霉發(fā)酵所產(chǎn)蛋白酶、糖化酶的活力，同時對原料滅菌[4]。

1.3.3.1 熟料水分含量的影響 稱取全蛋液1 000 g，麥麩添加量為全蛋液的20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），通過改變?nèi)胺鄣奶砑恿浚?0 ℃熟制30 min 后，控制熟料的水分含量分別為45%，50%，55%，60%，65%，冷卻后接種醬油曲精（接種量為全蛋液的0.6‰），29 ℃培養(yǎng)48 h，環(huán)境濕度為80%。以熟料的消化率、成曲蛋白酶活力、孢子數(shù)以及感官品質(zhì)為指標(biāo)，選擇合適的熟料水分含量。

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗(yàn) 采用Design-Expert.V8.0.6.1 對表4 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到中性蛋白酶活力（R1）對熟料水分含量（A）、熟制溫度（B）和熟制時間（C）編碼值的二次回歸方程如下：

1.3.3.3 熟制時間的影響 制曲原料和制曲條件參照1.3.3.1 節(jié)的方法，熟制溫度控制在95 ℃，熟制時間分別為20，30，40，50，60 min，以熟料的消化率、成曲蛋白酶活力、孢子數(shù)以及感官品質(zhì)為指標(biāo)，研究最佳熟制時間。

1.3.4 熟制工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以熟料水分含量、熟制溫度和熟制時間為研究對象進(jìn)行3 因素3 水平的響應(yīng)面分析，對熟制條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.5 制曲工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化及驗(yàn)證 依據(jù)建立的模型進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳中性蛋白酶活力時三因素真實(shí)值：熟料水分含量49.394%，熟制溫度94.685 ℃，熟制時間51.553 min，此時預(yù)測中性蛋白酶活力為2 416.483 U/g 干曲?？紤]實(shí)際操作，修正為熟料水分含量50%，熟制溫度95 ℃，熟制時間52 min，重復(fù)3 次試驗(yàn)取平均值，得到成曲的中性蛋白酶活力為2 418.5 U/g 干曲，與模型預(yù)測值接近，表明該模型能良好預(yù)測實(shí)際情況，且經(jīng)感官評價得到感官評分為81.9 分。

1.3.5.2 制曲時間的影響 制曲原料和制曲條件參照1.3.5.1 節(jié)的方法，環(huán)境濕度控制在85%，制曲時間分別為40，44，48，52，56 h，以成曲的中性蛋白酶活力、糖化酶活力以及感官品質(zhì)為指標(biāo)，研究最佳制曲時間。

1.3.5.3 麥麩添加量的影響 制曲原料和制曲條件參照1.3.5.1 節(jié)的方法，制曲時間控制在52 h，麥麩的添加量分別為全蛋液的10%，20%，30%，40%，50%，以成曲的中性蛋白酶活力、糖化酶活力以及感官品質(zhì)為指標(biāo)，研究最佳麥麩添加量。

很快，她在一家網(wǎng)站上尋到了一個信息：本人出售12000個航空里程，800元。可當(dāng)面交易，也可支付寶。聯(lián)系人，程頤。下面是一串手機(jī)號和地址。粒粒瞄了一眼，荷花小區(qū)，距離自己的住處不過十站路。

2.2.1 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[13]，選擇熟料水分含量（A）、熟制溫度（B）、熟制時間（C）3 個因素作為自變量，以中性蛋白酶活力為指標(biāo)，研究雞蛋醬油的熟制工藝參數(shù)。因素編碼見表3，試驗(yàn)結(jié)果詳見表4。

1.3.6 制曲工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以環(huán)境濕度、制曲時間和麥麩添加量為研究對象進(jìn)行3 因素3 水平的響應(yīng)面分析，對制曲條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：322 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

（2）西南巴倫支海天然氣水合物的地球物理標(biāo)志主要包括BSR、空白反射帶和淺層氣體聚集異常反射等，地質(zhì)標(biāo)志主要包括麻坑地貌、氣煙囪和斷裂構(gòu)造及其他氣體滲漏構(gòu)造特征。

1.3.7 水分含量測定方法 依照GB 5009.3-2016[5]中直接干燥法測定。

1.3.8 熟料消化率測定方法 依照SB/T 10319-1999[6]測定。

1.3.9 中性蛋白酶活力測定方法 依照SB/T 10317-1999[7]中福林法測定；以凈OD 值為橫坐標(biāo)，酪氨酸質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，得到酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 測定中性蛋白酶活力的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of tyrosine for measuring neutral protease activity

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=114.81x -0.9544，R2=0.9996，酪氨酸質(zhì)量濃度在0～100 μg/mL 內(nèi)，線性關(guān)系良好。

學(xué)生自主講評試卷的模式，包括課前準(zhǔn)備、課堂研討、課后反思三個環(huán)節(jié)。課前準(zhǔn)備主要包括小組抽題、分析、討論總結(jié)、選出講題代表等；課堂研討環(huán)節(jié)包括講題、其他小組質(zhì)疑、講題小組解疑、教師點(diǎn)撥等；課后反思主要是對考題所涉及的知識點(diǎn)的反思、對答題思路的反思，特別是一些變式題的審題過程的反思等。學(xué)生要講題，首先會主動去研究考題，進(jìn)而研究考點(diǎn)。雖然有些題目講得不是很透徹，但我會及時點(diǎn)撥，這樣就收到事半功倍的效果。經(jīng)過一學(xué)年的教學(xué)實(shí)踐，我發(fā)覺學(xué)生比我還能講，對考點(diǎn)越來越清楚，答題思路也越來越清晰……

1.3.10 糖化酶活力測定方法 依照QB/T 1803-1993[8]中糖化酶部分方法測定。

馬普龍?zhí)痤^來長嘯一聲，那是在呼喚它的同伴。想要放倒面前的大塊頭僅憑它自己的力量是不夠的。用不了多久，其他馬普龍就會循著聲音聚攏到這里，一場驚心動魄的獵殺馬上就要打破這里的平靜了。

1.3.12 感官評價方法 參考GB 18186-2000[10]制定雞蛋醬油的感官評分表，由16 位（男∶女=1 ∶1）經(jīng)過感官評價技能培訓(xùn)的食品專業(yè)的同學(xué)組成感官評價小組，對雞蛋曲的氣味、米曲霉的生長狀況（詳見表1）以及雞蛋醬油的體態(tài)、色澤、香氣和滋味進(jìn)行評分（詳見表2），結(jié)果取3 次評分的平均值。

表1 雞蛋曲感官評分表Table 1 Sensory scores of egg koji

表2 雞蛋醬油感官評分表Table 2 Sensory scores of egg soy sauce

1.3.13 風(fēng)味物質(zhì)GC-IMS 測定法

1.3.13.1 頂空進(jìn)樣條件 取樣品2 g 置于20 mL頂空瓶中，80 ℃孵育15 min 后進(jìn)樣。進(jìn)樣體積200 μL；進(jìn)樣針溫度85 ℃；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。

會計(jì)電算化通俗來講就是利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行會計(jì)工作，在會計(jì)工作中應(yīng)用了電子計(jì)算機(jī)技術(shù)。具體的說，就是利用電子計(jì)算機(jī)完成會計(jì)工作過程，完成在人很難完美進(jìn)行的會計(jì)工作。以電子計(jì)算機(jī)為主，運(yùn)用當(dāng)代電子技術(shù)，運(yùn)用當(dāng)代信息技術(shù)，這是會計(jì)電算化的核心構(gòu)成，會計(jì)電算化是一個使用電子計(jì)算機(jī)為核心工具實(shí)現(xiàn)的會計(jì)工作的信息系統(tǒng)。對于自動處理數(shù)據(jù)是一大進(jìn)步，會計(jì)電算化也能改變傳統(tǒng)的手工會計(jì)信息系統(tǒng)。會計(jì)電算化是會計(jì)發(fā)展的必然結(jié)果。

1.3.13.2 GC-IMS 檢測條件 選取參數(shù)為MXTWAX，長30 m，內(nèi)徑0.53 mm，膜厚1 μm 的色譜柱，色譜柱溫度保持在60 ℃，IMS 溫度為45 ℃，分析時間50 min。載氣為高純度N2，流速為150 mL/min。電離源為氚源，電離模式為正離子模式。載氣流量：初始時設(shè)置為2 mL/min，保持2 min，之后在18 min 內(nèi)線性增至100 mL/min。每個樣品平行測定3 次。

1.3.14 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用Excel、SPSS、Design-Expert.V8.0.6.1 和OriginPro 2021 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和圖表的繪制，VOCal 和三款插件（Reporter，Gallery Plot，Dynamic PCA）分別從不同角度對樣品揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熟制工藝的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 熟料水分含量的確定 由圖2 可知，當(dāng)熟料水分含量在45%～65%時，成曲的熟料消化率隨水分含量升高而升高，熟料水分含量于65%處，消化率顯著升高至83.7%±1.1%。隨著熟料消化率的升高，成曲的中性蛋白酶活力、孢子數(shù)和感官評分均呈先升高后降低的趨勢，且均在熟料消化率為（80.7±0.9）%（水分含量50%）處達(dá)到最大值，分別為（1 371.7±24.6）U/g 干曲，（78.1±2.6）×107CFU/g和69.7±1.7。

圖2 熟料水分含量對熟料消化率、成曲中性蛋白酶活力、孢子數(shù)和感官評分的影響Fig.2 Effects of steamed material water content on digestibility of steamed material，koji neutral protease activity，spore number and sensory score

可以發(fā)現(xiàn)對于米曲霉的生長，熟料消化率水平不是越高越好。適宜的水分有利于米曲霉生長和分泌蛋白酶，水分過低會降低營養(yǎng)物質(zhì)的溶解性，不利于營養(yǎng)成分的傳遞，水分過高會損失原料的微粒結(jié)構(gòu)，降低透氣性，增加黏度[4]，使溫度難以控制，導(dǎo)致雜菌繁殖甚至產(chǎn)生氨味，影響米曲霉正常生長，降低成曲的中性蛋白酶活力、孢子數(shù)和感官品質(zhì)。綜上，熟料水分含量控制在50%左右為宜。

2.1.2 熟制溫度的確定 由圖3 可知，當(dāng)熟制溫度在85～105 ℃時，成曲的熟料消化率隨熟制溫度升高而升高，95 ℃開始趨于平緩，于105 ℃處升至（84.3±0.9）%。隨著熟料消化率的升高，成曲的中性蛋白酶活力、孢子數(shù)和感官評分均先升高后降低，中性蛋白酶活力和感官評分在消化率為（83.6±0.9）%（溫度95 ℃）時達(dá)到最大值，分別為（1 606.9±32.1）U/g 干曲和74.7±2.0，孢子數(shù)在消化率為（80.7±0.9）%（溫度90 ℃）時出現(xiàn)最大值為（80.7±3.0）×107CFU/g，與消化率為（83.6±0.9）%（溫度95 ℃）時（78.0±1.9）×107CFU/g 的差距較小。

圖3 熟制溫度對熟料消化率、成曲中性蛋白酶活力、孢子數(shù)和感官評分的影響Fig.3 Effects of steaming temperature on digestibility of steamed material，koji neutral protease activity，spore number and sensory score

這是由于適當(dāng)?shù)臒崽幚砟芷茐牡鞍踪|(zhì)的緊密結(jié)構(gòu)，暴露包裹在分子內(nèi)部的酶切位點(diǎn)，使其變成松散、柔韌的直鏈狀態(tài)，從而提高熟料消化率[11]。而熟制溫度過高會造成蛋白質(zhì)變性過度，過度變性的蛋白質(zhì)黏度大，分子結(jié)構(gòu)紊亂，水解度降低，還會產(chǎn)生一種不能被米曲霉分泌的蛋白酶分解的N 性物質(zhì)[4]，減少原料中的有效營養(yǎng)物質(zhì)，降低成曲的中性蛋白酶活力、孢子數(shù)和感官品質(zhì)。綜上，熟制溫度控制在95 ℃為宜。

2.1.3 熟制時間的確定 由圖4 可知，當(dāng)熟制時間在20～60 min 時，成曲的熟料消化率隨熟制時間延長而升高，30 min 開始趨于平緩，于60 min達(dá)到85.2%±1.0%。隨著熟料消化率的升高，成曲的中性蛋白酶活力、孢子數(shù)和感官評分均先升高后降低，且均在消化率為（85.0±0.9）%（熟制時間50 min）處達(dá)到最大值為（2 414.3±43.5）U/g 干曲，（102.9±2.1）×107CFU/g 和81.8±2.3。

圖4 熟制時間對熟料消化率、成曲中性蛋白酶活力、孢子數(shù)和感官評分的影響Fig.4 Effects of steaming time on digestibility of steamed material，koji neutral protease activity，spore number and sensory score

這種現(xiàn)象是因?yàn)槭熘茣r間過長導(dǎo)致原料變性過度，熟制過度使蛋白質(zhì)熱分解，易于被先分泌的蛋白酶水解，造成環(huán)境中氨基酸態(tài)氮含量過高，不利于米曲霉分泌蛋白酶，也會降低蛋白質(zhì)利用率[12]，導(dǎo)致成曲的中性蛋白酶活力、孢子數(shù)和感官品質(zhì)降低。綜上，熟制時間控制在50 min 左右為宜。

2.2 熟制工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

楊力生的大腦不禁嗡地一震，不覺眼前一黑，什么都看不清了。待稍一清醒，他強(qiáng)打精神說：“這樣大的事，你怎么不提前跟我說一聲呢？讓我知道，我也好給你拿個意見?！?/p>

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平編碼Table 3 Coding table of factor level for Box-Behnken

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of Box-Behnken

1.3.3.2 熟制溫度的影響 制曲原料和制曲條件參照1.3.3.1 節(jié)的方法，熟料水分含量控制在50%，熟制溫度分別為85，90，95，100，105 ℃，以熟料的消化率、成曲蛋白酶活力、孢子數(shù)以及感官品質(zhì)為指標(biāo)，研究最佳熟制溫度。

由表5 可知，中性蛋白酶活力模型的F 值為369.16，P＜0.0001，表明模型極顯著，該方程能夠很好地描述各影響因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系；失擬項(xiàng)的P 值為0.2634，大于0.05，說明該模型擬合程度較好；模型的決定系數(shù)R2=0.9909，校正R2=0.9792，說明該模型可靠性較高，且預(yù)測值與實(shí)測值之間的相關(guān)性良好；綜上得出，可用此模型對熟制工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。由F 值的大小可知，影響中性蛋白酶活力的因素主次順序依次為：熟制時間＞熟料水分含量＞熟制溫度。

表5 中性蛋白酶活力方差分析表Table 5 Variance analysis of neutral protease activity

2.2.3 回歸模型等高線及響應(yīng)面分析 響應(yīng)面和二維等高線圖可以較直觀地反映各種因素間的交互作用，響應(yīng)面圖的曲面越陡峭表明該因素對響應(yīng)值的影響越顯著，二維等高線圖呈現(xiàn)橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著。圖5 可以得出，熟料水分含量（A）、熟制溫度（B）和熟制時間（C）對中性蛋白酶活力的影響均顯著，熟制溫度與熟制時間之間交互作用明顯。

小學(xué)語文閱讀教學(xué)是當(dāng)前語文學(xué)科研究的重點(diǎn)。閱讀對提升學(xué)生語文學(xué)科學(xué)習(xí)興趣，更好地記憶和理解內(nèi)容，培養(yǎng)學(xué)生語文核心素養(yǎng)方面都有非常重要的作用，而且在閱讀中很容易引發(fā)學(xué)生情感共鳴，提升教學(xué)質(zhì)量，因此教師在教學(xué)過程中必須要充分做好語文閱讀教學(xué)工作。

1.3.11 孢子數(shù)測定方法 依照SB/T 10315-1999[9]方法測定。

圖5 熟制參數(shù)對成曲中性蛋白酶活力影響的響應(yīng)面分析Fig.5 Response surface and contour diagram of effect of steaming parameters on koji neutral protease activity

1.3.5.1 環(huán)境濕度的影響 稱取全蛋液1 000 g，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的麥麩，添加一定的全蛋粉使熟料的水分含量為50%，冷卻后接種醬油曲精（接種量為全蛋液的0.6‰），培養(yǎng)溫度為29 ℃，分別于70%，75%，80%，85%，90%的濕度條件下培養(yǎng)48 h。以成曲的中性蛋白酶活力、糖化酶活力以及感官品質(zhì)為指標(biāo)，選擇合適的環(huán)境濕度。

2.3 制曲工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 環(huán)境濕度的確定 由圖6 可知，當(dāng)制曲濕度在70%～90%時，成曲的中性蛋白酶活力、糖化酶活力和感官評分均隨環(huán)境濕度的升高，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，中性蛋白酶活力和感官評分均在濕度為85%時達(dá)到最大值，分別為（2 600.6±41.9）U/g 干曲和84.8±1.9；而糖化酶活力在濕度80%處出現(xiàn)最大值為（749.3±14.3）U/g 干曲，與濕度85%時（740.2±13.4）U/g 干曲差距較小。

圖6 環(huán)境濕度對成曲中性蛋白酶活力、糖化酶活力和感官評分的影響Fig.6 Effect of ambient humidity on koji neutral protease activity，glucoamylase activity and sensory score

這種現(xiàn)象是由于環(huán)境濕度保持在適宜的水平，可以減慢曲料水分的散失，使米曲霉一直保持較旺盛的活性，而環(huán)境濕度過高，會使曲料吸水，內(nèi)部黏連，難以通風(fēng)，抑制米曲霉的生長，容易滋生雜菌甚至變質(zhì)，從而導(dǎo)致中性蛋白酶和糖化酶活力下降。綜上，環(huán)境濕度控制在85%左右為宜。

這說明制曲時間不足，會導(dǎo)致微生物來不及充分利用原料的營養(yǎng)成分，達(dá)不到最佳的生長效果，而制曲時間過長，米曲霉進(jìn)入衰亡期，代謝能力減弱，產(chǎn)酶速率下降，同時已經(jīng)產(chǎn)生的酶不斷失活，導(dǎo)致中性蛋白酶和糖化酶的活力下降，也可能由于微生物過度繁殖，加劇了對氧氣以及曲料中營養(yǎng)成分的競爭所致。綜上，制曲時間控制在52 h 左右為宜。

圖7 制曲時間對成曲中性蛋白酶活力、糖化酶活力和感官評分的影響Fig.7 Effect of koji-making time on koji neutral protease activity，glucoamylase activity and sensory score

2.3.2 制曲時間的確定 由圖7 可知，當(dāng)制曲時間在40～56 h 時，成曲的中性蛋白酶活力和感官評分均隨制曲時間的延長，呈先升高后降低的趨勢，且均在52 h 達(dá)到最大值，分別為（2 805.8±50.6）U/g 干曲和91.7±1.8；而糖化酶活力隨制曲時間延長不斷升高，52 h 開始變平緩，56 h 升至（791.0±23.0）U/g 干曲，與52 h 時（789.3±15.8）U/g干曲差距較小。

2.3.3 麥麩添加量的確定 由圖8 可知，當(dāng)麥麩添加量在10%～50%時，成曲的中性蛋白酶活力、糖化酶活力和感官評分均隨麥麩添加量的增加，呈先升高后降低的趨勢，中性蛋白酶活力和感官評分均在30%達(dá)到最大值，分別為（2 939.2±52.9）U/g 干曲和95.3±1.9；而糖化酶活力在40%處出現(xiàn)最大值為（836.4±13.4）U/g 干曲，與30%時（819.2±19.6）U/g 干曲差距較小。

石墨礦礦石結(jié)構(gòu)主要為鱗片變晶結(jié)構(gòu)、半自形晶粒狀結(jié)構(gòu)，構(gòu)造為片狀構(gòu)造、稀疏浸染狀構(gòu)造，局部有片麻狀構(gòu)造。石墨礦礦石礦物成分比較簡單，主要為晶質(zhì)石墨，含微量的赤鐵礦、磁鐵礦、褐鐵礦、黃鐵礦、磁黃鐵礦、黃銅礦。

緊張的施焊開始了。首先由專人對焊條進(jìn)行烘干處理，先將焊條放入80攝氏度的烘箱內(nèi)預(yù)熱，以防暴溫造成藥皮斷裂，然后放入460攝氏度的烘箱內(nèi)烘干，再放入150攝氏度的恒溫箱里。焊工作業(yè)前，從中挑出藥皮完好的焊條放入隨身攜帶的保溫筒，并佩帶面罩、眼鏡，隨身攜帶鋼筋、手把式角砂輪、鋼刷、創(chuàng)錘、扁鏟、焊口檢測器等，一個個“全副武裝”，像是待命沖鋒陷陣。

圖8 麥麩添加量對中性蛋白酶活力、糖化酶活力和感官評分的影響Fig.8 Effect of wheat bran content on neutral protease activity，glucoamylase activity and sensory score

這是因?yàn)辂滬熢谥魄现兄饕鸬酵L(fēng)散熱以及保持水分的作用，添加太多會使曲料難以固定水分，且不足以提供微生物生長階段所需的營養(yǎng)成分[14]，添加太少則不利于散熱和通風(fēng)，曲料吸水變成糊狀，阻礙微生物作用，兩種情況都會降低米曲霉的產(chǎn)酶能力，導(dǎo)致中性蛋白酶活力和糖化酶活力降低。綜上，麥麩添加量控制在30%左右為宜。

2.4 制曲工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.4.1 優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[13]，選擇環(huán)境濕度（A）、制曲時間（B）、麥麩添加量（C）3 個因素作為自變量，以中性蛋白酶活力為指標(biāo)，研究雞蛋醬油的制曲工藝參數(shù)。因素編碼見表6，試驗(yàn)結(jié)果詳見表7。

表6 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平編碼Table 6 Coding table of factor level for Box-Behnken

表7 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Experimental design and results of Box-Behnken

2.4.2 回歸方程的建立與檢驗(yàn) 采用Design-Expert.V8.0.6.1 對表7 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到中性蛋白酶活力（R1）對環(huán)境濕度（A）、制曲時間（B）和麥麩添加量（C）編碼值的二次回歸方程如下：

由表8 可知，中性蛋白酶活力模型的F 值為111.90，P＜0.0001，表明模型極顯著，該方程能夠很好地描述各影響因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系；失擬項(xiàng)的P 值為0.2642，大于0.05，說明該模型擬合程度較好；模型的決定系數(shù)R2=0.9931，校正R2=0.9842，說明該模型可靠性較高，且預(yù)測值與實(shí)測值之間的相關(guān)性良好；綜上得出，可用此模型對制曲工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。由F 值的大小可知，影響中性蛋白酶活力的因素主次順序依次為：制曲時間＞麥麩添加量＞環(huán)境濕度。

表8 中性蛋白酶活力方差分析表Table 8 Variance analysis of neutral protease activity

2.4.3 回歸模型等高線及響應(yīng)面分析 由圖9 可知，環(huán)境濕度（A）、制曲時間（B）和麥麩添加量（C）對中性蛋白酶活力的影響均顯著，環(huán)境濕度與制曲時間、環(huán)境濕度與麥麩添加量之間的交互作用明顯。

圖9 制曲參數(shù)對成曲中性蛋白酶活力影響的響應(yīng)面分析Fig.9 Response surface and contour diagram of effect of koji-making parameters on koji neutral protease activity

2.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化及驗(yàn)證 依據(jù)建立的模型進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳中性蛋白酶活力時的三因素真實(shí)值：環(huán)境濕度86.443%，制曲時間53.898 h，麥麩添加量32.353%，此時預(yù)測中性蛋白酶活力為2 969.861 U/g 干曲?？紤]實(shí)際操作，修正為環(huán)境濕度86%，制曲時間54 h，麥麩添加量32%，重復(fù)3次試驗(yàn)取平均值，得到成曲的中性蛋白酶活力為2 970.3 U/g 干曲，與模型預(yù)測值接近，表明該模型能良好預(yù)測實(shí)際情況，且經(jīng)感官評價得到感官評分為94.5 分。

2.5 GC-IMS 結(jié)果與分析

2.5.1 GC-IMS 譜圖分析 分別對最佳條件下制得的雞蛋醬油和制作工藝相同的大豆醬油進(jìn)行測定，如圖10 所示，以雞蛋醬油圖譜（a 圖）為參比，扣除與雞蛋醬油圖譜中相同的信號峰得到大豆醬油圖譜（b 圖），得到二者的差異譜圖。如果二者揮發(fā)性有機(jī)物一致，則扣減后的背景為白色。

圖10 樣品的GC-IMS 譜圖（差異圖）Fig.10 GC-IMS spectrum of the samples（difference diagram）

如圖10 所示，圖10a 中紅色區(qū)域說明這些物質(zhì)的濃度在大豆醬油中較雞蛋醬油高，藍(lán)色區(qū)域說明這些物質(zhì)濃度在大豆醬油中較雞蛋醬油低，顏色越深表示差異越大。以雞蛋醬油譜圖為背景參照，大豆醬油樣本譜圖中出現(xiàn)大量紅色和藍(lán)色斑點(diǎn)，這說明兩種醬油揮發(fā)性物質(zhì)組成差異較大，大豆醬油中既有含量高于雞蛋醬油的揮發(fā)性物質(zhì)，也有含量低于雞蛋醬油的揮發(fā)性物質(zhì)。

兩種醬油中共檢測出129 種揮發(fā)性組分，定性檢出87 種VOCs，見表9，包括醇類14 種，酮類15 種，酯類16 種，醛類12 種，吡嗪類4種，酸類2 種，噻唑類2 種，呋喃類2 種，萜類1 種和含硫化合物1 種。

結(jié)合圖10 和表9 的數(shù)據(jù)得出，大豆醬油中的特征成分為仲丁醇、3-甲基-2-丁醇、桉葉油醇、丙酸異丁酯、2-甲基丁酸甲酯、乙酸丁酯、4-甲基-3-戊烯-2-酮等物質(zhì)，主要賦予了大豆醬油甜香、水果香、葡萄酒香、化學(xué)品味和薄荷味。雞蛋醬油特征成分為1-戊烯-3-醇、2-己醇、2-甲基丁醇、2-戊醇、2，3-戊二酮、3-戊酮、2-甲基丁基乙酸酯、乙酸戊酯、丙烯酸乙酯、丁酸甲酯、四氫呋喃、糠醛、己醛、反式-2-辛烯醛、丁酸等物質(zhì)，主要賦予了雞蛋醬油甜香、水果香、奶油香、酒香、焙烤香、焦糖香、青香、酸味、辛辣味和奶酪味。

不低于2.50的最優(yōu)規(guī)則為r1,r4和r6,即RS0.60,2.50(A,D)={r1, r4, r6}。

圖11 樣品的PCA 分析Fig.11 PCA analysis of the samples

3 結(jié)論

以米曲霉為菌種，原料熟制的各因素對成曲的中性蛋白酶活力均有顯著影響，主次順序?yàn)槭熘茣r間＞熟料水分含量＞熟制溫度，最佳熟制工藝條件為：熟料水分含量50%，熟制溫度95 ℃，熟制時間52 min，得到成曲的中性蛋白酶活力達(dá)到2 418.5 U/g 干曲，經(jīng)感官評價得到感官評分為81.9 分，且熟制溫度與熟制時間之間存在一定的交互作用。熟料消化率與成曲的中性蛋白酶活力的變化趨勢不總是一致的。

制曲的各因素對成曲的中性蛋白酶活力均有顯著影響，主次順序?yàn)橹魄鷷r間＞麥麩添加量＞環(huán)境濕度，最佳制曲工藝條件為：環(huán)境濕度86%，制曲時間54 h，麥麩添加量32%，得到成曲的中性蛋白酶活力達(dá)到2 970.3 U/g 干曲，經(jīng)感官評價得到感官評分為94.5 分，環(huán)境濕度與制曲時間、環(huán)境濕度與麥麩添加量之間存在一定的交互作用。

通過GC-IMS 相關(guān)數(shù)據(jù)分析，與大豆醬油相比，雞蛋醬油特征風(fēng)味成分為1-戊烯-3-醇、2-己醇、2-甲基丁醇、2-戊醇、2，3-戊二酮、3-戊酮、2-甲基丁酸甲酯、乙酸戊酯、丙烯酸乙酯、丁酸甲酯、四氫呋喃、糠醛、己醛、反式-2-辛烯醛、丁酸等物質(zhì)。PCA 分析結(jié)果顯示，雞蛋醬油和大豆醬油分布區(qū)域不重疊，表明兩種醬油風(fēng)味物質(zhì)差異較大。

試驗(yàn)結(jié)果表明采用雞蛋制作醬油曲是可行的，為后續(xù)制作雞蛋醬油打下了基礎(chǔ)，擴(kuò)充了蛋制品和醬油的種類。